Name: Techniques pour lanalyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Apprenez deux méthodes d'analyse des vésicules extracellulaires par cytométrie en flux : détection individuelle et approche basée sur billes. Ces protocoles permettent d'isoler et quantifier les EVs circulantes dans le sang avec précision.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier Dale Hirschkorn de Blood Systems Research Institute pour son aide avec cytomètre de flux réglages de l&#39;appareil. Ce travail a été soutenu par le NIH et accorde HL095470 U01 HL072268 et contrats DoD W81XWH-10-1-0023 et W81XWH-2-0028.

REMARQUE: Les protocoles suivants ont été réalisées en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les échantillons des sujets humains ont été testés dans un conseil d&#39;examen institutionnel (IRB) -approuvé protocole et avec le consentement éclairé des sujets. 1. Méthode A: Méthode de détection individuelle 1.1) Le traitement de l&#39;échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques <ol><li> Prélever le sang du donneur / patient dans deux tubes de 10 ml en verre contenant 1,5 ml d&#39;ACD-Solution A ou un autre anticoagulant approprié et processus immédiatement (dans les 30 minutes max) en utilisant le 2-step protocole de centrifugation différentielle suivante. NOTE: Ce protocole donnera environ 10 ml de plasma pauvre en plaquettes (PPP) des combinés ~ 17 ml de sang prélevé. Si plus ou moins PPP est nécessaire, le nombre de tubes de sang collecté peut être ajustée en conséquence. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1500 g pendant 10 min à température ambiantepour séparer le plasma de la couche leucocytaire et les globules rouges. Transférer 1,2 ml aliquotes du surnageant de plasma pour 1,5 ml tubes de centrifugation, en faisant attention de ne pas déranger les couches inférieures contenant la couche leucocytaire et les globules rouges. </li><li> Tourner à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes et les grands fragments cellulaires. Transférer soigneusement le PPP, laissant derrière 200 pi pour éviter de perturber le culot et ajouter le PPP dans un nouveau tube. </li><li> À ce stade, utiliser PPP immédiatement pour l&#39;analyse ou le transfert dans aliquotes de 1,0 ml à 1,5 ml de nouveaux tubes de centrifugeuse et conserver à -80 ° C pendant jusqu&#39;à deux ans pour une analyse ultérieure (voir la figure 1A pour un aperçu). </li><li> Si VE purifiés sont nécessaires pour les expériences fonctionnelles, transfert 6 ml de PPP à un tube d&#39;ultracentrifugeuse et ajouter 28 ml de 0,2 um filtré la solution tampon phosphate (PBS). Spin pendant 60 min à 100 000 x g à la température ambiante en utilisant une ultracentrifugeuse équipé d&#39;un rotor à godet oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension EV pellaisser dans 1,5 ml de milieu. NOTE: Pour plus reproductibilité, des échantillons de sang doivent être traités de manière aussi cohérente que possible d&#39;un donneur à. Toute variation dans la méthode d&#39;isolement EV pourrait avoir une incidence significative le nombre et le type de véhicules électriques détectés. </li></ol> 1.2) Préparation des échantillons pour analyse NOTE: A partir de là, les étapes expliquer un protocole à haut débit pour l&#39;analyse de 12 échantillons pour 14 marqueurs en trois panneaux. Cependant, d&#39;autres combinaisons d&#39;anticorps peuvent être utilisés ici; le protocole peut être adapté à l&#39;étude d&#39;autres populations EV en substituant les marqueurs ont été proposées pour ceux d&#39;intérêt. <ol><li> Retirer du congélateur 12 échantillons (se il est stocké à -80 ° C) et du dégel à 37 ° C. </li><li> contenu de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Retirer 320 pi de chaque échantillon et ajouter à la rangée du haut d&#39;une plaque de 96 puits. REMARQUE: Un multi-puits pipette réglable en largeur est extrêmement utile pour cela et bien d&#39;autres étapes tout au long de l&#39;âneay, en particulier lors de l&#39;analyse de plusieurs échantillons à la fois. </li></ol> 1.3) Les échantillons coloration EV <ol><li> Avant coloration, filtrer tous les anticorps (ABS) pour éliminer les agrégats, ce qui peut provoquer des signaux positifs. <ol><li> Moissonneuses anticorps à utiliser dans chacun des trois panneaux à 0,22 um tubes filtrants centrifuges séparées et centrifugation en utilisant une centrifugeuse à angle fixe unique de vitesse (~ 750 x g) à température ambiante pendant 2 min, ou jusqu&#39;à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu&#39;aucun liquide ne reste d&#39;anticorps sur la surface du filtre. Magasin Ab cocktails dans le réfrigérateur jusqu&#39;à deux semaines, mais re-filtre à chaque fois avant de l&#39;utiliser. </li></ol></li><li> Ajouter la quantité appropriée de mélange Ab filtré pour chaque puits dans la rangée 2 (par exemple, des échantillons de Groupe I sont colorées avec 2 pi de chaque Ab, soit un total de 12 ul du cocktail Ab filtrée est ajouté par puits à la ligne 2). Reportez-vous à la figure 1B pour un aperçu de la carte de la plaque suggéré. Répétez ces pluss pour les lignes en dessous si plusieurs panneaux sont exécutés (ici, ajouter 8 pl / puits du cocktail Panel II à la ligne 3 et 11 pl / puits du cocktail Panel III à ramer 4; se référer à la liste de matériaux pour des informations spécifiques du panneau). </li><li> Utilisation de la pipette multicanaux, mélanger les échantillons de PPP dans la rangée 1 de haut en bas et de transférer 100 pi des puits dans la rangée 1 dans les puits dans la rangée 2. Mix de haut en bas. conseils de changement et de répétition, le transfert de 100 pi de la ligne 1 aux lignes 3 et 4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol> 1,4) échantillons de MT à laver <ol><li> Retirer la plaque de 96 puits de 4 ° C et le transfert au Cabinet de sécurité biologique. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 220 pi de PBS / bien rangées 6-8 (à utiliser pour le rinçage / lavage des puits contenant teinté PPP). </li><li> Transférer le contenu de chaque puits pour tubes filtrants centrifuges pré-étiquetés en utilisant le multicanal pipette réglable en largeur (Pour 12 échantillons, avec 3 panneaux d&#39;anticorps, 12 x 3 = 36 tubes de filtreêtre nécessaire). En utilisant les mêmes conseils, retirer 200 pi de PBS à partir des lignes de lavage et ajouter aux puits correspondants à partir de laquelle PPP a été juste enlevé. </li><li> Mélanger haut et bas pour rincer les puits et transférer la solution de rinçage pour les mêmes filtres à laquelle le PPP a déjà été ajouté. Fermer sommets des filtres centrifuges. Changer conseils. </li><li> Répétez ce processus avec les échantillons colorés restants jusqu&#39;à ce que tous les échantillons PPP colorées ont été transférés avec leurs solutions de rinçage à filtres centrifuges. </li><li> Transférer les filtres centrifuges à rotor d&#39;une centrifugeuse de filage fixe et à 850 g pendant 3 minutes à température ambiante. REMARQUE: Veiller à ce qu&#39;aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme &quot;sec&quot; sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons PPP peuvent nécessiter un temps de centrifugation plus à se déplacer efficacement à travers le filtre. </li><li> Retirer les tubes de filtre centrifuge et revenir à l&#39;enceinte de sécurité biologique.En utilisant la pipette à canaux multiples, remettre en suspension les sommets des filtres dans 300 ul de PBS. Transférer le contenu remises en suspension dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse immédiate FCM. NOTE: Il est très important de garder la force et le nombre de dépressions pipette à piston cohérentes parmi les échantillons pour éviter la variation échantillon à échantillon. Ce devrait idéalement être fait en utilisant une pipette électronique qui a été programmé pour pipette de haut en bas un volume spécifique (par exemple, 280 pi) d&#39;un nombre exact de fois (par exemple, 8 fois) pour chaque échantillon. </li></ol> 1.5) la configuration du cytomètre <ol><li> Ouvrez le logiciel FCM. Avant d&#39;expérimenter l&#39;installation, effectuer l&#39;étalonnage de l&#39;instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l&#39;appareil (en suivant les instructions du fabricant). </li><li> Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d&#39;un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit: <ol><li> Ajouter deux gouttes de perles de compensation de prétubes marqué au (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d&#39;anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Utilisation du cytomètre de flux logiciel fourni avec l&#39;appareil, exécutez chaque tube de compensation et de régler les tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle de 5 log-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, et d&#39;ajuster les paramètres de tensions fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Expérience&quot;, puis sélectionnez «Rémunération», puis sélectionnez «Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons. </li></ol></li><li&gt; Régler la diffusion vers l&#39;avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) paramètres de tension à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque. </li><li> Lors de l&#39;exécution d&#39;un tube de 0,22 um filtré PBS, régler les tensions FSC et SSC aux valeurs les plus élevées qui excluent la majorité du bruit de fond (ce est à dire, juste en dessous du seuil de tension à laquelle le taux d&#39;événements dépasse 5 événements / sec). </li><li> Ensuite, exécutez un tube contenant 0,2 um - 1,0 um perles, dilué dans du PBS si nécessaire. Dans un complot FCS vs SSC, dessiner une grille autour de la population de billes pour capturer les événements entre 0,2 um et 1,0 um. Alternativement, dans un histogramme SSC-H, dessiner une porte d&#39;inclure tous les événements plus petits que les 1,0 um perles. </li><li> Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min). En utilisant le tube de perles (ou autre tube contenant une concentration connue de perles) régler le cadran de débit sur le cytomètre jusqu&#39;à la veillent taux atteint environ 200 événements / sec. Lire tous les tubes échantillons au même débit et utiliser la même concentration de billes dans des expériences futures pour se assurer que les débits restent cohérents entre les courses. </li><li> Exécutez un tube de particules fluorescentes arc dilué dans du PBS. Acquérir 5000 événements. Notez les valeurs d&#39;intensité moyenne pour FSC, SSC, et chaque canal de couleur. Utilisez ces valeurs pour ajuster les tensions dans les expériences futures à assurer que les intensités de fluorescence restent cohérents entre les expériences. </li></ol> 1,6) lecture de l&#39;échantillon <ol><li> Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min) et tester chaque échantillon pendant exactement 1 ou 2 min. </li><li> Après la première lecture, ajouter 20 ul de 10% de NP-40 à chaque échantillon, une pipette de haut en bas, et pour relire la même quantité de temps (soit une ou deux minutes) pour permettre la soustraction d&#39;événements positifs détectés dans l&#39;échantillon lysées sur un laps de temps égal. NOTE: Il est extrêmement important que les échantillons soient mélangés à l&#39;aide d&#39;une pipette plutôt que d&#39;un vortex. Dans notre expérience, vortex peut causer l&#39;auto-agrégation de certains anticorps, conduisant à des événements positifs EV-imitant. </li><li> Une fois que tous les échantillons ont été lus, l&#39;exportation de tous les fichiers .fcs dans un fichier séparé pour être utilisé pour l&#39;analyse en outre l&#39;utilisation des logiciels d&#39;analyse de la FCM. </li></ol> 1.7) Analyse de données <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse de la FCM. Importer tous les fichiers de .fcs dans un nouveau fichier de l&#39;expérience. </li><li> Ouvrez le perles seule tube. Dans le FSC-A vs SSC-Un complot, dessiner une grille autour de toutes les perles de taille entre 0,2 um et 1,0 um. Ce est la porte d&#39;EV. Faites glisser pour ajouter à tous les échantillons. </li><li> En utilisant les échantillons lysées comme témoins négatifs, dessiner portes au bord de la fluorescence de fond dans chaque canal de fluorescence utilisé. Faites glisser portes fluorescents dans la porte EV de chaque échantillon non-lysées correspondant. NOTE: A ce stade, il est également utile d&#39;examiner fluorescentes deux parcelles bi-paramètres. formes de fuséele quadrant double positif (voir figure 8), en particulier si les marqueurs sont connus pour se trouver sur les types de cellules non liées, peuvent être le signe d&#39;artefact à partir de l&#39;agrégation ou d&#39;autres événements imitant des vésicules. </li><li> Pour chaque marqueur fluorescent, soustraire le nombre d&#39;événements dans l&#39;échantillon lysé du nombre d&#39;événements dans l&#39;échantillon non-lysées. Eventuellement, diviser ce nombre par le nombre total de véhicules électriques au sein de la grille non-lysées EV pour obtenir% des valeurs positives. </li></ol> 2. Méthode B: Méthode Perles 2.1) Le traitement de l&#39;échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques <ol><li> Reportez-vous à la méthode de traitement du sang décrit dans la méthode A (article 1.1). </li></ol> 2.2) Préparation des échantillons pour analyse <ol><li> Si vous le souhaitez, fractionner PPP ou EVS ultracentrifugés en exosomes et microvésicules. Ajouter 250 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés à 0,22 um filtres centrifuges et transfert à une centrifugeuse à rotor fixe et tournent à 750 xg pendant 2 minutes à température ambiante. REMARQUE: Veiller à ce qu&#39;aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme &quot;sec&quot; sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons peuvent nécessiter un temps de centrifugation légèrement plus longue pour le fluide de se déplacer de manière efficace à travers le filtre. </li><li> Lavez non couchés 6 um billes de polystyrène (par exemple, perles négatifs ABC) 2x avec les médias RPMI, et remettre en suspension dans 2 ml. Ajouter 6000 perles à chaque tube FACS. Pour le tube de contrôle négatif, ajouter 400 ul de milieu RPMI seul à billes. Pour tous les autres tubes, ajouter 200 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés (ou de leurs fractions) et 200 pi de milieu RPMI. </li><li> Ajuster le volume final de tous les tubes avec 400 ul de médias et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Le lendemain matin, lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer le surnageant. </li><li> Bloquer avec 5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans un milieu (400 ul) pendant 3 heures à 4 &amp;# 176; C sur un agitateur. </li><li> Lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer et remettre en suspension le culot dans 100 pl de milieu. </li></ol> 2.3) Les échantillons coloration EV <ol><li> Filtrer tous les anticorps. Utiliser les mêmes panneaux anticorps utilisé dans la méthode A, ou si on le souhaite, de créer une combinaison différente d&#39;anticorps aussi longtemps que leurs fluorochromes sont compatibles entre eux. </li><li> Mélanger tous les anticorps à utiliser dans un seul panneau dans un tube de filtre centrifuge de 0,22 um. Centrifugeuse utilisant une centrifugeuse à angle fixe à une seule vitesse pendant 2 minutes ou jusqu&#39;à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu&#39;aucun liquide ne reste d&#39;anticorps sur la surface du filtre. </li><li> Ajouter le volume approprié de cocktail d&#39;anticorps filtré à tous les tubes et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Lavez perles avec 2 ml de médias, remettre en suspension dans 400 pi de milieu et l&#39;exécuter immédiatement (ou dans la même journée) sur cytomètre de flux. </li></ol> 2.4) cytomètre installation et lecture d&#39;échantillon<ol><li> Ouvrez le logiciel FCM. Avant d&#39;expérimenter l&#39;installation, effectuer l&#39;étalonnage de l&#39;instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l&#39;appareil (en suivant les instructions du fabricant). </li><li> Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d&#39;un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit: <ol><li> Ajouter deux gouttes de perles de compensation à des tubes pré-étiquetés (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d&#39;anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Utilisation du logiciel de la FCM, exécutez chaque tube de compensation et ajuster tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle logarithmique 5-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, etajuster les tensions de paramètres fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Expérience&quot;, puis &quot;rémunération&quot;, puis &quot;Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons. </li></ol></li><li> Changez le FSC et les paramètres de tension SSC à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque. </li><li> Échantillons terme, porte sur la population des perles de singlet et acquièrent 2000 événements dans cette porte. Les dossiers de l&#39;exportation. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;analyse de la FCM pour analyser .fcs fichiers. Porte sur des billes de singlet. Calculer l&#39;intensité de fluorescence moyenne géométrique (IMF) pour chaque fluorochrome et comparer avec l&#39;IMF du contrôle négatif. </li></ol>

<ol><li>Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+platelet-derived+microparticle+formation--and+possible+side+effects-with+prestorage+leukofiltration+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+Protagonists+of+a+Novel+Communication+Network+for+Intercellular+Information+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange.</a> Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributing+role+of+extracellular+vesicles+on+vascular+endothelium+haemostatic+balance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Released+by+Melanoma+Cells+Prepare+Sentinel+Lymph+Nodes+for+Tumor+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis.</a> Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).</li>
<li>Gatti, S., Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles%3A+square+the+circle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles: square the circle.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 23(2013).</li>
<li>Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+to+understanding+microparticles%3A+standardized+isolation+and+identification+of+plasma+membrane-derived+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles.</a> Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).</li>
<li>Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+microparticles%3A+Pitfalls+and+protocol+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications.</a> Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).</li>
<li>Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry%3A+influence+of+centrifugation%2C+filtration+of+buffer%2C+and+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Lacroix, R., Judicone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination%3A+results+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis+SSC+Collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li>
<li>Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+issues+in+the+measurement+of+circulating+microparticles%3A+current+recommendations+and+pending+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).</li>
<li>Peramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Characterization+of+Mouse+Deep+Vein+Thrombosis+Derived+Microparticles+by+Differential+Filtration+with+Nanopore+Filters%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters.</a> Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+research%22%5BJournal%5D)">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Miguet, L., Béchade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li>
<li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li>
<li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li>
<li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li>
<li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+And+Haemostasis%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>György, B., Szabó, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+%28Cell-Derived+Microparticle%29+Signatures+in+Joint+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726(2012).</li>
<li>György, B., Módos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li>
<li>György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response%3A+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li>
<li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles%3A+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li>
<li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V%2C+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li>
<li>Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+And+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A.+77+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Deux protocoles différents pour l&#39;isolement, le traitement et l&#39;analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l&#39;échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d&#39;intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l&#39;acquisition doit être considéré au moment de choisir la méthode ...

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d&#39;intérêt. Méthodes d&#39;analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n&#39;y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d&#39;analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d&#39;anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes. VE, aussi connu comme microparticules, sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques 1. À travers l&#39;expression de différents marqueurs de surface et / ou le transfert direct de matériel biologique, les véhicules électriques sont en mesure de modifier la fonction des cellules réceptrices de jouer soit l&#39;activation ou la suppression de rôles dans la communication intercellulaire 2-4. VE, dérivées des plaquettes cliniquement sont connus pour avoir une forte activité anticoagulante 5, tandis que d&#39;autres ont été montrés pour contribuer à une large gamme de conditions, de la promotion tumorale metasta6 sis à protéger contre la maladie 7. VE peuvent être classés en catégories plus petites vésicules de dérivés de cellules tels que les exosomes et microvésicules (MV), en fonction de leur taille et le mécanisme de génération 8. La nomenclature des sous-populations de vésicules dérivées de cellules continue d&#39;être un sujet de débat en cours 8,9, cependant, les exosomes sont généralement décrits comme petite, de 40 à 100 nm particules provenant de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique, tandis que MV sont plus de 100 à 1000 des particules nm formés par l&#39;excrétion de la membrane plasmique 10. Ici, le terme général &quot;VE&quot; sera utilisé pour désigner tous les types de vésicules biologiques extracellulaires libérés par les cellules. Isolement des véhicules électriques à partir de sang entier est une procédure en plusieurs étapes et de nombreuses variables différentes de traitement se sont révélés affecter le contenu EV, y compris la température et la durée de stockage 11,12, anticoagulant / conservateur utilisé 13 etméthode de centrifugation utilisée 14. Un besoin de standardisation de ces variables a abouti à des recommandations de la Société internationale de thrombose et de traitement du sang et d&#39;isolement EV procédures du Comité de normalisation (ISTH SSC) pour le bon Hémostase scientifiques et 15,16, mais il ne existe aucun consensus parmi les chercheurs sur le protocole optimal à utiliser 12. La plupart conviennent, cependant, que les variables pré-analytiques étroitement contrôlées sont cruciales pour les données précises et reproductibles. Afin d&#39;analyser les véhicules électriques, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes, y compris la microscopie électronique à transmission 17, la microscopie électronique à balayage 18,19, microscopie à force atomique, la lumière diffusion dynamique de 20,21 et 22,23 western blot. Alors que la FCM est la méthode de choix pour de nombreux chercheurs 9,24 - 26 en raison de ses capacités à haut débit, analyse des véhicules électriques en utilisant la FCM a éténotoirement difficile en raison de leur taille et le manque de populations positifs discrets 27-32. Par rapport à l&#39;analyse des cellules, la petite taille des résultats de SVE en 1) moins de fluorescence émise en raison du nombre inférieur d&#39;antigènes par particule et 2) la faisabilité limitée de post-tache lavage, ce qui est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond. Défis communs entre les chercheurs comprennent signaux issus agrégats d&#39;immunoglobulines 27,28 et auto-agrégation des anticorps 29. En outre, les longs délais de traitement et procédures de lavage / d&#39;isolement de longs utilisés par un grand nombre de protocoles actuels 33,34 nécessitent des engagements de temps de plusieurs jours pour analyser un petit nombre d&#39;échantillons, ce qui les rend moins idéal pour les applications à haut débit. Certains chercheurs renoncent à une étape de lavage tout à fait, rendant traditionnellement utilisés contrôles négatifs FCM telles que la fluorescence moins un (FMO) et isotypes d&#39;anticorps inutile pour évaluer précisément bacfluorescence kground 30. Nos protocoles portent sur trois problèmes communs qui peuvent entraver l&#39;analyse de la FCM correcte des véhicules électriques: signaux issus des agrégats d&#39;anticorps et d&#39;autres non-vésicules, de la difficulté à éliminer l&#39;anticorps non lié, et le manque de populations positifs perceptibles. Les techniques décrites ici seront utiles pour éliminer les agrégats d&#39;anticorps on trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-sur-bruit, et la mise en portes de façon rationnelle qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Deux méthodes de détection différentes sont présentés ici: le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur des perles-de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

<table><tbody><tr><td>Cytomètre en flux de paillasse LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm bleu, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet et 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rouge)</td></tr><tr><td>Logiciel FACS Diva&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Version PC 6.0</td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo&nbsp ;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac version 9.6.1 ou PC version 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Les particules fluorescentes</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td><td>utilisées pour ajuster toutes les tensions de canal afin de maintenir la cohérence de l’intensité de fluorescence.</td></tr><tr><td>Particules fluorescentes Ultra Rainbow</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>utilisé en plus des billes Megamix-Plus SSC pour assurer la cohérence de la porte EV d’un lot à l’autre</td></tr><tr><td>Perles Megmix-Plus SSC</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>utilisées pour ajuster les tensions FSC et SSC afin de maintenir la cohérence entre les cycles. Peut également être utilisé pour surveiller le débit et ajuster le débit afin de s’assurer que le même débit est utilisé dans tous les cycles</td></tr><tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>utilisé pour les contrôles de compensation et les billes AbC négatives utilisées pour la méthode basée sur les billes</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>Santa Cruz&nbsp ;</td><td>SC-281108</td><td>Utilisé dans la méthode de détection individuelle uniquement pour lyser des échantillons après la lecture initiale afin de les utiliser comme témoins négatifs. Le bouillon peut être dilué à 1:10 dans du PBS et conservé au réfrigérateur jusqu’à 1 mois.</td></tr><tr><td>BD TruCOUNT Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td>utilisé chaque fois que des concentrations absolues de VE sont nécessaires</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0,22 & micro ; m Unités de filtration centrifuge</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td>UFC30GVNB</td><td>utilisé pour le lavage post-coloration des Evs et/ou le fractionnement des EV en fonction de la taille</td></tr><tr><td>Tubes de sang entier en verre Vacutainer ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Facs 12x75 polystène</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Réservoirs emballés individuellement.</td><td>Phenix</td><td>RR-50-1s Pointes</td><td></td></tr><tr><td>de pipette Green-Pak - 10 & micro ; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10S Pointes</td><td></td></tr><tr><td>de pipette Green-Pak -200 & micro ; l&nbsp ;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Vert -Pak pointes de pipette - 1 000 & micro ; l&nbsp ;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stable Stack L300 pointes préstérilisées</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp ;XLS 8 Canaux LTS&nbsp ; Réglable&nbsp ; Entretoise&nbsp ;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS Plaques de culture tissulaire</td><td></td></tr><tr><td>96 puits</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Milieux (sans Hepes)</td><td>Installation de culture cellulaire UCSF</td><td>CCFAE001</td><td>milieux utilisés pour la méthode de détection à base</td></tr><tr><td>de billes Dulbeccos PBS D-PBS, sans CaMg, 0,2 & micro ; m filtré</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>Tube ultracentrifuge, paroi mince, ultra-transparent</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &micro ; l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>PANEL III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 & micro ; l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa ;</td><td>Biolégende</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d&#39;intérêt. Méthodes d&#39;analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n&#39;y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d&#39;analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d&#39;anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

<html> La figure 1 présente le schéma général de traitement pour l&#39;isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. Détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l&#39;analyse de grands véhicules électriques mais la plupart des cytomètres sont pas capables de détecter individuellement des particules aussi petites que les exosomes. Une approche basée bourrelet permet aux petits v...

De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l&#39;aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.

Techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'analyser la circulation des vésicules extracellulaires dans le sang à l'aide de deux méthodes différentes. Pour la méthode de détection des vésicules extracellulaires individuelles, le plasma pauvre en plaquettes (PPP) est d'abord isolé à partir d'un échantillon de sang.Le PPP est ensuite coloré avec les anticorps conjugués à un fluorochrome d'intérêt. Pour la méthode de détection basée sur des billes, les vésicules extracellulaires sont incubées avec des billes, puis les vésicules liées aux billes sont colorées avec les anticorps conjugués au fluorochrome appropriés. En fin de compte, la teneur en vésicules extracellulaires circulantes peut être déterminée par l'analyse des échantillons en cytométrie en flux.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie électronique ou la séparation par billes magnétiques réside dans sa rapidité bien supérieure et sa capacité à évaluer l'ensemble de la population extracellulaire d'escal plutôt que d'être limitée à des sous-populations spécifiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la ré

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo démontre l’immunocapture des vésicules extracellulaires à l’aide de conjugués anticorps-nanoparticules magnétiques marqués par fluorescence. Le processus implique une formation complexe, une coloration avec des anticorps de détection marqués par fluorescence, une séparation magnétique et une analyse cytométrique en flux pour la caractérisation antigénique.

Immunocapture et cytométrie en flux de vésicules extracellulaires pour la caractérisation antigénique

Les virus ou vésicules extracellulaires ont été immunocapturés avec des nanoparticules magnétiques de 15 nm couplées à des anticorps reconnaissant les antigènes de surface. Les virions ou vésicules capturés ont été marqués avec des anticorps fluorescents contre d’autres antigènes de surface. Les complexes résultants ont été séparés dans un champ magnétique élevé et analysés avec des cytomètres en flux conventionnels déclenchés en fluorescence.

Débit Virometry pour l&#39;analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail complet pour isolation rapide des vésicules extracellulaires du sang humain et de la caractérisation des marqueurs spécifiques par analyse de suivi des nanoparticules axée sur la fluorescence. Les résultats présentés montrent une reproductibilité élevée et peuvent être ajustées pour les surnageants de culture cellulaire.

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

La dernière génération d’outils de caractérisation des véhicules électriques est capable d’analyser simultanément plusieurs paramètres uniques. La cytométrie en nanoflux mesure toutes les particules biologiques de plus de 45 nm sans marquage et identifie les caractéristiques spécifiques des sous-populations par diverses techniques de marquage fluorescent.

Caractérisation de la protéine transmembranaire d’une vésicule extracellulaire unique par cytométrie nano-flux

Ce protocole fournit une méthode d’isolation rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant la taille de la buse de pulvérisation d’air, la pression du fluide de gaine, la pression d’écoulement de l’échantillon, la tension, le gain et les paramètres de seuil de déclenchement.

Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Nous décrivons ici un protocole simple qui permet d’évaluer in vitro l’abondance des microARN marqués par fluorescence afin d’étudier la dynamique de l’emballage et de l’exportation des microARN dans les vésicules extracellulaires (VE).

Suivi de la libération de miARN dans les vésicules extracellulaires à l’aide de la cytométrie en flux

Ici, nous démontrons la méthode de caractérisation des vésicules extracellulaires (VE) collectées à partir de fluides biologiques, tels que les larmes et la salive, de sujets humains. Le scanner utilisé dans cette méthode est capable de détecter le phénotype, la taille et le nombre total de particules des VE à partir de 1 μL de l’échantillon.

Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

L'utilisation réussie des colorants cellulaires de suivi pour surveiller la fonction des cellules immunitaires et la prolifération implique plusieurs étapes cruciales. Nous décrivons des méthodes pour: 1) l'obtention brillante et uniforme, reproductible étiquette-ment avec des colorants membrane; 2) la sélection des fluorochromes et les conditions d'acquisition de données, et 3) le choix d'un modèle pour quantifier la prolifération cellulaire basée sur dilution de colorant.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Apprenez deux méthodes d'analyse des vésicules extracellulaires par cytométrie en flux : détection individuelle et approche basée sur billes. Ces protocoles permettent d'isoler et quantifier les EVs circulantes dans le sang avec précision.

Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Explorer plus de vidéos