Name: Extrémité 3 séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Découvrez la préparation de bibliothèques A-seq2 pour séquencer les extrémités 3' de l'ARNm et étudier le clivage et la polyadénylation. Cette méthode évite les dimères d'adaptateurs et permet la quantification de l'expression génique.

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Les auteurs remercient Mme Béatrice Dimitriades pour aide à la culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par la Swiss National Science Foundation subventions #31003A_170216 et 51NF40_141735 (NCCR RNA &#38; maladie).

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La multitude de base et des facteurs auxiliaires qui sont impliqués dans le traitement de l’ARN pré-messager 3' extrémité se reflète dans un paysage de polyadénylation proportionnellement complexes. En outre, polyadénylation est également sensible aux changements dans d’autres processus tels que la transcription et épissage. sites de clivage d’extrémité 3' en pré-ARNm sont généralement identifiés basé sur la queue poly (a) typiques qui est ajoutée aux produits de clivage 5'. La plupart des méthodes utilisent des amorces oligo (décollement) de longueurs variables qui permettent la conversion spécifique de poly (A)-contenant des ARNm d’ADNc dans une réaction de transcription inverse. Un problème commun de cette approche est l’amorçage interne aux séquences riches en A aboutissant à des sites de clivage artifactual. Deux méthodes qui visent à contourner cet artefact au stade de la préparation de l’échantillon ont été proposées. Dans la méthode 3P-seq 1, adaptateurs sont spécifiquement ligaturés jusqu’aux extrémités de la queue poly (a) avec l’aide d’un attelle oligo suivi d’une digestion partielle RNase T1 et transcriptase inverse avec TTP dans la réaction comme les désoxyribonucléosides seul. L’hétéroduplex poly(A)-poly(dT) qui en résultent est ensuite digérés avec RNase H et les autres fragments d’ARN sont isolés, ligaturés aux adaptateurs et séquencés. Une méthode plus simple et élégante, 2p-seq, qui utilise un apprêt de séquençage personnalisé sauter le tronçon restant d’oligo (décollement) dans la réaction de séquençage a été rapporté par les mêmes auteurs 2. Dans une méthode associée, 3' lit 3, un apprêt inhabituellement long de 5 45 et nous Ts, contenant également un biotine sont recuits à l’ARN fragmenté, suivie par des lavages strictes pour sélectionner des molécules d’ARN avec queue poly (a) de plus de 50 nucléotides. Bien que 3' lectures réduit considérablement la fréquence de l’amorçage interne, il n’élimine pas complètement il 3. Protocoles pour le séquençage direct de RNA ont également été proposées, mais les lectures qui en résultent sont courtes et ont un taux élevé d’erreur et cette approche n’a pas été davantage développés 18,19,20. La PolyA-Seq et les protocoles Quant Seq commercialisés combinent oligo (décollement) fondé d’amorçage avec une étape d’amorçage aléatoire pour le deuxième brin synthèse de cDNA 20. L’utilisation de la réaction de transcription inverse de commutateur de modèle avec la transcriptase inverse du Virus de la leucémie Murine Moloney (MMLV) conduit à la génération d’ADNc avec linkers en une seule étape et ainsi aucune dimères d’adaptateur ne peuvent apparaître dans le PAS-Seq et méthodes SAPAS 21 , 22.
La méthode A-seq2 présentée ici se distingue par son utilisation d’un nucléotide CLIVABLES (dU) au sein d’une couche d’apprêt biotinylé oligo (décollement). Cette modification combine l’utilité d’enrichir les oligo (décollement) hybridé, polyadénylé cibles avec le retrait de la majeure partie de la séquence de25 oligo (dT) des fragments isolés avant que les bibliothèques sont préparés et la préservation des trois Ts, qui indiquer la présence antérieure de la queue poly (a). En revanche, les méthodes qui utilisent la RNase H pour retirer poly (a) les molécules d’ARN au hasard laissent plusieurs comme. Étant donné que dans A-seq2, séquençage est fait à partir de l’extrémité 3' des brins anti-sens, sites de clivage sont prévus pour être situé après le motif NNNNTTT au début de la séquence brute se lit. Les tétramères aléatoires servent non seulement à permettre à base appelant mais aussi dans l’élimination d’artefacts d’amplification PCR. UMIs plus longues peuvent être hébergés. La possibilité d’amorçage interne reste en A-seq2 et est adressée par le calcul, tout d’abord, en jetant 3' se termine par une séquence en aval génomiquement codé, riches en A et ensuite en jetant des grappes d’extrémité 3' qui pourraient s’expliquer par l’amorçage interne à la Signal de poly (a) riches en A lui-même. Une récente analyse des sites de poly (a) déduit de manière unique par un grand nombre de protocoles indique que les sites qui sont propres à A-seq2 ont la distribution attendue nucléotides et l’emplacement dans les gènes, semblables aux autres 3' fin des protocoles de séquençage.
Une étape cruciale dans l’A-seq2 est la sélection de polyadénylé RNA et la suppression des ARN ribosomiques et divers petits ARN. C’est plus facilement réalisable par un kit d’isolation des ARNm avec oligo (dT)25 billes magnétiques. En principe, les ARN total isolé avec du phénol contenant des solutions aussi donne ARN qui peut être encore soumis à la sélection par le kit d’ARNm-isolation ou d’agarose oligo (dT) de haute qualité. Une étape qui peut être variée en A-seq2 est le traitement par hydrolyse alcaline qui peut être raccourcie ou prolongée pour obtenir des fragments d’ARN de différentes tailles. Critique est aussi que l’ajout de dATP 3' à 3' extrémités des fragments d’ARN par la poly (a) polymérase est efficace. Dans le protocole décrit ici, ce traitement est appliqué à tous les fragments d’ARN, d’éviter les concatemerization au cours de la réaction de ligature. Enfin, nous notons que, bien que ligase RNA 1 est normalement utilisé comme une ligase RNA, il ligates aussi efficacement seul ADN bicaténaire, comme nous l’avons fait ici pour ligaturer un adaptateur à l’extrémité 5' des molécules de cDNA.
A-seq2 est donc un efficace et facile à mettre en œuvre le protocole d’identification des sites de traitement l’extrémité 3' pré-ARNm. Les développements futurs pourraient inclure réduisant davantage la complexité du protocole et de la quantité de matériel requis. Jeu d’outils d’analyse des données informatiques davantage associé permettent le traitement homogène de l’extrémité 3' séquençage lectures obtenues avec un large éventail de protocoles.

La capture et le séquençage d’ADN messagère 3' extrémités permet l’étude du traitement de l’ARNm et la quantification de l’expression génique. En raison de leur queue poly (a), ARNm eucaryotes peut être efficacement épuré de lysats cellulaires totales avec perle-immobilisé oligo-deoxythymidine (molécules de oligo(dT)), qui peut également amorcer la synthèse d’ADNc. Toutefois, cette approche présente deux inconvénients. Tout d’abord, s’étend de A qui sont internes aux transcriptions peut également amorcer la synthèse de cDNA, résultant dans des sites parasites poly (a). Deuxièmement, homogène, poly (a) s’étire pose des défis spécifiques pour le séquençage, mis à part ne pas être instructif pour l’identification de la transcription. Différentes approches ont été proposées pour contourner ces limitations, telles que la transcription renversée par le biais de poly (a) queues suivies par digestion RNase H (3P-seq 1), utilisation d’un apprêt de séquençage personnalisé se terminant par 20 Ts (2p-seq 2), présélection des Fragments d’ARN avec queue poly (a) de plus de 50 nucléotides avec un apprêt de45 CU5T suivie de RNase H digestion (lectures de 3' 3) et l’utilisation d’un apprêt d’oligo-dT qui contient l’adaptateur 3' dans une épingle à cheveux (A-seq 4).
L’A-seq2 récemment mis au point la méthode 5 a pour but de contourner la séquence poly (a) et en même temps pour réduire au minimum la proportion de dimères qui sont générés par l’individu-ligature des adaptateurs, survenant en particulier lorsque la concentration molaire d’adaptateurs l’emporte sur la concentration de l’insert. Ce problème peut être éliminé lorsque les deux adaptateurs sont ligaturés au même type de polynucléotide se termine comme dans A-seq2, où les adaptateurs 3' sont ligaturés à l’extrémité 5' de fragments d’ARN et les adaptateurs de 5' à 5' extrémités des ADNc après transcription inverse. La méthode est plus pratique que notre A proposé antérieurement-seq - dont le séquençage a été dans la 5'-3' direction exigeant donc précisément contrôlée RNA fragmentation-, tout en conservant une grande précision de poly (a) identification des sites. Environ 80 % de du est séquencé en échantillons typiques carte unique au génome et conduire à l’identification de plus 20 000 grappes site de poly (a), plus de 70 % de qui recoupait annoté 3' UTR.
En bref, le protocole A-seq2 commence par la fragmentation de l’ARNm et ligature des adaptateurs inverse-complément 3' à l’extrémité 5' des fragments d’ARN. Poly (A)-ARN contenant rétroconcevez puis transcrit avec un apprêt d’oligo (décollement) long de 25 nucléotides (nt) qui contient un nucléotide de l’ancre à l’extrémité 3', un à la position 4 et un biotine à l’extrémité 5', permettant la liaison de l’ARNC aux billes magnétiques streptavidine. La plupart de l’amorce, y compris la biotine, est retiré de l’ADNc par clivage à par la composition de l’enzyme utilisateur contenant l’uracile DNA glycosylase (UDG) et le DNA glycosylase-lyase endonucléase VIII. Cette réaction laisse intacte se termine pour la ligature d’un adaptateur 5' et la gauche Ts trois après clivage reste pour marquer l’emplacement de la queue poly (a). Car les adaptateurs 5' et 3' sont fixées par ligature aux extrémités 5' destinataire, aucune dimères d’adaptateur ne sont générés. Quatre nucléotides aléatoire-mers a présenté au début de lectures permet la résolution de cluster sur les instruments de séquençage de l’état-of-the-art et peuvent aussi servir d’identificateur moléculaire unique (UMI) pour la détection et la suppression des artefacts d’amplification PCR. La taille de l’UMI peut être encore augmentée comme fait dans d’autres études 6. Le protocole génère les lectures qui sont inverser complémentaire de l’ARNm 3' extrémités, tout départ avec un tétramère randomisé suivi 3 Ts. traitement des lectures qui ont les 3 Ts diagnostiques à leur extrémité commence de 5' avec la correction des artefacts d’amplification PCR par exploiter les UMIs, suppression de séquences de 3' adaptateur et inverser la complémentation. Lectures qui peuvent provenir de d’amorçage oligo (décollement) à des sites riches en A internes sont également identifiés par le calcul et mis au rebut. Les fausses sites manquent généralement de l’un des 18 bien caractérisés et signaux conservés poly (a) qui devraient être situé ~ 21 nucléotides en amont du clivage apparent site 7.
Le protocole exige environ 8 h de temps pratique, sans compter la culture cellulaire et les ligature des trompes pendant la nuit. Les associés lire analyse logiciel permet une identification de site de haute précision poly (a). Sur le site de poly (a) grappes créé sur 4 échantillons davantage mis en évidence dans ce manuscrit (deux réplicats biologiques des siARN contrôle et des cellules traitées au TR-HNRNPC) 84 % de chevauchement avec un gène annoté et, sur ce, 75 % de chevauchement avec un 3' UTR et 86 % soit avec un 3' UTR ou un terminal exon. Le coefficient de corrélation de Pearson d’expression des extrémités 3' dans les échantillons est de 0,92 et valeurs de plus de 0,9 sont généralement obtenus par la méthode. A-seq2 est donc une méthode pratique qui donne des résultats très reproductibles.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra pur</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin triphosphate (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à faible liaison d’ADN, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green colorant</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>utiliser 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 ou NextSeq 500 séquenceurs de nouvelle génération</td><td>Illumina</td><td>se renseigner auprès du fournisseur</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymérase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymérase, levure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymérase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucléotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>Purification Kit Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction</td> Kit <td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, haute concentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>comprend PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit de nettoyage de l’ARN</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, inhibiteur de ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV transcriptase inverse</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme</td><td>mix New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 rack magnétique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Mélangeur chauffant avec couvercle chauffant</td></tr><tr><td>Colonnes MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline tampon d’hydrolyse, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 partie de 0,1 M Na2CO3 et 9 parties de 0,1 M NaHCO3. Ajouter de l’EDTA à 1 mM. Ajustez le pH à 9,2. Stocker les aliquotes à -20 °C.</td></tr><tr><td>5x tampon poly(A) polymérase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA acétylé, 50 % glycérol</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de liaison à la biotine</td><td>20 mM Tris&shy ; Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1 % NP&shy ; 40</td></tr><tr><td>DIX tampon</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&shy ; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02 % NP&shy ; 40</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Sequence</strong</td></tr><tr><td>>Oligonucléotides selon Illumina TruSeq Small RNA Preparation Kits Kits, pour séquenceurs GA-IIx et Hiseq2000/2500</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (ARN)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy ; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&shy ; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy ; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, amorce RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A ou C)</td></tr><tr><td>Amorce PCR avant, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>amorce inversée, RPI1, code-barres en gras</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Oligonucléotides selon Illumina TruSeq HT-Small Kits de préparation d’échantillons d’ARN, pour séquenceurs HiSeq2000/2500 et NextSeq500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (ADN/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, amorce RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotine-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'</td></tr> <tr><td>Amorces PCR avant (D501-506)</td><td>Microsynth ou Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTTTCCGATCT -3'Amorces</td></tr> <tr><td>PCR inverses (D701-D712)</td><td>Microsynth ou Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Documentation</td></tr> <tr><td>pour le multiplexage Illumina</td> :<td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec a-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Études dans la dernière décennie ont révélé une variété complexe et dynamique de clivage de l’ARN pré-messager et réactions de polyadénylation. ARNm avec longues régions 3' non traduite (RTNS) est générés dans les cellules différenciées tandis que les cellules en prolifération expriment préférentiellement transcrits avec court 3' UTR. Les auteurs décrivent le protocole A-seq, maintenant à sa deuxième version, qui a été développé pour cartographier les sites de polyadénylation génome et étudier la régulation de l’ARN pré-messager 3' fin au traitement. Ce protocole actuel tire également parti de la polyadénylate (poly(A)) de queues qui sont ajoutés au cours de la biogenèse des mammifères plus mRNA d’enrichir à l’ARNm fully-Process. Un adaptateur d’ADN avec deoxyuracil à sa quatrième position permet le traitement précis des ARNm 3' fragments terminaux pour le séquençage. Non compris la culture de cellules et les ligature des trompes au jour le jour, le protocole exige environ 8 h de temps pratique. Avec elle, un logiciel facile à utiliser pour l’analyse des données dérivées de séquençage est fourni. A-seq2 et le logiciel d’analyse associés fournissent une solution efficace et fiable pour le mappage d’un pré-ARNm 3' se termine par un large éventail de conditions, de 106 ou moins de cellules.

Poly (A)-contenant ARN a été isolé dans des cellules cultivées, fragmentés par hydrolyse alcaline et d’ADNc ont été faites par reverse transcription avec des amorces oligo (décollement). Le cDNA qui en résulte a été immobilisé sur des billes de streptavidine, dU a été coupée dans la réaction de l’excision spécifique uracile, adaptateurs ont été ligaturés à 5' et 3' extrémités le fragment clivé et les inserts ont été séquencées. La figure 1 illustre un aperçu graphique de l’expérience.
Pour les cellules HeLa et HEK293, 106 cellules étaient suffisantes pour identifier les sites de poly (a) pour la grande majorité des gènes codant pour des protéines à la fin de la procédure. Toutefois, pour d’autres types de cellules ou de tissus, qu'il peut être nécessaire tester la saturation du nombre de sites identifiés poly (a) le nombre de cellules utilisées dans l’expérience augmente. Les résultats représentatifs du pilote PCR étape et le fragment d’ADN analyse de l’échantillon avant de séquençage sont indiquées à la Figure 2.
La figure 3 montre les étapes de pré-traitement de l’analyse computationnelle, à partir du fichier fastq obtenu à partir du séquenceur et se terminant avec les qualité-vérifié, garnis d’adaptateur des lectures qui sont prêts à être mappé au génome. La figure 4 illustre les étapes de l’analyse qui commencent par la cartographie les lectures et le génome correspondant et la fin avec le catalogue de l’extrémité 3' des ARNm sites identifiés dans un échantillon donné de traitement. Si plusieurs échantillons sont analysées, des étapes supplémentaires sont effectués pour correspondre à l’extrémité 3' des sites qui ont été trouvées dans des échantillons individuels de traitement et de signaler leur abondance dans les trois échantillons. Ces étapes sont indiquées à la Figure 5.
Ainsi, une fois les échantillons ont été séquencés, l’analyse de la séquence résultante lire des fichiers (au format fastq) via le pipeline de traitement disponible est simple. Après avoir ajouté les informations sur les exemples pour le fichier de configuration, l’exécution du pipeline se traduira par deux principaux types de fichiers de sortie : 1) lit les fichiers avec toutes les 3' finissent traitement sites identifiés dans des échantillons individuels (par exemple » « « « sample1.3pSites.noIP.Bed.gz ») et 2) lit un fichier avec tous les clusters de sites de poly (clusters.merged.bed) dans l’ensemble de tous les échantillons de l’étude. La sortie inclut également les coordonnées du génome pour toutes les lectures de chaque échantillon individuel (par exemple « sample1. STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.BAM ») qui peuvent plus tard être affichés dans un navigateur de génome comme IGV16. Inspection visuelle des lecture ou les profils fournit généralement un premier aperçu de la répartition des sites de poly (a) dans le génome et les changements qui se produisent lors de perturbations spécifiques qui ont été réalisées dans l’étude. Par exemple, dans la Figure 6 , la réponse d’un gène spécifique à la précipitation de la protéine HNRNPC est montrée.
Synthèses de ces distributions de Génome-large sont également fournis (tableau 1). Spécifiquement, les fichiers de sortie dans le répertoire « comtes/annotation_overlap » contiennent des fractions de sites qui se chevauchent avec caractéristiques annotés (du gtf fichier fourni comme entrée ; annotés sont : 3' UTR, terminal exon, exon, intron, intergénique). Enfin, pour chaque échantillon, les résultats des étapes de transformation individuelles sont également enregistrés (par exemple « sample1.summary.tsv »). Cela inclut les numéros de : lectures brutes dans chaque échantillon, les lectures qui ont la structure attendue de l’extrémité 5', les lectures qui restent après l’effondrement complets doublons PCR, lit de haute qualité selon les critères définis à l’étape 9.2, lit cette carte unique au génome (après l’effondrement de celles qui résultent d’erreurs de séquençage, reportez-vous à l’étape 9,5), multi-cartographie lit (après l’effondrement de celles qui résultent d’erreurs de séquençage, reportez-vous à l’étape 9,5), sites à chaque extrémité de l’échantillon, brut 3' sites de traitement de traitement brut (non ordonné en clusters) 3' fin sans les candidats potentiels internes d’amorçage, unique 3' fin des sites de traitement de tous les échantillons sans candidats internes d’amorçage et ensemble de clusters sites poly (a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : étapes principales du protocole A-seq2. Différentes étapes sont indiquées sur le côté gauche de la figure. Fragments d’ARN INSERT sont dépeints comme des lignes vertes qui rougissent pour ADNc après transcription inverse ; les adaptateurs sont colorés en bleu ou en orange. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figure 2 : pilote PCR et profil du produit final. (un) aliquotes de la réaction PCR ont été prélevés à des cycles différents et séparés sur gel d’agarose de 2 %. Les nombres à gauche indiquent taille dans des bandes respectives dans l’échelle de l’ADN, les nucléotides. Dans cette expérience, 12 cycles (*) ont été choisis pour la réaction de PCR à grande échelle. (b) exemple d’un échantillon après sélection de la taille sur un analyseur de taille de fragment révélant une taille moyenne d’environ 280 nucléotides. Les nombres à gauche [FU] indiquent intensité du signal relatif. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figure 3 : contour de pré-traitement du séquençage lectures. Les fichiers fastq avec des lectures qui sont générés par le logiciel de séquençage instrument-associés sont traités afin d’identifier des lectures de qualité qui seront mappés au génome correspondant. La figure illustre la spécification d’entrée/sortie des étapes individuelles dans le pipeline, avec des liens vers les différentes étapes du protocole décrit dans la section « Informatique ». <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figure 4 : schéma de séquence lire traitement, de l’étape de la cartographie au génome de la génération de l’extrémité 3' des sites de traitement. La figure illustre la spécification d’entrée/sortie des étapes individuelles dans le pipeline, avec des liens vers le iindividuel des mesures du protocole décrit dans la section « Informatique ». Le fichier de sortie principal qui est remis à l’utilisateur est marqué en gras. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figure 5 : aperçu des mesures qui sont prises pour produire des grappes de co réglementé 3' fin séquençage sites. La figure illustre la spécification d’entrée/sortie des étapes individuelles dans le pipeline, avec des liens vers les différentes étapes du protocole décrit dans la section « Informatique ». Le fichier de sortie principal est marqué en gras. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figure 6 : résultats d’exemple du profil de 3' finissent traitement lectures le long du terminal exon du gène NUP214, affiché dans l’Explorateur de génome IGV 16 . A-seq2 lectures ont été préparés à partir de deux échantillons de cellules HEK 293, traitées avec un siARN contrôle- ou avec un siARN HNRNPC. Le lit que documenté poly (a) les sites qui ont été annotés par le pipeline de l’analyse ont été enregistrés au format BAM qui a été utilisé comme entrée dans le navigateur de génome IGV. L’extrémité 3' des pics lecture carte d’ARNm 3' extrémités qui sont annotées dans Ensembl. Les profils montrent une utilisation accrue de l’isoforme longue de 3' UTR sur HNRNPC précipitation. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>TR-contrôle répliquer 1</td>
			<td>TR-contrôle répliquer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID : 29765</td>
			<td>ID : 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nombre de lectures brutes</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nombre de lectures valides après parage et filtrage</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nombre de cartographie unique lectures</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nombre de lectures mappage à plusieurs loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nombre d’extrémité individuel 3' sites de traitement</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : exemple de sortie du pipeline analyse. Synthèses de lectures qui ont été obtenus à différentes étapes.

Ce protocole décrit une méthode de cartographie pré-ARNm ' extrémité 3 sites de traitement.

Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

L'objectif général de cette méthode est de capturer et de séquencer les extrémités 3' des ARNm, permettant ainsi l'étude du traitement des ARNm, en particulier le clivage et la polyadénylation des extrémités 3', ainsi que la quantification de l'expression des gènes. Le protocole A-seq2 et le package d'analyse des données présentés ici peuvent aider à répondre à des questions clés concernant la génération et la fonction des isoformes transcriptomiques dans différents types cellulaires et tissus. Les principaux avantages de la méthode A-seq2 sont qu'elle évite le séquençage de longues séquences poly(A) et qu'elle ne génère pas de dimères d'adaptateurs.Les cellules cultivées à une confluence de 80 % sont utilisées pour cette procédure. Retirer le milieu de croissance et laver les cellules une fois avec du PBS. Lysér immédiatement les cellules dans la plaque en ajoutant un millilitre de tampon de lyse par puits et en utilisant une spatule en caoutchouc pour détacher complètement les cellules de la surface de la plaque.Utilisez une pipette d'un millilitre pour transférer le lysat visqueux de chaque puits dans un tube en plastique de 15 millilitres. Homogénéisez l'ADN à l'aide d'une seringue d'un millilitre fixée à une aiguille hypodermique de calibre 23. Effectuez plusieurs mouvements vigoureux de va-et-vient du piston jusqu'à ce que le lysat ne soit plus visqueux.Transférez le lysat dans un tube de 1,5 millilitre. Faites centrifuger à 20 000 ×g et à 4 °C pendant cinq minutes afin d’éliminer les débris. Récupérez le surnageant clair du lysat.Ajouter aux billes magnétiques oligo d(T)25 et resuspendre le mélange. Placer les tubes sur une roue rotative pendant 10 minutes. Ensuite, placer les tubes sur un support magnétique pendant deux minutes.Éliminer le liquide clair. Ajouter 0,8 millilitre de tampon A dans chaque tube et retourner le tube de 180 degrés deux à trois fois. Retirer le tampon A du deuxième lavage.Ajouter 0,8 millilitre de tampon B dans chaque tube et laisser sur la paillasse pendant deux minutes. Pour éluer l'ARNm fixé sur les billes, retirer le tampon B, ajouter 33 microlitres d'eau dans chaque tube, puis resuspendre les billes. Chauffer à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc chauffant.Immédiatement, centrifuger les tubes pendant une seconde puis les placer sur le support magnétique. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 66 microlitres de tampon d'hydrolyse alcaline dans chaque tube, mélanger et chauffer à 95 degrés Celsius pendant exactement cinq minutes sur un bloc chauffant.Refroidissez immédiatement les tubes sur de la glace. Ensuite, effectuez l'isolement de l'ARN à l'aide d'un kit de purification de l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer cette procédure, ajoutez à chaque échantillon d'ARN 14 microlitres d'un mélange maître de polynucléotide kinase.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, charger les réactions de kinase sur des colonnes à centrifuger préparées. Centrifuger les colonnes à 735 fois g pendant deux minutes.Jetez les colonnes et placez les tubes contenant les réactions recueillies sur de la glace. Pour bloquer les extrémités trois primes des fragments d'ARN afin d'éviter leur concatémérisation lors des réactions de ligature ultérieures, ajoutez à chaque échantillon 17,5 microlitres d'un mélange maître poly(A)polymérase. Mélangez et centrifugez pendant une seconde.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, ajouter 32,5 microlitres d'eau à chaque réaction et purifier l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Commencer cette procédure en plaçant les réactions dans un concentrateur sous vide pendant 10 minutes, afin de réduire le volume à six microlitres.Ensuite, ajouter à chaque réaction 24 microlitres d'un mélange maître d'ARN ligase. Incuber les réactions dans un mélangeur chauffant à 24 degrés Celsius pendant 16 heures, avec un mélange intermittent à mille tr/min. Le jour suivant, ajouter 17 microlitres d'eau à chaque réaction et mélanger.Purifiez l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Placez les éluats dans un concentrateur sous vide pendant trois minutes, afin de réduire le volume à 11 microlitres. Transférez les réactions dans des tubes PCR de 200 microlitres pour la réaction de transcription inverse.Ajouter un microlitre d'amorce. Chauffer à 70 degrés Celsius dans un thermocycleur PCR pendant cinq minutes, puis laisser à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter huit microlitres d'un mélange maître de transcription inverse dans chaque tube et mélanger.Placer les tubes dans un thermocycleur. Chauffer à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes supplémentaires. Maintenir sur de la glace.Préparez les billes de streptavidine, comme décrit dans le protocole écrit. Ajoutez la réaction de transcription inverse à la solution de billes et incubez à quatre degrés Celsius sur une roue rotative pendant 20 minutes. À l’aide d’un support magnétique, lavez les billes deux fois avec du tampon de liaison à la biotine et deux fois avec du tampon TEN.Resuspendre les billes dans 50 microlitres de tampon TEN. Ajouter deux microlitres de mélange enzymatique d'uracile ADN glycosylase et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure dans un agitateur, avec un mélange intermittent. Ajouter 50 microlitres d'eau, 11 microlitres de tampon RNase H et un microlitre de RNase H à chaque réaction.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Placer les tubes sur le support magnétique et transférer le liquide contenant l'ADNc clivé vers un nouveau tube. Purifier l'ADNc clivé à l'aide d'un kit de purification PCR, comme décrit dans le protocole écrit.Placer l'ADNc purifié dans un concentrateur sous vide pendant huit minutes afin de concentrer le volume à sept microlitres. Pour ligaturer les adaptateurs en 5' aux extrémités 5' de l'ADNc isolé, ajouter à chaque échantillon 23 microlitres d'un mélange maître de ligase à ARN et incuber à 24 degrés Celsius pendant 20 heures. Enfin, ajouter 70 microlitres d'eau à chaque réaction.Une PCR pilote est réalisée pour déterminer le nombre optimal de cycles de PCR permettant d'atteindre l'amplification de la bibliothèque durant la phase exponentielle. Pipeter les éléments suivants dans un tube PCR de 200 microlitres : 25 microlitres de mélange de polymérase à ADN, 20 microlitres de réaction de ligation, deux microlitres d'eau, 1,5 microlitre d'amorce PCR directe et 1,5 microlitre d'amorce d'index PCR inverse. Exécuter le thermocycleur selon le programme suivant : trois minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 20 cycles de 20 secondes à 98 degrés Celsius, 20 secondes à 67 degrés Celsius et 30 secondes à 72 degrés Celsius.Prélevez des aliquotes de sept microlitres directement à partir du thermocycleur, après les cycles indiqués. Séparez les produits sur un gel d'agarose à 2 % et visualisez la migration des produits de PCR. Déterminez le nombre de cycles correspondant au début de l'amplification exponentielle, 12 cycles dans cet exemple, et utilisez ce nombre de cycles pour une réaction de PCR à grande échelle.Séparer les produits de la réaction PCR à grande échelle sur un gel d'agarose à 2 % et exciser les tranches de gel contenant les produits d'ADN de 200 à 350 nucléotides. Ensuite, extraire l'ADN des tranches de gel à l'aide du kit d'extraction de gel, comme décrit dans le protocole écrit. Seules les étapes informatiques les plus importantes seront montrées dans cette vidéo.Plus de détails sont disponibles dans le protocole textuel. Commencez par cloner le dépôt Git et accédez au répertoire nouvellement créé. Créez un environnement contenant les logiciels puis activez cet environnement.Téléchargez la séquence du génome de l'organisme à partir duquel les données A-seq2 ont été obtenues. Ouvrez le fichier de configuration et définissez les paramètres d'entrée, comme indiqué dans le protocole textuel. Lancez l'analyse.La réponse d'un gène spécifique, NUP214, à l'extinction de la protéine HNRNPC, a été examinée en analysant les lectures a-seq2 provenant de deux échantillons de cellules HEK-293, traitées soit avec un ARN interférent contrôle, soit avec un ARN interférent ciblant HNRNPC. Les lectures ayant documenté les sites poly(A) annotés par le pipeline d'analyse ont été sauvegardées au format BAM, utilisé ensuite comme entrée pour le navigateur génomique IGD. Les extrémités trois prime des pics de lectures correspondent aux extrémités trois prime des mARN annotées dans Ensemble.Les profils indiquent une utilisation accrue de l'isoforme longue de l'UTR 3' après l'extinction de HNRNCR. Une fois maîtrisé, le protocole A-seq nécessite huit heures de travail actif, soit environ deux à trois jours, sans compter le temps de culture cellulaire et les ligations nocturnes. Lors de la mise en œuvre du protocole, il est important de concevoir au préalable un jeu d'amorces conforme à la plateforme de séquençage utilisée dans votre laboratoire.Une fois que vous avez obtenu les extrémités 3' de l'ARNm, d'autres méthodes, comme le cross-linking et l'immunoprécipitation, peuvent être réalisées afin d'identifier les régulateurs du traitement des extrémités 3' des pré-ARNm. La méthode A-seq2 a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du traitement de l'ARN, leur permettant d'explorer la régulation et les conséquences de la polyadénylation alternative dans des types cellulaires individuels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des bibliothèques d'extrémités 3' de l'ARNm, d'analyser vos données de séquençage, d'identifier de nouveaux sites de polyadénylation et de quantifier leur utilisation.Nous espérons que A-seq2 facilitera votre travail sur le démarrage de la régulation du traitement des ARNm et mènera à de nombreuses nouvelles découvertes.

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