Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

L’objectif global de cette méthode est de capturer et de séquencer trois extrémités premières de l’ARNm, permettant ainsi des études du traitement de l’ARNm, en particulier le clivage et la polyadénylation des trois extrémités principales, ainsi que la quantification de l’expression génique. Le protocole A-seq2 et le package d’analyse de données présentés ici peuvent aider à répondre à des questions clés sur la génération et la fonction des isoformes de transcrits dans différents types de cellules et de tissus. Les principaux avantages de la méthode A-seq2 sont qu’elle évite le séquençage à travers de longs poly(A)étirements et qu’elle ne génère pas de dimères adaptateurs.

Des cellules cultivées à 80 % de confluence sont utilisées pour cette procédure. Retirez le milieu de croissance et lavez les cellules une fois avec du PBS. Lysez directement les cellules sur la plaque en ajoutant un millilitre de tampon de lyse par puits et en utilisant une spatule en caoutchouc pour détacher complètement le matériau cellulaire de la surface de la plaque.

À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, transférez le lysat visqueux de chaque puits dans un tube en plastique de 15 millilitres. Partagez l’ADN avec une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille hypodermique de calibre 23. Effectuez plusieurs mouvements vigoureux de haut en bas du piston, jusqu’à ce que le lysat ne soit plus visqueux.

Transférez le lysat dans un tube de 1,5 millilitre. Faites tourner à 20 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour enlever les débris. Prélever le surnageant clair du lysat.

Ajouter aux billes magnétiques oligo d(T)25 et remettre le mélange en suspension. Placez les tubes sur une roue rotative pendant 10 minutes. Ensuite, placez les tubes sur une grille magnétique pendant deux minutes.

Retirez le liquide clair. Ajoutez 0,8 millilitre de tampon A dans chaque tube et tournez le tube de 180 degrés deux à trois fois. Retirez le tampon A du deuxième lavage.

Ajoutez 0,8 millilitre de tampon B dans chaque tube et laissez sur la grille pendant deux minutes. Pour éluer l’ARNm lié des billes, retirez le tampon B, ajoutez 33 microlitres d’eau dans chaque tube et remettez les billes en suspension. Chauffer à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc à cœur.

Immédiatement, faites tourner les tubes pendant une seconde et placez-les sur le support magnétique. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez 66 microlitres de tampon d’hydrolyse alcaline dans chaque tube, mélangez et chauffez à 95 degrés Celsius pendant exactement cinq minutes sur un bloc chauffant.

Refroidissez immédiatement les tubes sur de la glace. Par la suite, effectuez l’isolement de l’ARN à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN, comme décrit dans le protocole texte. Pour commencer cette procédure, ajoutez à chaque échantillon d’ARN 14 microlitres d’un Master Mix polynucléotidique kinase.

Incuber à 37 degrés Celsius, pendant 30 minutes. Après 30 minutes, chargez les réactions kinases sur des colonnes de spin préparées. Faites tourner les colonnes à 735 fois g pendant deux minutes.

Jetez les colonnes et placez les tubes avec les réactions recueillies sur de la glace. Pour bloquer les trois extrémités premières des fragments d’ARN afin d’éviter leur concatémérisation dans les réactions de ligature ultérieures, ajoutez à chaque échantillon 17,5 microlitres d’un Master Mix poly(A)polymérase. Mélangez et tournez pendant une seconde.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, ajoutez 32,5 microlitres d’eau à chaque réaction et purifiez l’ARN, comme décrit dans le protocole de texte. Commencez cette procédure en plaçant les réactions dans un concentrateur sous vide pendant 10 minutes, afin de réduire le volume à six microlitres.

Ajoutez ensuite à chaque réaction 24 microlitres d’un Master Mix d’ARN ligase. Incuber les réactions sur un mélangeur chauffé à 24 degrés Celsius pendant 16 heures, avec un mélange intermittent à mille tr/min. Le lendemain, ajoutez 17 microlitres d’eau à chaque réaction et mélangez.

Purifier l’ARN, comme décrit dans le protocole textuel. Placez les éclutes dans un concentrateur sous vide pendant trois minutes, pour réduire le volume à 11 microlitres. Transférez les réactions dans des tubes PCR de 200 microlitres pour la réaction de transcription inverse.

Ajouter un microlitre d’apprêt. Chauffer à 70 degrés Celsius dans un cycleur PCR pendant cinq minutes, puis laisser à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez huit microlitres d’un Master Mix à transcription inverse dans chaque tube et mélangez.

Placez les tubes dans un cycleur PCR. Chauffer à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes et à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes supplémentaires. Restez sur la glace.

Préparez des billes de streptavidine, comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez la réaction de transcription inverse à la solution de billes et incubez à quatre degrés Celsius sur une roue rotative pendant 20 minutes. À l’aide d’un support magnétique, lavez les billes deux fois avec un tampon de liaison à la biotine et deux fois avec un tampon TEN.

Remettre les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon TEN. Ajoutez deux microlitres de mélange d’enzymes uracile ADN glycosylase et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure dans un mélangeur, avec mélange intermittent. Ajoutez 50 microlitres d’eau, 11 microlitres de tampon RNase H et un microlitre de Rnase H, à chaque réaction.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Placez les tubes sur la grille magnétique et transférez le liquide contenant l’ADNc clivé dans un nouveau tube. Purifiez l’ADNc clivé à l’aide d’un kit de purification PCR, comme décrit dans le protocole texte.

Placez l’ADNc purifié dans un concentrateur sous vide pendant huit minutes pour se concentrer à un volume de sept microlitres. Pour ligaturer cinq adaptateurs principaux aux cinq extrémités principales de l’ADNc isolé, ajoutez à chaque échantillon 23 microlitres d’un Master Mix d’ARN ligase et incubez à 24 degrés Celsius pendant 20 heures. Enfin, ajoutez 70 microlitres d’eau à chaque réaction.

Une PCR pilote est réalisée pour déterminer le nombre optimal de cycles de PCR pour atteindre l’amplification de la bibliothèque, dans la phase exponentielle. Pipetez les éléments suivants dans un tube PCR de 200 microlitres : 25 microlitres de mélange d’ADN polymérase, 20 microlitres de réaction de ligature, deux microlitres d’eau, 1,5 microlitre d’amorce PCR directe et 1,5 microlitre d’amorce d’indice PCR inverse. Faites fonctionner le cycleur avec le programme suivant : trois minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 20 cycles de 20 secondes à 98 degrés Celsius, 20 secondes à 67 degrés Celsius et 30 secondes à 72 degrés Celsius.

Collectez sept aliquotes de microlitres directement du cycleur, après les cycles indiqués. Séparez les produits sur un gel d’agarose à 2 % et visualisez la migration des produits PCR. Déterminez le nombre de cycles au début de l’amplification exponentielle, 12 cycles dans cet exemple, et utilisez ce nombre de cycles pour une réaction PCR à grande échelle.

Séparez les produits de la réaction PCR à grande échelle sur un gel d’agarose à 2 % et découpez les tranches de gel contenant 200 à 350 produits d’ADN nucléotidique. Par la suite, extrayez l’ADN des tranches de gel à l’aide du kit d’extraction de gel, comme décrit dans le protocole de texte. Seules les étapes de calcul les plus importantes seront présentées dans cette vidéo.

Plus de détails sont disponibles dans le protocole texte. Commencez par cloner le référentiel Git et passez au répertoire nouvellement créé. Créez un environnement qui contient le logiciel et activez-le.

Téléchargez la séquence du génome de l’organisme, à partir de laquelle les données A-seq2 ont été obtenues. Ouvrez le fichier de configuration et définissez les paramètres d’entrée, comme indiqué dans le protocole texte. Lancez l’analyse.

La réponse d’un gène spécifique, NUP214, à l’inactivation de la protéine HNRNPC, a été examinée en analysant les lectures a-seq2 de deux échantillons de cellules HEK-293, traités soit avec un petit ARN interférent de contrôle, soit avec un petit ARN interférent HNRNPC. Les lectures qui documentaient les poly(A)sites annotées par le pipeline d’analyse étaient enregistrées au format BAM, qui était utilisé comme entrée dans le navigateur génomique IGD. Les trois extrémités premières des pics de lecture, mappées au niveau de l’ARNm, trois extrémités premières annotées dans leur ensemble.

Les profils indiquent une utilisation accrue de l’isoforme UTR à trois premiers temps lors de l’inactivation de HNRNCR. Une fois maîtrisé, le protocole A-seq prend huit heures de temps de manipulation ou environ deux à trois jours, sans compter le temps pour la culture cellulaire et les ligatures de nuit. Lorsque vous essayez le protocole, il est important de concevoir d’abord un ensemble primal conforme à la plate-forme de séquençage utilisée dans votre région.

Une fois que vous avez obtenu les trois premières extrémités de l’ARMm, d’autres méthodes, comme la réticulation et l’immunoprécipitation, peuvent être utilisées, pour identifier les régulateurs du traitement des trois premières extrémités de l’ARNm. A-seq2 a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du traitement de l’ARN, pour explorer la régulation et les conséquences de la polyadenlylation alternative dans des types de cellules individuelles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des bibliothèques de trois extrémités premières de l’ARNm, d’analyser vos données de séquençage, d’identifier de nouveaux poly(A)sites et de quantifier votre utilisation.

Nous espérons qu’A-seq2 facilitera votre travail pour commencer la régulation du traitement de l’ARNm et vous apportera de nombreuses nouvelles informations.