Name: Séquençage d’amplicon à l’aide des technologies de séquençage à lecture longue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez le séquençage d'amplicons par technologies de lecture longue pour le diagnostic de la tuberculose multirésistante. Cette méthode offre des résultats précis comparables aux standards dorés avec des délais réduits.

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<ol><li>Tuberculosis report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Baltimore+Health+News%22">Baltimore Health News</a>. , WHO. (2022).</li>
<li>WHO Malaria Department report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+20-23%22">Report 20-23</a>. , WHO. (2023).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+End+Strategy+TB%22">The End Strategy TB</a>. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).</li>
<li>Cabibbe, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+targeted+nextgeneration+sequencing+assay+on+a+portable+sequencing+platform+for+culturefree+detection+of+drugresistant+tuberculosis+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).</li>
<li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culturefree+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+antituberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>NG, K. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+well+do+routine+molecular+diagnostics+detect+Rifampin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin.</a> J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).</li>
<li>MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+molecular+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in molecular diagnosis of tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).</li>
<li>Sibandze, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+diagnostics+of+tuberculosis+resistance+by+targeted+stool+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing.</a> Genome Med. 14 (1), 42(2022).</li>
<li>Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+laboratory+costs+of+rapid+molecular+tests+and+conventional+diagnostics+for+detection+of+tuberculosis+and+drugresistant+tuberculosis+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa.</a> BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).</li>
<li>Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nextgeneration+sequencing+technologies%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nextgeneration sequencing technologies: An overview.</a> Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).</li>
<li>Pervez, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+performance+of+nextgeneration+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms.</a> Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).</li>
<li>Tafess, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetedsequencing+workflows+for+comprehensive+drug+resistance+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+cultures+using+two+commercial+sequencing+platforms%3A+Comparison+of+analytical+and+diagnostic+performance%2C+turnaround+time%2C+and+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost.</a> Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).</li>
<li>Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+rapid+communication%22">WHO rapid communication</a>. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).</li>
<li>Hazra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+wholegenome+sequencing+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+treatment+outcomes+for+MDRTB%2FXDRTB%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review.</a> Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).</li>
<li>Shea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+wholegenome+sequencing+and+reporting+of+drug+resistance+profiles+on+clinical+cases+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+New+York+State%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State.</a> J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).</li>
<li>Meehan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+of+Mycobacterium+tuberculosis%3A+Current+standards+and+open+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).</li>
<li>Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+accurate+genetic+variant+identification+from+contaminated+and+lowcoverage+Mycobacterium+tuberculosis+whole+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data.</a> Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+the+third+edition+of+WHO+consolidated+guidelines+on+tuberculosis%3A+Module+3%3A+Diagnosis%3A+Rapid+diagnostics+for+tuberculosis+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Antituberc%22%5BJournal%5D)">Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection.</a> Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).</li>
<li>Kambli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nextgeneration+sequencing+directly+from+sputum+for+comprehensive+genetic+information+on+drugresistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).</li>
<li>Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Rapid+Communication%22">Rapid Communication</a>. , WHO. 1-8 (2023).</li>
<li>Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+assays+for+the+diagnosis+of+drugresistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis.</a> Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).</li>
<li>Dippenaar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+for+Mycobacterium+tuberculosis%3A+A+critical+review+of+the+literature%2C+new+developments%2C+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities.</a> J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).</li>
<li>Chan, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+economical+drug+resistance+profiling+with+nanopore+MinION+for+clinical+specimens+with+low+bacillary+burden+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis.</a> BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).</li>
<li>Feuerriegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genomic+first+and+secondline+drug+resistance+prediction+from+clinical+Mycobacterium+tuberculosis+specimens+using+DeeplexMycTB%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB.</a> Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).</li>
<li>GenoScreen product brochure. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Deeplex+MycTB%22">Deeplex MycTB</a>. , GenoScreen. (2023).</li>
<li>Mtafya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+render+tuberculosis+samples+safe+for+application+of+tuberculosis+molecular+bacterial+load+assay+in+clinical+settings+without+a+biosafety+level+3+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory.</a> Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).</li>
<li>Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuganthi%2C+P+%22Research+Advances+in+Microbiology+and+Biotechnology%22">Research Advances in Microbiology and Biotechnology</a>. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).</li>
<li>consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+guideline%22">WHO guideline</a>. , WHO. (2022).</li>
<li>Williams, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrixbased+DNA+extraction+for+targeted+nextgeneration+sequencing+on+decontaminated+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples.</a> J Vis Exp. (181), e68147(2025).</li>
<li>Delahaye, C., Nicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+DNA+with+nanopores%3A+Troubles+and+biases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases.</a> PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+drugresistant+tuberculosis+genes+using+direct+PCR+amplification+and+Oxford+Nanopore+Technology+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing.</a> Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).</li>
<li>Tagliani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+nextgeneration+sequencingbased+drug+susceptibility+testing+unveil+high+levels+of+drugresistantTB+in+Djibouti%3A+Results+from+the+first+national+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey.</a> Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).</li>
<li>Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+nanopore+sequencing+for+clinical+diagnostics%3A+For+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL & Tubes à liaison Lo de 1,5 mL ou 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108051-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Échelle 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à bouchon à vis de 2 mL</td><td>Spécialités Scientifiques Inc</td><td>P2TUB056C-0001.5ST</td><td></td></tr><tr><td>Des perles de verre stériles de 2 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273627-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Perle XP AMPure</td><td>Beckman Colter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Deeplex Myc-TB&nbsp ;</td><td>GenoScreen</td><td>20090205</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’électrophorèse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique, pur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéiseur FastPrep</td><td>MP Biomédicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrant (10 & micro ; L)&nbsp ;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-10-R</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrantes (1000 & micro ; L)&nbsp ;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-1000-R</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à filtre (20 & micro ; L)&nbsp ;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-20-R</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrant (200 & micro ; L)&nbsp ;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-200-R</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de flux & nbsp ;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td></td></tr><tr><td>Matrice InstaGene</td><td>Bio-Rad</td><td>BBRD7326030</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnétique & nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Sous-fifre</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MK1B</td><td></td></tr><tr><td>Kit de codage à barres natif V14&nbsp ;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>ONÉ</td><td>M0367</td><td></td></tr><tr><td>Module de ligature rapide NEBNext</td><td>ONÉ</td><td>E6056</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Module de réparation/dA-remontage</td><td>ONÉ</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase (NFW)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (P10, P20, P200 et P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000918-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’essai à qubits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’analyse HS Qubit dsDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromètre à qubits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Souche sûre en gel d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17852</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur Universal Hood III (Système Molecular Imager Gel Doc XR)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Lasec</td><td>WMBB0L0E0216</td><td></td></tr></tbody></table>

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Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l'analyse d'expression génique basée sur l'ARN T7 linéaires d'amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d'ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

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