Name: Préparation déchantillons pour lanalyse de masse Cytométrie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons pour la cytométrie de masse afin d'analyser des populations cellulaires hétérogènes. Cette méthode permet d'obtenir un marquage anticorpique cohérent pour l'étude de l'identité cellulaire et de la signalisation.

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Le travail dans le laboratoire Barton a été soutenu par une subvention de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas (CPRIT RP110471). Cette recherche a été financée en partie par une bourse de formation pour Ryan L. McCarthy du National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. La plateforme qui entretient et exploite l’appareil de cytométrie de masse est financée par une subvention du CPRIT (RP121010) et une subvention de base du NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès pour le traitement de diverses lignées cellulaires en culture (H1 et H9 CSEh, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) et des échantillons de tissus primaires (moelle osseuse de la souris, la souris foie embryonnaire, adultes de souris foie, une tumeur de la souris). Quelle que soit la source, tout tissu qui peut être dissociées en cellules individuelles tout en préservant l&#39;état cellulaire devrait être prête à l&#39;analyse par cytométrie de masse, mais peut néce...

Cytometry permet la mesure simultanée de plusieurs cibles d&#39;anticorps au niveau de la cellule unique sur de grandes populations de cellules. En cytométrie de flux à base de fluorescence classique, le nombre de paramètres qui peuvent être quantifiés est limitée par le chevauchement spectral entre le spectre d&#39;émission de multiples fluorophores, ce qui nécessite des calculs de compensation de plus en plus complexes comme le nombre d&#39;augmentations de paramètres. Ces limitations sont traitées par cytométrie de masse, où les anticorps conjugués à métaux lourds sont détectés et quantifiés par le temps de la spectrométrie de masse de vol (TOF) d&#39;élargir considérablement le nombre de paramètres collectés en même temps et donner un profil de protéines d&#39;abondance dimensionnelle élevée pour chaque cellule individuelle. Une compréhension de base du fonctionnement de l&#39;instrument de cytométrie de masse est bénéfique pour l&#39;utilisateur et peut être essentielle pour le dépannage. Pour une description plus complète de mise au point et l&#39;exécution d&#39;une machine à cytométrie de masse,voir le manuscrit lié 1. En bref, un échantillon de cellules est marqué avec un panel d&#39;anticorps conjugués métalliques ciblant des marqueurs de surface cellulaire, des protéines cytoplasmiques, des protéines nucléaires, des protéines de la chromatine lié ou d&#39; autres epitopes d&#39;intérêt (figure 1i). Les cellules marquées sont chargés sur la machine, soit un à la fois par injection manuelle ou en utilisant un passeur d&#39;échantillons que les échantillons à partir d&#39;une plaque à 96 puits. Les cellules chargées sont injectés par l&#39; intermédiaire d&#39; un nébuliseur, qui génère une pulvérisation de gouttelettes de liquide d&#39; encapsulation des cellules (Figure 1ii). Cette pulvérisation est positionnée de telle sorte que les cellules sont ionisés par une torche à plasma d&#39;argon. Cette ionisation génère un nuage de particules comprenant tous les atomes constitutifs de chaque cellule (Figure 1iii). Comme ce nuage de particules se déplace vers le détecteur, les atomes de faible masse atomique sont séparés des ions de masse élevée par un filtre de masse quadripolaire. Les hauts ions de masse restants continuent au détecteur, où le abundance de chaque isotope est quantifiée (Figure 1IV). Les données brutes recueillies par le détecteur, sont analysés par le logiciel d&#39;instruments de cytométrie de masse pour identifier les événements cellulaires. Pour chaque événement de cellule identifiée, le signal détecté dans chaque canal est quantifié et enregistré dans le fichier de sortie. Les canaux de masse utilisés pour détecter les anticorps conjugués métal lourd présentent un recouvrement spectral minimal, qui varie de 0,4% avec la plupart des contributions inférieures à 1%. En raison de ce faible diaphonie entre les canaux, il est généralement nécessaire de transformer les données avec une matrice de compensation avant l&#39; analyse 2. Cependant, il faut prendre soin lors de la conception du panneau expérimental d&#39;anticorps pour assurer qu&#39;un anticorps avec un épitope de haute abondance n&#39;est pas affecté à un canal de masse qui contribue signal à un canal attribué à un anticorps à faible abondance, car cela pourrait créer une population artificiellement élevé dans le canal de réception de la contribution du signal. <p class = « jove_content »&gt; La préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de cytométrie de masse exacte dépend fortement des types d&#39;échantillons recueillis et mis à l&#39;essai l&#39;hypothèse expérimentale. Nous fournissons des exemples de deux protocoles de récolte différents types de cellules (cellules souches embryonnaires humaines) et les cellules primaires (isolat de cellules épithéliales de la tumeur du sein de la souris). Lorsque vous commencez une étude de cytométrie de masse, il est conseillé de procéder d&#39;abord à une petite expérience pilote pour faire en sorte que tous les protocoles et les anticorps à être utilisés fonctionnent bien entre les mains de l&#39;enquêteur. Ceci est particulièrement essentiel lorsque les anticorps conjugués sont personnalisés pour être utilisés, comme la réaction de réduction partielle au cours de la conjugaison d&#39;anticorps a le potentiel de perturber l&#39;affinité des anticorps; Par conséquent, chaque anticorps personnalisé doit être validée de manière empirique pour assurer l&#39;exactitude des données. D&#39;autres considérations comprennent la détermination si des anticorps de surface cellulaire à utiliser dans l&#39;essai reconnaîtra leurs épitopes après fixation ou si elles nited à appliquer à des cellules vivantes. Certains fixation peut empêcher la coloration appropriée avec des anticorps de surface cellulaire comme cela est connu pour se produire avec coloration peptide-CMH 3, 4. Exécution d&#39;une coloration d&#39;anticorps de surface cellulaire sur des cellules vivantes peut être nécessaire pour certains anticorps, mais cela exclut la possibilité de barcoding avant le marquage de l&#39; anticorps comme la plupart des méthodes de codes - barres sont effectuées après fixation 5 , bien que le code à barres à base d&#39; anticorps 6, 7 est une exception. Lors de la détermination du nombre de cellules devant être préparé pour l&#39;analyse, il est important de savoir que seule une fraction des cellules chargées sur la machine sera détecté et produire des données. Cette perte est principalement due à l&#39;inefficacité lorsque le nébulisateur pulvérise l&#39;échantillon à la torche. La perte exacte pour cent dépend de la masse configuration de la machine cytométrie et le type cellulaire, mais peut varier 50-85% et devrait êtreconsidéré lors de la conception de l&#39;expérience. Ce protocole a été optimisé pour 2x10 6 cellules par échantillon , mais peut être adapté pour le traitement des petites ou plus grandes tailles d&#39;échantillon. Ce protocole peut être utilisé avec des modifications minimes pour la taille des échantillons de 1 x 10 6 4 x 10 6, mais il est essentiel que la taille de l&#39; échantillon soit maintenu au sein d&#39; une expérience cohérente. Les modifications du nombre de cellules peuvent affecter l&#39;intensité de la coloration des anticorps et Code à barres et doivent être conservés à peu près cohérente à travers à être directement comparés échantillons. Certaines procédures, telles que l&#39;étiquetage des cellules mortes et l&#39;étiquetage de l&#39;ADN, doivent être effectuées dans la grande majorité, sinon tous les modèles expérimentaux. Le marquage des cellules mortes dans des expériences analysant uniquement les marqueurs de surface peut être réalisée à l&#39;aide Rh103, mais Rh103 doit être évitée pour des expériences où perméabilisation est nécessaire, car il entraîne une perte de coloration. Pour les expériences impliquant perméabilisation, il est conseillé d&#39;utiliser le cisplatine Code - barres échantillons peuvent réduire la consommation d&#39;anticorps, diminuer le temps d&#39;acquisition et d&#39; éliminer la variabilité échantillon à échantillon 9. Le procédé de codage à barres consiste à appliquer un code unique spécifique à l&#39;échantillon à toutes les cellules, ce qui permet d&#39;affecter chaque cellule à son échantillon d&#39;origine. Après barcoding les échantillons peuvent être mis en commun avant la coloration d&#39;anticorps, un processus qui assure que tous les échantillons sont colorés de manière égale. Pour minimiser l&#39;erreur expérimentale, il est prudent de code à barres et des échantillons piscine qui doivent être directement comparés les uns aux autres. À l&#39; heure actuelle , il existe plusieurs méthodes pour les échantillons barcoding pour l&#39; analyse de cytométrie de masse 5, 6, 7, dont deux sont présentées ici (voir ci - dessous). Avec Reagen actuellement disponiblets , il est possible de quantifier l&#39;abondance de 38 cibles d&#39;anticorps, identifier des cellules en phase S 10, distinguer les cellules vivantes et mortes 8 et de mesurer les niveaux cellulaires de 11 l&#39; hypoxie dans une expérience multiplexé d&#39;échantillons multiples. Cette capacité à recueillir des données sur une seule cellule de haute paramètres pour les grandes populations de cellules permet une amélioration du profil des populations de cellules très hétérogènes et a déjà produit un certain nombre de nouvelles connaissances biologiques 12, 13, 14, 15, 16. Les données complexes distillant résultant des informations interprétable a nécessité l&#39;utilisation d&#39;algorithmes de calcul , y compris Spanning Tree Progression de la densité des événements Normalisé (SPADE) 17 et 18 Visne. Cet article présente un accèsaperçu de la façon de concevoir et de réaliser une masse cytométrie expérience et présente une analyse de base de données de cytométrie de masse.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Chaud à température ambiante avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Tiède à 37&nbsp ; &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Chaud à 37&nbsp ; &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Fourni à 1&nbsp ; mM</td></tr><tr><td>cell ID pt195</td><td>fluidigm</td><td></td><td>fourni à 1&nbsp ; mM</td></tr><tr><td>cell ID pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>fourni à 1&nbsp ; mM</td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble à 25&nbsp ; mg/mL dans DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble à 74&nbsp ; mg/mL dans 0,2 po N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 agent intercédant</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Refroidissement à -20&nbsp ; &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubes à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956 ; Tubes de bouchon de filtre m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ quatre éléments billes d’étalonnage</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse cytométrie

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Masse utilise cytométrie anticorps conjugués avec des étiquettes de métaux lourds, une approche qui a considérablement augmenté le nombre de paramètres et les possibilités d&#39;une analyse approfondie bien au-delà de ce qui est possible avec la cytométrie de flux par fluorescence conventionnelle. Comme pour toute nouvelle technologie, il y a des étapes essentielles qui contribuent à assurer la production fiable de données de haute qualité. Présenté ici est un protocole optimisé qui intègre plusieurs techniques pour le traitement des échantillons de cellules pour l&#39;analyse de cytométrie de masse. Les méthodes décrites ici aideront l&#39;utilisateur à éviter les pièges courants et obtenir des résultats cohérents en réduisant au minimum la variabilité, qui peut conduire à des données inexactes. Pour éclairer la conception expérimentale, la raison d&#39;être des étapes facultatives ou alternatives dans le protocole et leur efficacité dans la découverte de nouvelles découvertes dans la biologie du système étudié est couvert. Enfin, des données représentatives sont présentées pour illustrer les résultats attendus des techniques presented ici.

Le protocole présenté ici peut être largement appliquée à une grande variété d'échantillons de cellules en culture et primaire avec seulement quelques modifications mineures. En fonction des besoins de l'expérience, elle peut être réalisée de manière modulaire lorsque certains éléments, tels que la coloration surface cellulaire ou le codage à barres, ne sont pas nécessaires. Utilisé dans son intégralité ce protocole permet la préparation de la masse multiplexé cytométrie échantillons mar...

Cet article décrit la collecte et le traitement d’échantillons pour l’analyse par cytométrie de masse.

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

L’objectif global de ce processus de préparation d’échantillons est de produire une coloration d’anticorps robuste et cohérente de divers échantillons pour permettre l’interrogation de populations cellulaires hétérogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions sur l’identité cellulaire, la signalisation cellulaire et la réponse cellulaire dans une population cellulaire hétérogène complexe. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer des niveaux de protéines à paramètres élevés au niveau de la cellule unique.La démonstration de cette procédure sera faite par Aundrietta Duncan, une étudiante diplômée de notre laboratoire. Pour chaque échantillon de suspension unicellulaire, mettez-le en suspension quatre fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu sans sérum, ajoutez 500 microlitres de cisplatine 50 micromolaires fraîchement préparés par 2/10 dans les six cellules et incubez les échantillons sur un agitateur orbital avec mélange constant à température ambiante. Au bout d’une minute, trempez le cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage et centrifugez les cellules.Jetez le surnageant et lavez les échantillons deux fois de plus en ajoutant 500 microlitres de tampon de lavage, en centrifugeant les cellules et en versant le tampon de lavage. Ensuite, deux lavages dans 500 microlitres de PBS ont permis de centrifuger de la même manière les échantillons et d’éliminer le surnageant. Après le deuxième lavage PBS, remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de PBS frais et fixez les cellules avec 500 microlitres de 4 % de PFA.Pipetez les cellules à mélanger. Placez ensuite les échantillons sur l’agitateur orbital en mélangeant constamment pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation, videz le surnageant, puis faites-le laver dans du PBS frais.Pour perméabiliser les cellules, faites tourner à nouveau les cellules et jetez les surnageants. Remettez les échantillons en suspension dans le PBS résiduel par vortex doux, et ajoutez immédiatement un millilitre de méthanol à 100 % par 2/10 10 aux sixièmes cellules avec un pipetage doux. Incuber les échantillons à quatre degrés pendant au moins une heure, et à la fin de l’incubation, centrifuger les cellules.Ensuite, videz le méthanol. Ensuite, lavez les granulés dans un millilitre de tampon de lavage pour chaque millilitre de méthanol, suivi de deux autres lavages dans 500 microlitres de tampon de lavage frais. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres réglée sur 50 microlitres, transférez le tampon de lavage restant de chaque granule dans un tube du cocktail d’anticorps correspondant approprié.Pipette refoulez la solution combinée sans aspirer d’air dans la pointe en maintenant le piston partiellement enfoncé. Transférez ensuite la pointe de la pipette dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de tampon de lavage sans relâcher le piston. Relâchez le piston en prélevant le tampon de lavage pour obtenir un volume total de cocktail d’anticorps de 50 microlitres et étiquetez l’échantillon correspondant approprié avec le cocktail d’anticorps aspiré par pipetage doux.Après une heure à température ambiante en secouant constamment, lavez les échantillons quatre fois, en vidant le tampon de lavage à chaque fois. Pour marquer les cellules avec de l’iridium, remettez en suspension les pastilles finales dans 500 microlitres de PBS, puis ajoutez 500 microlitres de 4 % de PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’iridium 62,5 nanomolaires et de PFA fraîchement préparés aux échantillons pour 15 minutes supplémentaires d’agitation à température ambiante.Ensuite, centrifugez les cellules, videz le surnageant, puis effectuez deux lavages dans 500 microlitres de BSA à 0,1 % et d’eau déminéralisée filtrée. Analysez les échantillons en ajoutant des billes de normalisation dans les puits des plaques d’échantillons, en pipetant les cellules dans ces puits, puis en effectuant une cytométrie de masse dans les 24 heures. Après normalisation de l’intensité du signal, les billes d’étalonnage peuvent être retirées des données en se portant sur la population négative de billes positives à l’iridium 191.Les événements de cellules uniques peuvent ensuite être contrôlés pour éliminer les débris et les multiplets de cellules à l’aide d’un graphique biaxial de l’expression négative de l’iridium 193 en fonction de la durée de l’événement. Le marquage au cisplatine peut être utilisé pour mesurer la profondeur des cellules. Par exemple, des échantillons avec des quantités faibles et élevées de cellules mortes sont présentés.Les cellules mortes peuvent être éliminées en éliminant la population de platine 198 positif, le codage à barres entraîne une séparation distincte des échantillons dans les paramètres de codage à barres, ce qui permet d’attribuer aux cellules leur identité d’échantillon d’origine. Le marquage IDU peut être utilisé pour détecter les cellules faciales américaines observées ici. Après la normalisation initiale, le décodage à barres et le gating, les données de grande dimension peuvent être analysées à l’aide de l’algorithme SPADE pour générer une représentation dimensionnelle inférieure des données qui se prête mieux à l’interprétation visuelle.Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en quatre à six heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de minimiser la perte d’échantillon lors de l’étape de lavage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons pour l’analyse par cytométrie de masse.N’oubliez pas que travailler avec de l’azoture de sodium peut être dangereux, vous devez donc prendre des précautions telles que le port d’un EPI approprié lors de l’exécution de cette procédure.

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