Échantillonnage efficace de l’espace de conception de biocapteurs génétiquement codés grâce à un plan d’expériences et à un flux de travail d’automatisation

Le développement et l’optimisation de biocapteurs vers des applications biotechnologiques constituent le champ de nos recherches. Plus précisément, nous visons à comprendre comment optimiser et concevoir des biocapteurs en modulant leurs éléments génétiques. Les choix de conception guidés par l’intuition, tels que l’ingénierie classique des promoteurs et le tri cellulaire par activation de fluorescence, sont des techniques couramment appliquées dans la caractérisation et la conception de biocapteurs.

Les méthodologies de conception d’expériences n’ont pas encore été largement adoptées dans la conception de circuits génétiques. Grâce à ce protocole, nous cherchons à accroître l’adoption de ces types de techniques dans la conception de circuits génétiques et de biocapteurs. Pour commencer, déterminez la taille théorique de la bibliothèque et calculez le nombre de variantes individuelles nécessaires pour garantir une couverture de bibliothèque supérieure à 95 %.

Calculer le volume requis de milieu de bouillon de lysogénie enrichi en antibiotiques en fonction du nombre de colonies à dépister. Ouvrez le logiciel de traitement des liquides et cliquez sur exécuter à côté du programme de transfert de liquide MTP. Placez le fluide préparé dans la position correspondante du réservoir.

Remplissez ensuite le plateau de plaques de microtitration vides selon la disposition. Réglez le programme pour distribuer 200 microlitres de support. Cliquez sur OK pour confirmer le démarrage du programme.

Maintenant, transférez les puits de plaque de microtitration remplis vers une plate-forme de sélection de colonie et descellez et transférez des plaques de tarière carrées de Pseudomonas putida transformées avec l’ADN de la bibliothèque de variantes plasmidiques dans la plate-forme de sélection de colonie. Utilisez le cueilleur de colonies pour inoculer chaque puits prérempli avec une seule colonie à partir des plaques transformantes. Refermez les plaques inoculées et transférez-les dans un incubateur à agitation hors ligne.

Après l’incubation, remettez les plaques cultivées sur la plate-forme du manipulateur de liquide et descellez-la. Cliquez sur exécuter à côté du protocole d’ajout de glycérol à MTP. Assurez-vous que la disposition des plaques à l’écran correspond à celle du quai de la manipulateur de liquides.

Et séquentiellement, cliquez sur OK pour que le protocole s’exécute. Une fois terminé, scellez les plaques et mélangez-les brièvement dans un incubateur à agitation hors ligne à 800 tours par minute pendant cinq minutes. Codez les plaques et rangez-les à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Calculer le volume requis de milieux supplémentés en antibiotiques pour les blocs de puits profonds. Cliquez sur Exécuter à côté du programme de transfert de liquide DWB. Assurez-vous que le média est ajouté dans le bon réservoir.

Les blocs de puits profonds vides sont dans des positions correctes et disposent d’un approvisionnement suffisant en pointes. Réglez le programme pour distribuer 495 microlitres de fluide. Lorsque vous êtes prêt, cliquez séquentiellement sur OK pour démarrer le programme.

Maintenant, scellez les blocs de puits profonds remplis avec une membrane respirante et transférez-les dans un stockage temporaire à 4 degrés Celsius. Ensuite, cliquez sur Exécuter à côté du programme d’inoculation à partir du programme MTP décongelé. Assurez-vous que les stocks cryogéniques MTP et les blocs de remplissage à puits profonds sont transférés sur la plate-forme conformément à la disposition et qu’un nombre suffisant d’embouts sont chargés.

Séquentiellement, cliquez sur OK pour initialiser. À la fin du programme, scellez les blocs de puits profonds inoculés pendant la nuit avec une membrane respirante. Transférez-les dans un incubateur à plaques hors ligne réglé pendant 16 heures à 30 degrés Celsius, 800 tours par minute et 75 % d’humidité.

Refermez, mélangez et remettez les plaques de microtitration cryostock dans un congélateur à 80 degrés Celsius. Maintenant, calculez le volume requis de milieu complété par diverses concentrations d’effecteurs et d’antibiotiques pour les blocs de puits profonds de nuit à dépister. Cliquez sur Exécuter à côté du programme de transfert de liquide DWB.

Assurez-vous ensuite que les réservoirs de média complétés par l’effecteur sont correctement placés. Ajoutez des blocs de puits profonds vides dans la plate-forme de traitement des liquides. Lorsque vous disposez de suffisamment d’indices, cliquez séquentiellement sur OK pour démarrer le protocole afin de générer des blocs de puits profonds de test.

Après le remplissage, scellez les blocs de puits profonds du test avec une membrane respirante. Remplissez le manipulateur de liquide avec des assiettes vides. Répétez l’inoculation jusqu’à ce que tous les blocs de dosage soient remplis.

Ensuite, cliquez sur Exécuter à côté du programme de transfert vers le test DWB. Une fois que les blocs de puits profonds d’essai non scellés avec un milieu complété par un effecteur sont correctement placés, transférez et descellez les blocs de puits profonds de nuit contenant P. putida cultivé selon la disposition. Cliquez séquentiellement sur OK pour démarrer le protocole.

Une fois le programme terminé, scellez les plaques d’essai de transfert dans l’incubateur hors ligne. Jetez les blocs de puits profonds de nuit après l’inoculation. Ensuite, transférez les blocs de puits profonds dans une centrifugeuse.

Cellules de granules à 4 000 g dans un rotor contrôlé par la glace à 18 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, placez les blocs de centrifugation sur la plate-forme de traitement des liquides. Calculez le volume d’une fois le PBS requis en fonction du nombre de blocs de puits profonds à cribler.

Cliquez sur exécuter à côté du testeur, configurer, configurer PBS, resuspendre, programme DWB et régler le volume de distribution sur 500 microlitres. Assurez-vous ensuite que le PBS est ajouté au bon réservoir et disposez les plaques centrifugées conformément à la disposition. Cliquez sur OK pour démarrer le programme après avoir confirmé la disponibilité des pourboires.

Refermez et retirez les blocs de puits profonds remis en suspension du manipulateur de liquides. Vérifiez le dessous de la plaque pour vous assurer que les granulés sont complètement remis en suspension. Cliquez sur Exécuter à côté des cellules de configuration du test et du programme MTP de l’édition PBS.

Ensuite, transférez les blocs de puits profonds remis en suspension dans le manipulateur de liquide selon la disposition. Chargez les plaques de microtitration vides selon la disposition et réglez le volume de distribution sur 200 microlitres avant de cliquer sur OK. Transférez les plaques de microtitration remplies dans un lecteur de plaques multimode hors ligne et mesurez la fluorescence relative et l’OD600.

Le criblage automatisé de 5 000 variants promoteurs a permis d’identifier les meilleurs candidats présentant une activation supérieure à 3,6 fois. Les valeurs EC 50 pour 100 variantes uniques ont été tracées afin de visualiser la distribution de sensibilité et d’identifier des candidats robustes. Les valeurs EC 50 ont été calculées pour 226 variants enrichis et classées à l’aide de la transformation Lin-log pour former une bibliothèque à l’échelle de la sensibilité.

Un plan de dépistage définitif a été construit en utilisant une variance de niveau de 1, 0 et 1 à partir de quatre modules. Les profils des modèles de site de liaison aux ribosomes de transport, de régulateur, de sortie et de sortie ont révélé comment les changements dans les niveaux d’expression des quatre modules ont eu un impact non linéaire sur EC 50 et le coefficient de Hill. Identification de combinaisons d’expression optimales avec RBS-Out, montrant un fort effet positif sur la sensibilité et la pente.

La variante de biocapteur optimisée à l’échelle mondiale, intégrant des puissances de module idéales, a démontré une sensibilité et un coefficient de Hill améliorés par rapport aux versions parentales et optimisées pour le DSD.