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Séquençage d’amplicon à l’aide des technologies de séquençage à lecture longue
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JoVE Journal Biochemistry
Amplicon Sequencing using the Long-Read Sequencing Technologies

Séquençage d’amplicon à l’aide des technologies de séquençage à lecture longue

Full Text
606 Views
08:57 min
August 29, 2025

DOI: 10.3791/68370-v

Morwasehla Modjadji1, Brendon Coenrad Mann1, Johannes Loubser1, Jennifer Williams1, Janré Steyn1, Elizabeth Maria Streicher1, Melanie Grobbelaar1, Robin Mark Warren1

1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences,Stellenbosch University

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study investigates the use of portable long-read sequencing for determining drug-resistant tuberculosis (TB) susceptibility in resource-limited settings. The protocol aims to provide accurate results comparable to gold standard methods, enhancing accessible TB diagnostics.

Key Study Components

Area of Science

  • Microbiology
  • Genomics
  • Infectious Diseases

Background

  • Drug-resistant tuberculosis is a significant global health challenge.
  • Traditional diagnostic methods may be limited in resource-poor settings.
  • Long-read sequencing offers potential advantages in accuracy and turnaround time.
  • Bioinformatics expertise is often a barrier to effective diagnostics.

Purpose of Study

  • To evaluate the effectiveness of long-read sequencing for TB diagnostics.
  • To provide a comprehensive resistance profile from clinical samples.
  • To simplify the workflow for drug-resistance detection.

Methods Used

  • Targeted next-generation sequencing of 18 drug-resistance regions.
  • Utilization of a tuberculosis-specific bioinformatics pipeline.
  • Sample preparation involving precise measurement of amplicons.
  • Adjustment of sample volumes for optimal sequencing results.

Main Results

  • Long-read sequencing demonstrated accuracy comparable to gold standards.
  • Quicker turnaround times were achieved compared to traditional methods.
  • The protocol facilitated comprehensive TB diagnostics.
  • Enhanced outbreak tracking was possible in resource-limited environments.

Conclusions

  • Portable long-read sequencing can improve TB diagnostics in low-resource settings.
  • The method reduces the need for extensive bioinformatics expertise.
  • This approach has the potential to transform TB management and control strategies.

Frequently Asked Questions

What is the significance of drug-resistant tuberculosis?
Drug-resistant tuberculosis poses a major public health threat, complicating treatment and control efforts.
How does long-read sequencing compare to traditional methods?
Long-read sequencing offers higher accuracy and faster results, making it suitable for resource-limited settings.
What are the challenges in TB diagnostics?
Challenges include limited access to advanced technologies and the need for specialized bioinformatics skills.
Can this method be used in clinical settings?
Yes, the protocol is designed to be implemented directly from clinical samples.
What are the implications for public health?
Improved diagnostics can lead to better management of TB outbreaks and more effective treatment strategies.

Ce protocole a été optimisé pour le séquençage profond ciblé de 18 régions de résistance aux médicaments chez Mycobacterium tuberculosis à l’aide d’une plateforme de séquençage à lecture longue, suivi d’une analyse avec un pipeline bioinformatique spécifique à la tuberculose conçu pour les données à lecture longue.

J’étudie si le séquençage portable à lecture longue peut fournir des résultats de susceptibilité à la tuberculose résistants aux médicaments dans des contextes limités en ressources, avec une précision comparable à la méthode des standards d’excellence, faisant progresser des diagnostics de la tuberculose accessibles et de haute qualité. Utiliser le séquençage ciblé de nouvelle génération comme outil diagnostique pour la tuberculose résistante aux médicaments, en offrant un profil de résistance complet directement à partir d’échantillons cliniques sans expertise en bioinformatique. Notre protocole utilisant le séquençage à lectures longues a le potentiel d’offrir des délais de réponse plus rapides, un flux de travail plus simple que lors de la détection de résistance en temps réel, facilitant des diagnostics complets de la tuberculose et améliorant le suivi des épidémies dans un environnement limité en ressources avec une infrastructure minimale.

Pour commencer, calculez 100 nanogrammes de chaque échantillon d’amplicon en fonction de la concentration et transférez le volume requis dans un tube PCR propre. Pour déterminer la masse totale des amplicons dans l’échantillon, utilisez la formule donnée. Ajustez le volume total de chaque échantillon à 12,5 microlitres à l’aide d’eau sans nucléase.

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