Régulation chimiogénétique dans les cellules précurseurs dérivées de cellules souches reprogrammées dans le traitement des maladies neurodégénératives

Nos recherches visent à illustrer le mécanisme pathogène sous-jacent aux maladies neurodégénératives, tout en intégrant des technologies de pointe pour développer des techniques de thérapie cellulaire efficaces pour des applications cliniques. Nos travaux récents ont transplanté des cellules souches modifiées chimiogénétiquement dans des modèles murins de la maladie de Parkinson. Nous modulons les activités neuronales d’une cellule avec des médicaments de synthèse, donc une surveillance électrophysiologique et une évaluation comportementale. Nous utilisons principalement CRISPR pour le génie génétique, l’électrophysiologie pour surveiller l’activité neuronale et le test comportemental pour évaluer la récupération de la fonction dans les modèles de maladie de Parkinson. L’efficacité des cellules greffées augmente en fonction de l’indication, de la survie et de la contribution fonctionnelle au tissu de l’hôte dans la thérapie à base de cellules souches, traitant les maladies neurodégénératives. Activité cellulaire incontrôlée liée à des conséquences négatives, y compris la genèse tumorale.

L’exploitation de la technologie dans les cellules souches humaines reprogrammées et les neurones conducteurs fournit les moyens de contrôler avec précision les activités neuronales via l’administration du médicament de synthèse CNO.

[Instructeur] Pour commencer, mélangez doucement 50 à 100 nanogrammes du vecteur linéarisé, fragmentez un et fragmentez deux, dans un rapport d’une à trois à trois molaires, avec un mélange de clonage 2X. Incuber le mélange à 55 degrés Celsius pendant une heure pour faciliter la recombinaison homologue à l’aide de l’assemblage Gibson. Insérez l’ARN guide ciblant le site AAVS1 dans le site BBS1 du vecteur PX458. Maintenir les cellules souches reprogrammées dans les milieux de culture, en visant une densité cellulaire comprise entre deux et 5 millions de cellules par millilitre. Maintenant, mélangez deux à 5 millions de cellules, deux microgrammes de chaque plasmide donneur et deux microgrammes de plasmide GRNA dans 100 microlitres de tampon d’électroporation. Transférez le mélange de cellules et de plasmides dans une cuvette pour effectuer l’électroporation. Ensuite, transférez les cellules électroporées dans des plaques à six puits qui ont été recouvertes de poly-D-lysine et de laminine. Répartissez environ 500 000 cellules par puits dans deux millilitres de milieu de culture. Après 72 heures d’électroporation, utilisez un cytomètre en flux pour trier les cellules positives fluorescentes. Configurez le trieur avec le canal FITC pour la détection ZsGreen. Inclure les cellules souches neurales induites non traitées comme contrôles négatifs pour définir la fluorescence de base. Divisez les cellules ZsGreen-positives individuelles en plaques de 96 puits pré-enduites de poly-D-lysine et de laminine et ajoutez 200 microlitres de milieu de culture par puits. Maintenez la culture pendant sept à 14 jours. Isolez des clones uniques présentant une fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un ensemble de filtres à protéines fluorescentes vertes. Après avoir développé les cellules positives sur des plaques revêtues de 48 puits, divisez-les en deux parties, l’une pour la culture continue et l’autre pour le génotypage. Extraire l’ADN génomique des clones candidats. Préparez le mélange PCR à l’aide de deux réparations principales, l’une pour confirmer l’insertion du gène d’intérêt, et l’autre pour distinguer les clones homozygotes et hétérozygotes. Digérez les cellules, lavez-les dans du PBS et centrifugez-les à 250 G pendant trois minutes. Effectuer des injections stéréotaxiques unilatérales de trois microlitres de 6-hydroxydopamine à une concentration de cinq microgrammes par microlitre sur l’animal anesthésié. Ciblez le corps du striatum droit en utilisant les bonnes coordonnées. Administrer une injection intrapéritonéale d’apomorphine à raison d’un milligramme par kilogramme à l’aide d’une solution saline de 0,5 milligramme par millilitre dissoute dans une solution saline quatre semaines après la chirurgie pour valider les lésions. Administrer une injection stéréotaxique de quatre microlitres de la suspension cellulaire préparée dans le modèle murin de la maladie de Parkinson. Effectuez le test du cylindre à plusieurs moments après la greffe de cellules. Placez un bécher en verre de 20 centimètres de diamètre et de 30 centimètres de hauteur sur une surface plane et non réfléchissante. Ensuite, positionnez une caméra de vue de dessus au-dessus du cylindre pour capturer le diamètre complet. Placez chaque souris au centre du cylindre et lancez l’enregistrement vidéo simultané pendant trois minutes par session. Après la session, remettez la souris dans sa cage d’origine. Évaluez le mouvement des membres supérieurs des souris pendant la séance de trois minutes. Calculez le nombre de contacts de paroi établis par le membre antérieur affaibli par rapport au nombre total de contacts établis par les deux membres antérieurs. Administrer une solution saline ou de la N-oxyde de clozapine à une dose de 1,2 milligramme par kilogramme par injection intrapéritonéale. Effectuez à nouveau le test du cylindre pour évaluer la modulation comportementale dans le modèle murin de la maladie de Parkinson après l’administration de N-oxyde de clozapine. Après avoir extrait le cerveau de l’animal anesthésié, placez-le immédiatement dans du liquide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose glacé pour préserver l’intégrité cellulaire À l’aide d’un vibratome, coupez le cerveau en sections de 300 à 400 micromètres d’épaisseur. Ajustez les paramètres d’entrée de gaz pour équilibrer avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone à 34 degrés Celsius. Transférez les tranches de cerveau dans une chambre remplie de liquide céphalo-rachidien artificiel. Chargez les pipettes en verre avec une solution intracellulaire glacée, en veillant à ce que la résistance de l’électrode soit comprise entre sept et 10 mégohms. Montez des tranches dans une chambre d’enregistrement immergée superfusionnée à deux millilitres par minute avec du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné à 34 degrés Celsius. Positionner les pipettes à l’aide de micromanipulateurs motorisés sous microscopie à contraste interférentiel différentiel infrarouge. Établissez une configuration cellulaire entière en utilisant une aspiration douce pour patcher les neurones dont la résistance est supérieure à un gigaohm. Clampez les cellules à moins 70 millivolts à l’aide d’un amplificateur patch clamp et acquérez des courants post-synaptiques excitateurs spontanés de base pendant huit minutes à une fréquence d’échantillonnage de 10 kilohertz. Ajouter 50 micromolaires de N-oxyde de clozapine dans la chambre d’enregistrement immédiatement après la mesure de base. Continuez à enregistrer les données pendant 16 minutes et surveillez les changements de fréquence ou d’amplitude du courant post-synaptique excitateur spontané. Enfin, effectuez une procédure de lavage en remplaçant la solution de N-oxyde de clozapine par du liquide céphalo-rachidien artificiel frais et poursuivez l’enregistrement pour évaluer la récupération de l’activité synaptique. La modulation hémogénétique à l’aide du N-oxyde de clozapine a réduit le mouvement controlatéral des membres antérieurs chez les souris transplantées hM4Di et l’a augmenté chez les souris transplantées hM3Dq par rapport au traitement salin, démontrant un contrôle comportemental bidirectionnel. Les enregistrements électrophysiologiques ont révélé que les cellules transplantées par hM4Di avaient des intervalles plus longs et des amplitudes de pic plus petites dans les courants post-synaptiques excitateurs spontanés, tandis que les cellules transplantées par hM3Dq avaient des intervalles plus courts et des amplitudes plus grandes, indiquant une suppression et une amélioration respectives de l’activité synaptique. L’analyse d’immunofluorescence a confirmé l’expression in vivo de la tyrosine hydroxylase et de ZsGreen dans les cellules hM4Di et hM3Dq transplantées, favorisant ainsi une intégration réussie du greffon.