Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

L'objectif général de cette méthode est de capturer et de séquencer les extrémités 3' des ARNm, permettant ainsi l'étude du traitement des ARNm, en particulier le clivage et la polyadénylation des extrémités 3', ainsi que la quantification de l'expression des gènes. Le protocole A-seq2 et le package d'analyse des données présentés ici peuvent aider à répondre à des questions clés concernant la génération et la fonction des isoformes transcriptomiques dans différents types cellulaires et tissus. Les principaux avantages de la méthode A-seq2 sont qu'elle évite le séquençage de longues séquences poly(A) et qu'elle ne génère pas de dimères d'adaptateurs.

Les cellules cultivées à une confluence de 80 % sont utilisées pour cette procédure. Retirer le milieu de croissance et laver les cellules une fois avec du PBS. Lysér immédiatement les cellules dans la plaque en ajoutant un millilitre de tampon de lyse par puits et en utilisant une spatule en caoutchouc pour détacher complètement les cellules de la surface de la plaque.

Utilisez une pipette d'un millilitre pour transférer le lysat visqueux de chaque puits dans un tube en plastique de 15 millilitres. Homogénéisez l'ADN à l'aide d'une seringue d'un millilitre fixée à une aiguille hypodermique de calibre 23. Effectuez plusieurs mouvements vigoureux de va-et-vient du piston jusqu'à ce que le lysat ne soit plus visqueux.

Transférez le lysat dans un tube de 1,5 millilitre. Faites centrifuger à 20 000 ×g et à 4 °C pendant cinq minutes afin d’éliminer les débris. Récupérez le surnageant clair du lysat.

Ajouter aux billes magnétiques oligo d(T)25 et resuspendre le mélange. Placer les tubes sur une roue rotative pendant 10 minutes. Ensuite, placer les tubes sur un support magnétique pendant deux minutes.

Éliminer le liquide clair. Ajouter 0,8 millilitre de tampon A dans chaque tube et retourner le tube de 180 degrés deux à trois fois. Retirer le tampon A du deuxième lavage.

Ajouter 0,8 millilitre de tampon B dans chaque tube et laisser sur la paillasse pendant deux minutes. Pour éluer l'ARNm fixé sur les billes, retirer le tampon B, ajouter 33 microlitres d'eau dans chaque tube, puis resuspendre les billes. Chauffer à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc chauffant.

Immédiatement, centrifuger les tubes pendant une seconde puis les placer sur le support magnétique. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 66 microlitres de tampon d'hydrolyse alcaline dans chaque tube, mélanger et chauffer à 95 degrés Celsius pendant exactement cinq minutes sur un bloc chauffant.

Refroidissez immédiatement les tubes sur de la glace. Ensuite, effectuez l'isolement de l'ARN à l'aide d'un kit de purification de l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer cette procédure, ajoutez à chaque échantillon d'ARN 14 microlitres d'un mélange maître de polynucléotide kinase.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, charger les réactions de kinase sur des colonnes à centrifuger préparées. Centrifuger les colonnes à 735 fois g pendant deux minutes.

Jetez les colonnes et placez les tubes contenant les réactions recueillies sur de la glace. Pour bloquer les extrémités trois primes des fragments d'ARN afin d'éviter leur concatémérisation lors des réactions de ligature ultérieures, ajoutez à chaque échantillon 17,5 microlitres d'un mélange maître poly(A)polymérase. Mélangez et centrifugez pendant une seconde.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, ajouter 32,5 microlitres d'eau à chaque réaction et purifier l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Commencer cette procédure en plaçant les réactions dans un concentrateur sous vide pendant 10 minutes, afin de réduire le volume à six microlitres.

Ensuite, ajouter à chaque réaction 24 microlitres d'un mélange maître d'ARN ligase. Incuber les réactions dans un mélangeur chauffant à 24 degrés Celsius pendant 16 heures, avec un mélange intermittent à mille tr/min. Le jour suivant, ajouter 17 microlitres d'eau à chaque réaction et mélanger.

Purifiez l'ARN, comme décrit dans le protocole écrit. Placez les éluats dans un concentrateur sous vide pendant trois minutes, afin de réduire le volume à 11 microlitres. Transférez les réactions dans des tubes PCR de 200 microlitres pour la réaction de transcription inverse.

Ajouter un microlitre d'amorce. Chauffer à 70 degrés Celsius dans un thermocycleur PCR pendant cinq minutes, puis laisser à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter huit microlitres d'un mélange maître de transcription inverse dans chaque tube et mélanger.

Placer les tubes dans un thermocycleur. Chauffer à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes supplémentaires. Maintenir sur de la glace.

Préparez les billes de streptavidine, comme décrit dans le protocole écrit. Ajoutez la réaction de transcription inverse à la solution de billes et incubez à quatre degrés Celsius sur une roue rotative pendant 20 minutes. À l’aide d’un support magnétique, lavez les billes deux fois avec du tampon de liaison à la biotine et deux fois avec du tampon TEN.

Resuspendre les billes dans 50 microlitres de tampon TEN. Ajouter deux microlitres de mélange enzymatique d'uracile ADN glycosylase et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure dans un agitateur, avec un mélange intermittent. Ajouter 50 microlitres d'eau, 11 microlitres de tampon RNase H et un microlitre de RNase H à chaque réaction.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Placer les tubes sur le support magnétique et transférer le liquide contenant l'ADNc clivé vers un nouveau tube. Purifier l'ADNc clivé à l'aide d'un kit de purification PCR, comme décrit dans le protocole écrit.

Placer l'ADNc purifié dans un concentrateur sous vide pendant huit minutes afin de concentrer le volume à sept microlitres. Pour ligaturer les adaptateurs en 5' aux extrémités 5' de l'ADNc isolé, ajouter à chaque échantillon 23 microlitres d'un mélange maître de ligase à ARN et incuber à 24 degrés Celsius pendant 20 heures. Enfin, ajouter 70 microlitres d'eau à chaque réaction.

Une PCR pilote est réalisée pour déterminer le nombre optimal de cycles de PCR permettant d'atteindre l'amplification de la bibliothèque durant la phase exponentielle. Pipeter les éléments suivants dans un tube PCR de 200 microlitres : 25 microlitres de mélange de polymérase à ADN, 20 microlitres de réaction de ligation, deux microlitres d'eau, 1,5 microlitre d'amorce PCR directe et 1,5 microlitre d'amorce d'index PCR inverse. Exécuter le thermocycleur selon le programme suivant : trois minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 20 cycles de 20 secondes à 98 degrés Celsius, 20 secondes à 67 degrés Celsius et 30 secondes à 72 degrés Celsius.

Prélevez des aliquotes de sept microlitres directement à partir du thermocycleur, après les cycles indiqués. Séparez les produits sur un gel d'agarose à 2 % et visualisez la migration des produits de PCR. Déterminez le nombre de cycles correspondant au début de l'amplification exponentielle, 12 cycles dans cet exemple, et utilisez ce nombre de cycles pour une réaction de PCR à grande échelle.

Séparer les produits de la réaction PCR à grande échelle sur un gel d'agarose à 2 % et exciser les tranches de gel contenant les produits d'ADN de 200 à 350 nucléotides. Ensuite, extraire l'ADN des tranches de gel à l'aide du kit d'extraction de gel, comme décrit dans le protocole écrit. Seules les étapes informatiques les plus importantes seront montrées dans cette vidéo.

Plus de détails sont disponibles dans le protocole textuel. Commencez par cloner le dépôt Git et accédez au répertoire nouvellement créé. Créez un environnement contenant les logiciels puis activez cet environnement.

Téléchargez la séquence du génome de l'organisme à partir duquel les données A-seq2 ont été obtenues. Ouvrez le fichier de configuration et définissez les paramètres d'entrée, comme indiqué dans le protocole textuel. Lancez l'analyse.

La réponse d'un gène spécifique, NUP214, à l'extinction de la protéine HNRNPC, a été examinée en analysant les lectures a-seq2 provenant de deux échantillons de cellules HEK-293, traitées soit avec un ARN interférent contrôle, soit avec un ARN interférent ciblant HNRNPC. Les lectures ayant documenté les sites poly(A) annotés par le pipeline d'analyse ont été sauvegardées au format BAM, utilisé ensuite comme entrée pour le navigateur génomique IGD. Les extrémités trois prime des pics de lectures correspondent aux extrémités trois prime des mARN annotées dans Ensemble.

Les profils indiquent une utilisation accrue de l'isoforme longue de l'UTR 3' après l'extinction de HNRNCR. Une fois maîtrisé, le protocole A-seq nécessite huit heures de travail actif, soit environ deux à trois jours, sans compter le temps de culture cellulaire et les ligations nocturnes. Lors de la mise en œuvre du protocole, il est important de concevoir au préalable un jeu d'amorces conforme à la plateforme de séquençage utilisée dans votre laboratoire.

Une fois que vous avez obtenu les extrémités 3' de l'ARNm, d'autres méthodes, comme le cross-linking et l'immunoprécipitation, peuvent être réalisées afin d'identifier les régulateurs du traitement des extrémités 3' des pré-ARNm. La méthode A-seq2 a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du traitement de l'ARN, leur permettant d'explorer la régulation et les conséquences de la polyadénylation alternative dans des types cellulaires individuels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des bibliothèques d'extrémités 3' de l'ARNm, d'analyser vos données de séquençage, d'identifier de nouveaux sites de polyadénylation et de quantifier leur utilisation.

Nous espérons que A-seq2 facilitera votre travail sur le démarrage de la régulation du traitement des ARNm et mènera à de nombreuses nouvelles découvertes.