Séquençage d’amplicon à l’aide des technologies de séquençage à lecture longue

J’étudie si le séquençage portable à lecture longue peut fournir des résultats de susceptibilité à la tuberculose résistants aux médicaments dans des contextes limités en ressources, avec une précision comparable à la méthode des standards d’excellence, faisant progresser des diagnostics de la tuberculose accessibles et de haute qualité. Utiliser le séquençage ciblé de nouvelle génération comme outil diagnostique pour la tuberculose résistante aux médicaments, en offrant un profil de résistance complet directement à partir d’échantillons cliniques sans expertise en bioinformatique. Notre protocole utilisant le séquençage à lectures longues a le potentiel d’offrir des délais de réponse plus rapides, un flux de travail plus simple que lors de la détection de résistance en temps réel, facilitant des diagnostics complets de la tuberculose et améliorant le suivi des épidémies dans un environnement limité en ressources avec une infrastructure minimale.

Pour commencer, calculez 100 nanogrammes de chaque échantillon d’amplicon en fonction de la concentration et transférez le volume requis dans un tube PCR propre. Pour déterminer la masse totale des amplicons dans l’échantillon, utilisez la formule donnée. Ajustez le volume total de chaque échantillon à 12,5 microlitres à l’aide d’eau sans nucléase.

Mélangez doucement les échantillons en les pipettant 10 fois et faites-les tourner brièvement dans une microcentrifugeuse. Ensuite, ajoutez 1,75 microlitres de tampon de réparation finale et de réaction d’adénylation à chaque échantillon, suivi de 0,75 microlitres de mélange enzymatique de réparation terminale et d’adénylation. Après avoir mélangé et fait tourner les échantillons, placez les tubes dans un thermocycleur à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pour la ligation native des codes-barres, ajoutez les composants affichés à l’écran dans de nouveaux tubes PCR. Mélangez doucement les réactions en pipettant et en faisant tourner brièvement à l’aide d’une microcentrifugeuse. Ensuite, ajoutez un microlitre d’EDTA à chaque tube.

Ensuite, mélangez soigneusement et faites tourner brièvement comme montré précédemment. Extrais les échantillons codés à barres dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Vortex les billes de nettoyage de l’ADN pour les resuspendre complètement et ajouter un volume égal à 0,7 fois le volume d’échantillon accumulé.

Mélangez la solution d’échantillon de billes et faites-la incuber sur un HulaMixer à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, pour préparer deux millilitres d’éthanol à 80 %, mélangez 1 600 microlitres d’éthanol pur avec 400 microlitres d’eau sans nucléase. Placez le tube sur un support magnétique pendant cinq minutes jusqu’à ce que l’éluat paraisse clair et incolore.

Ensuite, retirez et jetez le surnageant sans déranger la boule. Lavez les billes avec 700 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % et centrifugez brièvement le tube. Après avoir placé le tube sur la grille magnétique, retirez l’éthanol résiduel.

Maintenant, retirez le tube du support magnétique. Résuspendez les billes dans 35 microlitres d’eau sans nucléase par un léger mouvement et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retournez le tube dans la crémaillère magnétique jusqu’à ce que l’éluat devienne clair et incolore.

Ensuite, transférez 35 microlitres de l’éluate dans un tube propre de microcentrifuge de 1,5 millilitre pour une utilisation ultérieure. Pour la ligation de l’adaptateur, mélangez les composants donnés dans un tube microcentrifuge à faible liaison de 1,5 millilitre. Centrifugez brièvement le tube et incubez à température ambiante pendant 20 minutes.

Transformez les billes de nettoyage de l’ADN pour les resuspendre complètement. Ajoutez 20 microlitres de billes dans le tube et mélangez doucement. Incubez sur un HulaMixer pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pour pelleter les billes et aspirer le surnageant sans déranger le pellet. Ajoutez 125 microlitres de tampon à fragments courts et faites légèrement tourner le tube pour resuspendre les billes. Centrifugez brièvement et remettez le tube dans la crémaillère magnétique.

Aspirez à nouveau le surnageant après que les billes se soient pelletées. Maintenant, retirez le tube du support magnétique et resuspendez les billes dans 15 microlitres de tampon d’élution en pipettant ou en faisant un léger cliquetisement. Centrifugez brièvement le tube pour collecter le contenu, puis incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour éluer l’ADN.

Placez le tube sur une grille magnétique jusqu’à ce que l’éluat soit clair et incolore. Ensuite, aspirez 15 microlitres d’éluate et transférez-les dans un tube propre de microcentrifuge de 1,5 millilitre. Pour préparer la solution d’amorçage de la cellule de flux, mélangez soigneusement les composants donnés.

Ouvrir le port d’amorçage de la cellule de flux, aspirer environ 20 microlitres de tampon pour éliminer les bulles d’air, et charger 800 microlitres de mélange d’amorçage dans le port sans introduire de bulles d’air. Pour préparer la bibliothèque d’ADN, mélangez soigneusement les composants affichés à l’écran. Soulevez doucement le bouchon du port d’échantillon de la cellule de flux, chargez 200 microlitres de mélange d’amorçage dans le port sans introduire de bulles d’air.

Après avoir mélangé la bibliothèque d’ADN préparée, chargez 75 microlitres de la bibliothèque goutte par goutte dans le port d’échantillonnage de la cellule de flux de séquençage. Fermez le bouchon du port d’échantillon de la cellule de flux, en veillant à ce que le bouchon entre bien dans le port d’échantillon, puis fermez fermement le port d’amorçage. L’électrophorèse sur gel a confirmé l’intégrité de l’amplicon sur presque tous les échantillons, mais les voies correspondant aux échantillons 89 et 136 présentaient des bandes faibles ou absentes.

Les échantillons 89 et 136 présentaient des concentrations d’amplicons insuffisantes, ce qui a conduit à leur exclusion du séquençage à lecture longue. Sur tous les gènes ciblés, les plateformes à lecture longue et courte ont atteint des profondeurs de couverture élevées, le gène EIS affichant les valeurs moyennes les plus élevées et le gène RRS les plus faibles profondeurs de couverture. Malgré la profondeur de couverture, les deux plateformes ont maintenu une large portée de couverture élevée de 99,9 % sur tous les gènes associés à la résistance.

Des variants de résistance aux médicaments pour l’éthambutol, les fluoroquinolones, la kanamycine, l’amikacine et la capréomycine ont été détectés avec une concordance de 100 % sur les plateformes de séquençage à lecture courte et longue. Aucune mutation associée à la résistance n’a été trouvée pour le linézolide, la bédaaquiline et la clofazimine utilisant l’une ou l’autre approche de séquençage. La détection de résistance à la streptomycine a montré une concordance plus faible entre les plateformes, avec seulement 71,43 % d’accord.

La sensibilité à la détection des gènes clés rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA et pncA variait de 89,47 % à 96,77 % entre les plateformes.