Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse Cytométrie

L’objectif global de ce processus de préparation d’échantillons est de produire une coloration d’anticorps robuste et cohérente de divers échantillons pour permettre l’interrogation de populations cellulaires hétérogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions sur l’identité cellulaire, la signalisation cellulaire et la réponse cellulaire dans une population cellulaire hétérogène complexe. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer des niveaux de protéines à paramètres élevés au niveau de la cellule unique.

La démonstration de cette procédure sera faite par Aundrietta Duncan, une étudiante diplômée de notre laboratoire. Pour chaque échantillon de suspension unicellulaire, mettez-le en suspension quatre fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu sans sérum, ajoutez 500 microlitres de cisplatine 50 micromolaires fraîchement préparés par 2/10 dans les six cellules et incubez les échantillons sur un agitateur orbital avec mélange constant à température ambiante. Au bout d’une minute, trempez le cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage et centrifugez les cellules.

Jetez le surnageant et lavez les échantillons deux fois de plus en ajoutant 500 microlitres de tampon de lavage, en centrifugeant les cellules et en versant le tampon de lavage. Ensuite, deux lavages dans 500 microlitres de PBS ont permis de centrifuger de la même manière les échantillons et d’éliminer le surnageant. Après le deuxième lavage PBS, remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de PBS frais et fixez les cellules avec 500 microlitres de 4 % de PFA.

Pipetez les cellules à mélanger. Placez ensuite les échantillons sur l’agitateur orbital en mélangeant constamment pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation, videz le surnageant, puis faites-le laver dans du PBS frais.

Pour perméabiliser les cellules, faites tourner à nouveau les cellules et jetez les surnageants. Remettez les échantillons en suspension dans le PBS résiduel par vortex doux, et ajoutez immédiatement un millilitre de méthanol à 100 % par 2/10 10 aux sixièmes cellules avec un pipetage doux. Incuber les échantillons à quatre degrés pendant au moins une heure, et à la fin de l’incubation, centrifuger les cellules.

Ensuite, videz le méthanol. Ensuite, lavez les granulés dans un millilitre de tampon de lavage pour chaque millilitre de méthanol, suivi de deux autres lavages dans 500 microlitres de tampon de lavage frais. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres réglée sur 50 microlitres, transférez le tampon de lavage restant de chaque granule dans un tube du cocktail d’anticorps correspondant approprié.

Pipette refoulez la solution combinée sans aspirer d’air dans la pointe en maintenant le piston partiellement enfoncé. Transférez ensuite la pointe de la pipette dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de tampon de lavage sans relâcher le piston. Relâchez le piston en prélevant le tampon de lavage pour obtenir un volume total de cocktail d’anticorps de 50 microlitres et étiquetez l’échantillon correspondant approprié avec le cocktail d’anticorps aspiré par pipetage doux.

Après une heure à température ambiante en secouant constamment, lavez les échantillons quatre fois, en vidant le tampon de lavage à chaque fois. Pour marquer les cellules avec de l’iridium, remettez en suspension les pastilles finales dans 500 microlitres de PBS, puis ajoutez 500 microlitres de 4 % de PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’iridium 62,5 nanomolaires et de PFA fraîchement préparés aux échantillons pour 15 minutes supplémentaires d’agitation à température ambiante.

Ensuite, centrifugez les cellules, videz le surnageant, puis effectuez deux lavages dans 500 microlitres de BSA à 0,1 % et d’eau déminéralisée filtrée. Analysez les échantillons en ajoutant des billes de normalisation dans les puits des plaques d’échantillons, en pipetant les cellules dans ces puits, puis en effectuant une cytométrie de masse dans les 24 heures. Après normalisation de l’intensité du signal, les billes d’étalonnage peuvent être retirées des données en se portant sur la population négative de billes positives à l’iridium 191.

Les événements de cellules uniques peuvent ensuite être contrôlés pour éliminer les débris et les multiplets de cellules à l’aide d’un graphique biaxial de l’expression négative de l’iridium 193 en fonction de la durée de l’événement. Le marquage au cisplatine peut être utilisé pour mesurer la profondeur des cellules. Par exemple, des échantillons avec des quantités faibles et élevées de cellules mortes sont présentés.

Les cellules mortes peuvent être éliminées en éliminant la population de platine 198 positif, le codage à barres entraîne une séparation distincte des échantillons dans les paramètres de codage à barres, ce qui permet d’attribuer aux cellules leur identité d’échantillon d’origine. Le marquage IDU peut être utilisé pour détecter les cellules faciales américaines observées ici. Après la normalisation initiale, le décodage à barres et le gating, les données de grande dimension peuvent être analysées à l’aide de l’algorithme SPADE pour générer une représentation dimensionnelle inférieure des données qui se prête mieux à l’interprétation visuelle.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en quatre à six heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de minimiser la perte d’échantillon lors de l’étape de lavage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons pour l’analyse par cytométrie de masse.

N’oubliez pas que travailler avec de l’azoture de sodium peut être dangereux, vous devez donc prendre des précautions telles que le port d’un EPI approprié lors de l’exécution de cette procédure.