Analyse par cytométrie de masse des réponses immunitaires systémiques et locales dans le carcinome hépatocellulaire

La cytométrie de masse nous permet d’analyser à la fois les réponses immunitaires systématiques et locales dans le carcinome hépatocellulaire. En profilant les cellules immunitaires au niveau de la cellule unique, nous identifions des sous-ensembles uniques et les états fonctionnels liés à la progression tumorale, offrant ainsi un aperçu des mécanismes d’évasion immunitaire et des cibles thérapeutiques potentielles pour des traitements personnalisés. Notre protocole utilise la cytométrie de masse pour analyser plus de 14 marqueurs simultanément au niveau de la cellule unique, évitant ainsi le chevauchement spectral observé dans la cytométrie en flux traditionnelle. Cela implique une identification précise des populations cellulaires réelles et fournit des données de grande dimension pour le profilage immunitaire détaillé et la découverte de biomarqueurs.

[Narrateur] Pour commencer, décongelez la cellule mononucléée du sang périphérique congelée et les suspensions de cellules d’hépatocarcinome. Après la récupération cellulaire, rémettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS sans calcium ni magnésium. Ajoutez le cisplatine à une concentration finale de 0,5 micromolaire, mélangez bien et incubez à température ambiante pendant deux minutes. Pour arrêter la réaction, centrifugez les tubes à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant, puis ajoutez un millilitre de tampon de coloration cellulaire dans chaque tube. Après avoir centrifugé à nouveau, jetez soigneusement le surnageant. Pour effectuer le blocage des récepteurs FC, préparez d’abord un mélange de blocs de 50 microlitres pour chaque échantillon, combinez 48 microlitres de tampon de coloration cellulaire avec deux microlitres de solution de blocage FC. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans le mélange de blocs et incuber. Ensuite, ajoutez 1,1 microlitre de chaque anticorps par échantillon dans un tube étiqueté pour préparer le mélange d’anticorps protéiques membranaires. Augmentez le volume à 55 microlitres avec un tampon de coloration cellulaire. Transférez 50 microlitres du mélange d’anticorps préparé dans chaque tube d’échantillon, ce qui porte le volume total à 100 microlitres. Ensuite, faites tourner doucement les échantillons pour les mélanger avant de les incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez un millilitre de tampon de coloration cellulaire dans chaque tube d’échantillon. Centrifugez à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le surnageant. Après le lavage final, mélangez brièvement le liquide restant avec la pastille de cellule pour remettre complètement les cellules en suspension. Pour la coloration des protéines du noyau, ajoutez 500 microlitres de la solution de fixation mixte aux cellules remises en suspension. Mélangez délicatement les échantillons avant de les incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, centrifuger à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Ensuite, pipetez 1000 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque tube pour laver les cellules. Ensuite, centrifugez les tubes à 1000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez 50 microlitres du mélange d’anticorps dans chaque tube après avoir jeté le surnageant. Pipetez doucement les cellules pour bien mélanger avant l’incubation. Ensuite, pipetez 1000 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque tube, centrifugez à nouveau, puis jetez le surnageant. Pour fixer les cellules, ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 1,6 % préparé dans du PBS dans chaque tube d’échantillon et vortex pour bien mélanger le contenu. Après une incubation à température ambiante pendant 10 minutes, centrifugez les échantillons et jetez le surnageant. Pour la coloration par intercalation nucléaire, diluez d’abord Cell-ID Intercalator Iridium avec un tampon de fixation et de perméabilisation. Pipeter un millilitre de la solution d’intercalation dans chaque échantillon. Mélangez doucement et vortex. Placez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit, puis centrifugez-les comme précédemment. Une fois l’incubation terminée, pipetez 1000 microlitres de tampon de coloration cellulaire dans le tube. Centrifugez les tubes à 800 G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Enfin, mettez les cellules en suspension dans 450 à 900 microlitres d’eau déminéralisée. Colorez les cellules avec du bleu trypan pour le comptage des cellules avant une analyse plus approfondie. Pour commencer, allumez le cytomètre de masse et lancez le programme. Analyser les échantillons dans le système CyTOF et acquérir les données de cytométrie de masse des cellules mononucléées du sang périphérique et des échantillons de cellules d’hépatocarcinome. Lancez le logiciel de traitement des données sur l’instrument et prétraitez la population de cellules CD45+ dans le fichier FCS. Ensuite, éliminez les cellules mortes à l’aide de la coloration de viabilité, comme l’exclusion du cisplatine. Gate la population CD45+ pour se concentrer sur les cellules immunitaires, et exportez la population fermée pour une analyse plus approfondie. Transformez les données avec un cofacteur de cinq. Ensuite, lancez le logiciel de clustering et identifiez les principaux clusters sur la base de l’algorithme SPADE, en regroupant les cellules avec des profils d’expression de marqueur similaires en clusters. Appliquez l’incorporation hiérarchique stochastique de voisinage, ou HSNE, pour la réduction de la dimensionnalité et l’identification de clusters distincts. Utilisez ensuite le package de kit CyTOF dans notre logiciel pour effectuer le re-clustering des principaux clusters. Utilisez le programme PhenoGraph pour identifier les sous-clusters avec des paramètres par défaut. Au total, 14 types de cellules distincts ont été identifiés dans les échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique. Les modèles d’expression des marqueurs pour chacun des 14 types de cellules ont été détaillés dans la carte thermique, montrant des profils d’expression uniques pour des populations cellulaires distinctes. La distribution de ces types de cellules variait d’un échantillon à l’autre, l’échantillon D présentant une proportion plus élevée de lymphocytes T CD4, les échantillons A et B montrant un enrichissement significatif en lymphocytes B, et les CD141+, cellules dendritiques conventionnelles, principalement présentes dans l’échantillon C. Huit types de cellules ont été identifiés dans les échantillons de tissus, notamment des monocytes, des lymphocytes T, des neutrophiles, des cellules tueuses naturelles, des cellules lymphocytes B, cellules dendritiques plasmacytoïdes, éosinophiles et cellules dendritiques myéloïdes. Les profils d’expression des marqueurs pour les types de cellules tissulaires indiquent des modèles distincts pour chaque population cellulaire. Les échantillons de tissus ont montré une proportion constante de types de cellules chez tous les patients, reflétant des caractéristiques immunologiques communes avec le carcinome hépatocellulaire.