Un modèle de transfert adoptif de la polyarthrite rhumatoïde chez la souris

Le but de cette recherche est d’établir un modèle animal rapide et stable de la polyarthrite rhumatoïde pour l’étude de la pathogenèse et du mécanisme moléculaire. Les modèles animaux actuels de polyarthrite rhumatoïde sont confrontés à des limites en termes de praticité expérimentale, notamment des délais d’induction prolongés, un rapport coût-efficacité sous-optimal et une reproductibilité incohérente du phénotype de la maladie. Ici, nous avons développé un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde en transférant adoptivement des lymphocytes T CD4+ de souris SKG dans des souris sauvages C57BL/6, obtenant une incidence élevée avec 100 % de succès en 14 jours, ce qui est beaucoup plus rapide que les méthodes conventionnelles. Ce système rentable et hautement reproductible permet une analyse précise des mécanismes immunitaires et des tests thérapeutiques.

[Narrateur] Pour commencer, plongez les souris SKG euthanasiées dans de l’alcool à 75 % pendant cinq minutes pour les désinfecter. Localisez la rate dans la cavité abdominale et les ganglions lymphatiques dans les régions inguinale et poplitée. À l’aide de pinces et de ciseaux stériles, disséquez soigneusement la rate et les ganglions lymphatiques et transférez-les immédiatement dans du PBS pré-refroidi. Placez la rate et les ganglions lymphatiques dans des boîtes de Pétri séparées. Ensuite, pressez les tissus à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres à l’aide du piston d’une seringue stérile tout en ajoutant progressivement 10 à 12 millilitres de PBS pré-refroidi pour former une suspension cellulaire uniforme. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube à 300 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et conservez la pastille cellulaire. Ajustez la concentration cellulaire à 10 à la puissance huit cellules par millilitre à l’aide d’une quantité appropriée de tampon fournie dans le kit d’isolement des lymphocytes T CD4+. Mélangez ensuite 10 microlitres de suspension cellulaire avec du bleu trypan pour évaluer la viabilité cellulaire. Maintenant, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans un nouveau tube. Pipette 10 microlitres de cocktail d’anticorps à la biotine dans le tube. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes. Remettez les billes en suspension en tourbillonnant à vitesse maximale. Ajoutez 10 microlitres de suspension de billes de streptavidine dans le tube, mélangez bien et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de tampon du kit dans le tube et placez-le sur une grille de séparation magnétique pendant cinq minutes. Versez délicatement le liquide contenant les cellules cibles dans un nouveau tube stérile. Centrifugez le tube à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant et conservez la pastille de cellule. Maintenant, ajoutez suffisamment de PBS stérile pour ajuster la concentration cellulaire à 2 millions de cellules par millilitre et gardez la suspension sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Pour le transfert adoptif de lymphocytes T CD4+, nettoyez d’abord délicatement le canthus interne d’une souris C57BL/6 anesthésiée à l’aide d’un coton-tige stérile. Immobiliser la souris à la main. Ensuite, prélevez 200 microlitres de suspension de lymphocytes T CD4+ dans une seringue d’un millilitre. Insérez l’aiguille à un angle de 10 à 15 degrés dans le sinus rétro-orbitaire, en assurant un placement précis. Injectez la suspension lentement et uniformément pendant 10 à 15 secondes. Après avoir retiré l’aiguille, appuyez doucement sur la zone du sinus rétro-orbitaire avec un coton-tige stérile pendant trois à cinq secondes pour éviter les saignements. Placez maintenant la souris dans une cage silencieuse, sèche et propre pour la surveiller jusqu’à ce qu’elle reprenne complètement conscience avec une respiration stable et aucun comportement anormal. Enregistrez les détails de l’infusion et étiquetez les souris du modèle et du groupe témoin, en veillant à ce qu’il y ait quatre animaux par groupe pour éviter toute confusion. Injectez des lymphocytes T CD4+ aux souris modèles tout en laissant les souris témoins non traitées. Le quatrième jour, pesez la poudre de mannane et dissolvez-la dans du PBS stérile à une concentration de 100 milligrammes par millilitre. Tenez la souris en toute sécurité pour exposer son abdomen, puis désinfectez la peau à l’aide d’iodophore. Localisez le site d’injection à environ un centimètre sur le côté de la ligne médiane abdominale. Mélangez bien la solution de mannane. Prélevez 20 à 30 milligrammes de la solution dans une seringue d’un millilitre. Insérez l’aiguille à un angle de 45 degrés dans la cavité péritonéale et injectez lentement pour assurer une distribution uniforme. Retirez lentement l’aiguille et appuyez doucement sur le site d’injection avec un coton-tige stérile pendant quelques secondes. Transférez la souris dans une cage silencieuse et propre et observez pendant cinq à 10 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite, de distension abdominale ou de respiration anormale. Enregistrez soigneusement les détails de l’injection pour chaque souris. Le taux d’incidence dans le groupe modèle a atteint 100 % et les scores cliniques pour le gonflement articulaire ont augmenté de manière significative sur six semaines avec un soulagement temporaire observé au cours de la deuxième semaine. Un épaississement et un gonflement significatifs ont été observés dans les articulations des membres antérieurs et postérieurs des souris du groupe modèle. La pathologie de l’articulation de la cheville chez les souris du groupe modèle a révélé un épaississement synovial prononcé, une discontinuité osseuse et une agrégation cellulaire inflammatoire marquée par rapport aux témoins. L’analyse sérique a révélé que le groupe modèle présentait des taux significativement plus élevés d’IL-6, d’IL-10, de TNF, d’IL-17 et d’IFN-gamma par rapport au groupe témoin. Dans la rate, les niveaux d’ARNm de TBX21 et d’IL-17 étaient significativement élevés dans le groupe modèle par rapport aux témoins, indiquant une augmentation de l’activité des cellules Th1 et Th17.