Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et d’analyser la circulation des vésicules extracellulaires dans le sang par deux méthodes différentes. Pour la méthode de détection des vésicules extracellulaires individuelles. Le plasma pauvre en plaquettes ou PPP est d’abord isolé à partir d’un échantillon de sang.

Le PPP est ensuite coloré avec les anticorps conjugués au fluorochrome d’intérêt. Pour la méthode de détection basée sur les billes, les vésicules extracellulaires sont incubées avec des billes, puis les vésicules liées aux billes sont colorées avec les anticorps conjugués au fluorochrome appropriés. En fin de compte, le contenu des vésicules extracellulaires circulantes peut être déterminé par l’analyse des échantillons par cytométrie en flux.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie électronique ou la séparation des billes magnétiques est qu’elle est beaucoup plus rapide et permet d’évaluer la population totale d’escal extracellulaire plutôt que de se limiter à des sous-populations spécifiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le succès de cette méthode nécessite une stricte adhésion aux manœuvres démontrées et aux paramètres de configuration du cytomètre. Afin de produire des données de haute qualité avec un minimum de variations d’un jour à l’autre, commencez par centrifuger des échantillons de sang total pour séparer le plasma de la couche leucocytaire et des globules rouges. Ensuite, transférez des aliquotes de 1,2 millilitre du surnageant plasmatique dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre, en prenant soin de ne pas perturber les couches inférieures contenant la couche leucocytaire et les globules rouges, puis centrifugez à nouveau le surnageant pour éliminer les plaquettes et les gros fragments cellulaires.

À la fin de l’essorage, transférez soigneusement tous les échantillons de PPP, sauf les 200 derniers microlitres, dans de nouveaux tubes, en prenant soin de ne pas déranger les granulés. Ensuite, mélangez le plasma de haut en bas plusieurs fois et transférez 320 microlitres de chaque échantillon dans la rangée supérieure d’une plaque à 96 puits. Pour colorer les échantillons, combinez les anticorps d’intérêt pour chacun des trois panneaux dans des tubes filtrants centrifuges individuels de 22 micromètres à point zéro, et faites tourner les anticorps à l’aide d’une centrifugeuse à angle fixe et à vitesse unique.

Lorsque tous les anticorps ont traversé le filtre, ajoutez la quantité appropriée du mélange dans chaque puits de la plaque à 96 puits, comme illustré sur la figure. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour mélanger les échantillons PPP, puis transférez 100 microlitres de chaque échantillon dans les anticorps de la deuxième rangée. Ensuite, mélangez à nouveau les échantillons, changez les pointes et transférez 100 microlitres d’échantillon dans chacune des deux rangées d’anticorps suivantes, le cas échéant.

Pour l’expérience. Incuber la plaque à quatre degrés Celsius après 30 minutes à 220 microlitres de PBS par puits pour les ranger six à huit à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux réglable en largeur, transférez le contenu de chaque puits dans son tube filtrant centrifuge correspondant sans changer les pointes.

Utilisez 200 microlitres de PBS provenant de l’une des rangées de lavage pour rincer les puits d’où les échantillons viennent d’être retirés. Transférez ensuite la solution de rinçage dans les mêmes filtres auxquels les échantillons PPP ont été ajoutés précédemment, et fermez les filtres centrifuges. Une fois que tous les échantillons de PPP colorés ont été transférés avec leurs solutions de rinçage, faites tourner les échantillons dans une centrifugeuse à rotor fixe.

Après l’essorage, assurez-vous qu’aucun liquide ne reste sur le dessus des filtres. Ensuite, mettez en suspension le dessus des filtres dans 300 microlitres de PBS et transférez le contenu remis en suspension dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse cytométrique en flux immédiat. Le lavage des échantillons colorés à l’aide de filtres centrifuges améliore la séparation entre l’arrière-plan et les signaux marqueurs positifs.

Il est important de noter cependant que certaines des plus petites vésicules extracellulaires, y compris les exosomes, peuvent être perdues par les portes du filtre. Pour analyser les échantillons, réglez d’abord les paramètres de tension de diffusion directe et latérale sur une échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas autorisés par le cytomètre pour chaque paramètre. Ensuite, tout en faisant fonctionner un tube de 22 micromètres point zéro, le PBS filtré ajuste ces tensions aux valeurs les plus élevées qui excluent la majorité du bruit de fond. Ensuite, faites passer un tube contenant un mélange de billes d’un micromètre et moins, et tracez une porte autour de la population de billes dans un nuage de points côte à côte pour capturer tous les événements sous les billes d’un micromètre.

Réglez maintenant le débit du cytomètre sur faible et utilisez les billes pour ajuster le cadran de débit sur le cytomètre au taux d’événement souhaité. Ensuite, à l’aide d’un tube de particules fluorescentes arc-en-ciel diluées dans du PBS, on acquiert 5 000 événements, en enregistrant l’intensité moyenne des valeurs pour la diffusion latérale vers l’avant et chaque canal de couleur. Lorsque tous les paramètres sont réglés, analysez chaque échantillon pendant exactement une ou deux minutes Après la première lecture de chaque tube, mélangez 20 microlitres de 10 % de MP 40 dans chaque échantillon et relisez les tubes pendant le même laps de temps pour permettre de soustraire les événements positifs détectés dans l’échantillon lysé sur une période de temps égale.

Pour détecter les vésicules extracellulaires par capture à base de billes, commencez par laver deux fois les billes de polystyrène non revêtues de six micromètres avec un média RPMI, puis Resus dans deux millilitres du même. Ensuite, ajoutez 6 000 billes à chaque nouveau tube de télécopie, au tube de contrôle négatif à 400 microlitres de média à tous les autres tubes à 200 microlitres de PPP ou à des vésicules extracellulaires d’ultracentrifugeuse selon le cas, et 200 microlitres de média. Ajustez le volume final dans chaque tube à 400 microlitres.

Avec plus de médias. Incuber les tubes pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Le lendemain matin, lavez les perles avec deux millilitres de support.

Aspirez le surnageant et bloquez toute liaison non spécifique avec 400 microlitres d’albumine sérique bovine à 5 % en place sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Après trois heures, lavez les billes dans deux autres millilitres de média et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de milieu frais. Filtrez maintenant les anticorps et ajoutez le volume approprié de cocktail d’anticorps filtrés dans chaque tube, puis après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les billes dans deux autres millilitres de média.

Cette fois, remettez les pastilles en suspension dans 400 microlitres de milieu et analysez immédiatement les échantillons par cytométrie en flux, en ajustant les paramètres de diffusion vers l’intérieur vers l’avant au seuil le plus bas autorisé par le cytomètre en flux, comme nous venons de le démontrer. Enfin, on se concentre sur la population de billes singulet et on acquiert 2000 événements par échantillon. Les méthodes de détection individuelle et basée sur des billes peuvent être utilisées pour détecter la présence des vésicules extracellulaires dans les échantillons PPP, comme illustré par ces diagrammes à points. Pour le test de détection individuelle, le témoin lysé est utilisé pour définir les portes de l’échantillon non répertorié correspondant.

La majorité des événements doivent se situer dans la porte de la vésicule extracellulaire. Par exemple, dans cette figure, ces graphiques à deux paramètres ont montré la détection des marqueurs, CD 1 0 8 A et CD 2 35 A, qui sont deux marqueurs de globules rouges connus pour coexister sur les cellules. Comme prévu, plus de la moitié des événements positifs sur les vésicules extracellulaires sont positifs pour les deux marqueurs, tandis que dans ces tracés par paramètres, l’expression des vésicules extracellulaires de deux marqueurs connus pour ne pas coexister sur les cellules présente des populations positives distinctes et distinctes en utilisant la méthode de détection basée sur les billes.

Il n’existe pas de séparation entre les populations positives et négatives et les événements apparaissent dans les quadrants positifs doubles, même s’ils ne se trouvent normalement pas sur les mêmes types de cellules en raison du fait que les deux types de vésicules extracellulaires se lient à une seule bille. Par conséquent, les données de cette méthode sont mieux analysées à l’aide d’histogrammes superposés aux données des témoins négatifs, avec un changement apparent dans l’expression du marqueur observé dans les échantillons perlés par rapport aux témoins une fois maîtrisés. Cette technique peut être utilisée pour analyser 12 échantillons de sang avec trois panels d’anticorps en trois à quatre heures avec la méthode de détection individuelle ou en un jour et demi par la méthode des billes si elle est correctement réalisée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être cohérent dans le traitement de chaque échantillon, de s’assurer que le débit du cytomètre et les intensités fluorescentes ont été correctement ajustés au début de chaque expérience pour correspondre aux paramètres expérimentaux de la veille, en particulier lors de l’analyse de plusieurs échantillons sur plusieurs jours.