Protocoles de dépistage expérimental, immunocytochimie et techniques d’imagerie basées sur la microscopie pour Penium margaritaceum

Nos recherches portent sur le rôle de la paroi cellulaire dans le maintien de la forme cellulaire et la réponse au stress externe. Nous utilisons une gamme de techniques de microscopie optique et de microscopie confocale à balayage laser pour imager la structure de la paroi cellulaire dans les cellules vivantes et la microscopie électronique pour l’imagerie à haute résolution des parois cellulaires.

Le manque actuel de lignées cellulaires transformées pour les algues streptophytes exprimant des protéines subcellulaires spécifiques pour mettre en évidence la dynamique de la paroi cellulaire fait défaut. Cela nécessite ensuite l’utilisation d’anticorps et d’autres sondes fluorescentes pour l’étude. La paroi cellulaire du Penium répond à diverses formes de stress abiotique et biotique, ce qui conduit à une plasticité phénotypique. Nous avons constaté que les pectines de la paroi cellulaire jouent un rôle important dans ce processus. Le phénotype unicellulaire et la capacité d’effectuer le marquage de cellules vivantes avec Penium offrent aux biologistes des plantes la possibilité de se plonger dans la structure et le développement de la paroi cellulaire.

[Instructeur] Pour commencer, prélevez cinq millilitres de cultures cellulaires liquides de Penium margaritaceum en croissance active. Transvaser dans un tube à centrifuger en plastique de 15 millilitres, puis centrifuger. Après avoir versé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de MHO frais. Fixez fermement le capuchon du tube et secouez vigoureusement le tube pendant 10 secondes pour remettre la pastille en suspension et éliminer toute substance polymère extracellulaire de la surface de la paroi cellulaire. Après le lavage final, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de MHO frais, puis transférez 200 microlitres d’aliquotes de suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes de bouchage dans la microcentrifugeuse à 1000 G pendant une minute, puis aspirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 400 microlitres de MHO frais. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’anticorps monoclonaux dilués à la suspension cellulaire et vortex bien. Ensuite, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et incubez-le sur un rotateur de laboratoire pendant 90 minutes. Centrifugez la suspension, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de WHM frais avant de tourbillonner pendant 10 secondes. Après la centrifugation finale, remettre en suspension la pastille dans 400 microlitres de WHM et ajouter huit microlitres de TRITC ou FITC anti-rat de chèvre. Enfin, remettez en suspension la pastille dans 100 microlitres de milieu de croissance. Fermez le tube et enveloppez-le dans du papier d’aluminium jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’imagerie. Diluez dix fois les cellules marquées avec l’anticorps JIM5 dans WHM. Ajoutez une goutte de 50 microlitres de la suspension cellulaire diluée sur une lamelle. Incuber les cellules pendant deux minutes dans l’obscurité pour permettre l’adhérence des cellules, puis pipetez soigneusement un millilitre de WHM goutte à goutte pour rincer toutes les cellules non adhérentes. Ajoutez 30 microlitres de WHM sur les cellules attachées. Superposez la gouttelette avec 30 microlitres d’agarose chaud à 4 % dans WHM et laissez-la se solidifier. Pour les échantillons dans une boîte de Pétri, ajoutez suffisamment de WHM pour couvrir complètement les cellules incluses dans l’agarose. Pour les cellules sur une lamelle, inversez la lamelle et placez-la doucement sur une lame de dépression remplie de WHM. Montez les cellules préparées sur un microscope fluorescent. Installez une lampe externe ou utilisez l’éclairage intégré du microscope pour favoriser la croissance et le mouvement des cellules. Capturez des images toutes les 10 à 30 minutes à l’aide du filtre TRITC réglé pour suivre l’expansion de la paroi cellulaire. Préparez un tube contenant cinq millilitres de cultures cellulaires lavées de 10 à 14 jours. Ensuite, ajoutez environ 100 microlitres de billes fluorescentes de 0,75 micromètre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pipetez un millilitre de WHM dans le tube et secouez vigoureusement pour remettre les billes en suspension. Centrifugez le tube à 10 000 G pendant trois minutes. Remettre en suspension la pastille finale dans 500 microlitres de WHM. Ensuite, pipetez un millilitre de milieu WHM dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez des inhibiteurs ou des régulateurs de croissance pour obtenir la concentration souhaitée et faites tourner doucement la plaque. Ajoutez 10 microlitres de solution de billes et remuez doucement à nouveau pour mélanger, puis ajoutez 10 microlitres de cellules lavées dans chaque puits avant de mélanger. Incuber la plaque pendant 24 heures à la lumière. Sans déranger la plaque, placez-la sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’un filtre FITC. Pipetez un millilitre d’une suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 4 000 G pendant une minute. Après avoir jeté le surnageant, plongez le tube contenant la pastille dans de l’azote liquide ou congelez-le à moins 80 degrés Celsius. Remettre en suspension la pastille décongelée dans 20 microlitres de WHM. Placez une goutte de la suspension à cellules denses sur une lamelle de 45 x 50 millimètres. Placez une deuxième lamelle sur le dessus de la goutte pour créer un sandwich. Appuyez continuellement sur le sandwich pendant 30 secondes pour rompre les cellules. Séparez soigneusement les lamelles. Ajoutez du WHM sur les lamelles pour laver les cellules rompues dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et une centrifugeuse. Examinez la pastille blanche ou légèrement verte après avoir jeté le surnageant. Remettre en suspension la pastille contenant les parois cellulaires dans de l’eau déminéralisée. Après la rupture de la cellule et la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres d’eau déminéralisée avant de la transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, fixez du ruban de carbone à la surface d’un talon de Cambridge. Pipetez des gouttes de cinq microlitres de la suspension de la paroi cellulaire en suspension sur le ruban de carbone. Utilisez une cible au palladium pour vaporiser sur le talon pendant 50 secondes après l’avoir laissé sécher pendant la nuit. Observez les cellules à cinq kilovolts, avec une taille de spot appropriée positionnée à 10 centimètres du détecteur d’électrons secondaire. Le marquage de la paroi cellulaire de P. margaritaceum avec des anticorps monoclonaux anti-pectine a révélé un réseau de fibres complexes de calcium formant un motif de réseau irrégulier. La pectine s’est déposée au centre de la cellule ou isthme, poussant la pectine plus ancienne vers les pôles. Le marquage JIM7 a montré qu’une pectine méthylestérifiée élevée était initialement sécrétée dans une bande étroite au niveau de l’isthme. D’autres polymères de la paroi cellulaire, tels que la protéine arabinogalactane, ont été détectés avec l’anticorps monoclonal JIM13. De grandes quantités de substances polymères extracellulaires ont été sécrétées à l’extérieur de la paroi cellulaire, permettant le glissement et l’agrégation cellulaire. Les techniques de marquage ont permis d’étudier quantitativement la paroi cellulaire et l’expansion, en intégrant des approches d’imagerie développementale. Des études structurales corrélatives ont révélé que le réseau typique de pectine était composé d’un maillage de fibres se terminant extérieurement par des projections distinctes. Le traitement avec de fortes concentrations de calcium a transformé le réseau de pectine en dépôts irréguliers, comme observé dans les cellules marquées par JIM5. Lorsque les parois cellulaires traitées au calcium ont été examinées au microscope électronique à balayage, la structure désorganisée de la pectine a été observée en détail.