Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'analyser la circulation des vésicules extracellulaires dans le sang à l'aide de deux méthodes différentes. Pour la méthode de détection des vésicules extracellulaires individuelles, le plasma pauvre en plaquettes (PPP) est d'abord isolé à partir d'un échantillon de sang.

Le PPP est ensuite coloré avec les anticorps conjugués à un fluorochrome d'intérêt. Pour la méthode de détection basée sur des billes, les vésicules extracellulaires sont incubées avec des billes, puis les vésicules liées aux billes sont colorées avec les anticorps conjugués au fluorochrome appropriés. En fin de compte, la teneur en vésicules extracellulaires circulantes peut être déterminée par l'analyse des échantillons en cytométrie en flux.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie électronique ou la séparation par billes magnétiques réside dans sa rapidité bien supérieure et sa capacité à évaluer l'ensemble de la population extracellulaire d'escal plutôt que d'être limitée à des sous-populations spécifiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la réussite de cette méthode exige un respect strict des manœuvres démontrées et des paramètres de configuration du cytomètre. Afin d'obtenir des données de haute qualité avec une variation minimale d'un jour à l'autre, commencez par centrifuger des échantillons de sang total afin de séparer le plasma du culot blanc et des globules rouges. Ensuite, transférez des aliquots de 1,2 millilitre du surnageant plasmatique dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre, en prenant soin de ne pas perturber les couches inférieures contenant le culot blanc et les globules rouges, puis centrifugez à nouveau le surnageant afin d'éliminer les plaquettes et les gros fragments cellulaires.

À la fin de la centrifugation, transférez soigneusement tout le liquide sauf les derniers 200 microlitres des échantillons de PPP dans de nouveaux tubes, en prenant soin de ne pas perturber les culots. Ensuite, mélangez le plasma plusieurs fois par aspiration et distribution, puis transférez 320 microlitres de chaque échantillon dans la rangée supérieure d'une plaque 96 puits. Pour marquer les échantillons, mélangez les anticorps d'intérêt pour chacun des trois panneaux dans des tubes individuels de filtration centrifuge de 0,22 micromètre, puis centrifugez les anticorps à l'aide d'une centrifugeuse à angle fixe et à vitesse unique.

Lorsque tout l'anticorps est passé à travers le filtre, ajoutez la quantité appropriée du mélange dans chaque puits de la plaque 96 puits comme illustré sur la figure. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour mélanger les échantillons de PPP, puis transférez 100 microlitres de chaque échantillon sur les anticorps de la deuxième rangée. Mélangez ensuite à nouveau les échantillons, changez les embouts et transférez 100 microlitres d'échantillon vers chacune des deux rangées suivantes d'anticorps selon les besoins.

Pour l'expérience, incubez la plaque à quatre degrés Celsius après 30 minutes à raison de 220 microlitres de PBS par puits, des lignes six à huit, à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique. Ensuite, à l'aide d'une pipette multicanal à largeur réglable, transférez le contenu de chaque puits vers le tube filtrant centrifuge correspondant sans changer les embouts.

Utilisez 200 microlitres de PBS provenant de l'une des lignes de lavage pour rincer les puits dont les échantillons viennent d'être retirés. Transférez ensuite la solution de rinçage vers les mêmes filtres auxquels les échantillons de PPP ont été ajoutés précédemment, puis fermez les filtres centrifuges. Une fois que tous les échantillons de PPP marqués ont été transférés avec leurs solutions de rinçage, centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse à rotor fixe.

Après la centrifugation, s'assurer qu'aucun liquide ne reste en surface des filtres. Ensuite, resuspendre les parties supérieures des filtres dans 300 microlitres de PBS et transférer le contenu resuspendu dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse cytométrique en flux immédiate. Le lavage des échantillons marqués à l'aide de filtres centrifuges améliore la séparation entre le signal de fond et les signaux positifs des marqueurs.

Il est important de noter toutefois que certaines des vésicules extracellulaires plus petites, notamment les exosomes, peuvent être perdues à travers les pores du filtre. Pour analyser les échantillons, commencez par régler les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur une échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas autorisés par le cytomètre pour chaque paramètre. Ensuite, tout en analysant un tube contenant du PBS filtré de 0,22 micromètre, ajustez ces tensions aux valeurs les plus élevées permettant d'exclure la majorité du bruit de fond. Puis, analysez un tube contenant un mélange de billes inférieures ou égales à un micromètre et tracez une fenêtre autour de la population de billes sur un graphique de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale afin de capturer tous les événements inférieurs aux billes d’un micromètre.

Réglez maintenant le débit du cytomètre sur faible et utilisez les billes pour ajuster le bouton de débit du cytomètre à la fréquence d’événements souhaitée. Ensuite, à l’aide d’un tube de particules fluorescentes arc-en-ciel diluées dans du PBS, acquérez 5 000 événements, en enregistrant les valeurs moyennes d’intensité de la diffusion directe, de la diffusion latérale et de chaque canal de couleur. Une fois tous les paramètres définis, analysez chaque échantillon pendant exactement une ou deux minutes. Après avoir terminé la première lecture pour chaque tube, ajoutez 20 microlitres de MP 40 à 10 % dans chaque échantillon, puis relisez les tubes pendant la même durée afin de permettre la soustraction des événements positifs détectés dans l’échantillon lysé sur une période équivalente.

Pour détecter les vésicules extracellulaires par capture sur billes, commencez par laver deux fois des billes de polystyrène non revêtues de six micromètres avec du milieu RPMI, puis resuspendez-les dans deux millilitres du même milieu. Ensuite, ajoutez 6 000 billes dans chaque nouvelle tube FACS : 400 microlitres de milieu dans le tube témoin négatif, et 200 microlitres de PPP ou de vésicules extracellulaires obtenues par ultracentrifugation selon le cas, ainsi que 200 microlitres de milieu dans tous les autres tubes. Ajustez le volume final de chaque tube à 400 microlitres.

Avec plus de milieu. Incuber les tubes toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Le lendemain matin, laver les billes avec deux millilitres de milieu.

Aspirez le surnageant et bloquez toute liaison non spécifique avec 400 microlitres d'albumine sérique bovine à 5 %, puis placez sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Après trois heures, lavez les billes avec deux millilitres supplémentaires de milieu et resuspendez les culots dans 100 microlitres de milieu frais. Filtrez maintenant les anticorps et ajoutez le volume approprié de cocktail d'anticorps filtré dans chaque tube, puis, après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les billes avec deux autres millilitres de milieu.

Cette fois, re-suspendez les culots dans 400 microlitres de milieu et analysez immédiatement les échantillons par cytométrie en flux, en ajustant les paramètres de diffusion avant interne au seuil le plus bas autorisé par le cytomètre en flux, comme cela vient d'être démontré. Enfin, sélectionnez la population de billes uniques et acquérez 2000 événements par échantillon. Les deux méthodes de détection, individuelle et basée sur les billes, peuvent être utilisées pour détecter la présence de vésicules extracellulaires dans les échantillons de PPP, comme illustré par ces diagrammes de dispersion. Pour le dosage de détection individuel, le témoin lysé sert à définir les fenêtres de sélection pour l'échantillon non listé correspondant.

La majorité des événements devrait se situer dans la fenêtre des vésicules extracellulaires. Par exemple, dans cette figure, ces diagrammes bivariés ont montré la détection des marqueurs CD108A et CD235A, deux marqueurs des globules rouges connus pour coexister sur les cellules. Comme prévu, plus de la moitié des événements positifs parmi les vésicules extracellulaires sont positifs pour les deux marqueurs, tandis que dans ces diagrammes bivariés, l'expression des vésicules extracellulaires pour deux marqueurs connus pour ne pas coexister sur les cellules présente des populations positives distinctes et séparées, en utilisant la méthode de détection basée sur des billes.

Aucune séparation entre les populations positives et négatives n'existe, et les événements apparaissent dans les quadrants doubles positifs, même s'ils ne se retrouvent normalement pas sur les mêmes types cellulaires, car les deux types de vésicules extracellulaires se lient à une seule perle. Par conséquent, les données obtenues avec cette méthode sont mieux analysées à l’aide d’histogrammes superposés aux données du témoin négatif, une translation apparente de l’expression du marqueur étant observée dans les échantillons fixés sur perles par rapport aux témoins. Une fois maîtrisée, cette technique permet d’analyser 12 échantillons sanguins avec trois panels d’anticorps en trois à quatre heures avec la méthode de détection individuelle, ou en un jour et demi avec la méthode par perles, si elle est correctement réalisée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à traiter chaque échantillon de manière uniforme, et de s'assurer que le débit du cytomètre et les intensités de fluorescence ont été correctement ajustés en début d'expérience pour correspondre aux paramètres expérimentaux de la journée précédente, en particulier lorsqu'on analyse plusieurs échantillons sur plusieurs jours.