Caractérisation des systèmes complexes à l'aide de la conception des expériences approche: l'expression transitoire de protéines dans le tabac comme une étude de cas

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des modèles prédictifs pour l’expression transitoire des protéines dans les feuilles des plantes. Ceci est réalisé en mettant en place un plan expérimental pour identifier les paramètres les plus importants pour l’expression transitoire et quantifier leur impact sur l’accumulation de protéines. Dans un deuxième temps, les gènes sont clonés et transférés dans des agrobactéries, qui sont ensuite injectées dans les feuilles, ce qui entraîne une expression transitoire des protéines.

Ensuite, des échantillons de feuilles sont analysés afin de déterminer les niveaux d’expression des protéines. On obtient des résultats qui montrent le modèle des niveaux d’expression transitoire des protéines dans des feuilles de différents âges et pour différentes conditions d’incubation, sur la base d’un modèle d’évaluation du plan d’expérience. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme un facteur à la fois, est que les interactions entre différents paramètres comme l’âge de la feuille ou la position de la feuille peuvent être détectées et quantifiées.

L’approche d’un facteur à la fois qui est souvent utilisée pour caractériser l’effet de certains facteurs sur le résultat d’une expérience n’est pas optimale parce que les exécutions individuelles au cours d’une expérience seront alignées comme des perles sur un fil, ce qui permet d’obtenir une faible couverture de l’espace de conception. Contrairement à la conception d’expériences de la stratégie DOE, la variation de plus d’un facteur à la fois améliore la couverture et donc la précision des modèles résultants. De plus, la couverture biaisée de l’espace de conception est d’un facteur à la fois.

Les expériences peuvent également ne pas identifier les régions de fonctionnement optimales et prédire les solutions sous-optimales, alors que les stratégies DOE sont plus susceptibles d’identifier les conditions préférables. Cet organigramme illustre le processus de planification d’une stratégie DOE. La première étape consiste à identifier les facteurs et les réponses pertinents à inclure dans la conception.

Dans cette démonstration, les niveaux d’expression d’un anticorps monoclonal anti-VIH modèle deux G 12 et d’un marqueur fluorescent, la protéine DS rouge, seront mesurés sur la base d’expériences antérieures. La différence minimale détectable considérée comme pertinente sera de 10 microgrammes par millilitre pour deux G 12 et de 20 microgrammes par millilitre pour le DS rouge. De plus, les valeurs approximatives de l’écart-type estimé du système pour deux G 12 et DS rouge seront respectivement de quatre et huit microgrammes par millilitre.

Les étapes restantes de la planification de cette stratégie du DOE ne seront pas abordées ici, mais les détails se trouvent dans le manuscrit ci-joint. Deux G 12 et DS rouges seront exprimés de manière transitoire dans les plants de tabac. Pour commencer la procédure de culture des plantes, préparez des blocs de paroi rocheuse de 10 x 10 x huit centimètres en les flashant abondamment avec de l’eau désionisée pour éliminer les produits chimiques résiduels.

Après cela, équilibrez les blocs avec une solution fraîchement préparée d’engrais pour graines de tabac en plaçant une à deux graines de tabac sur chaque bloc de paroi rocheuse, suivi d’un bref rinçage avec de l’engrais. Attention à ne pas emporter les graines, faites germer et cultivez les plants de tabac pendant 42 jours dans une serre dans des conditions appropriées. Préparez l’AUM FASS en cultivant une culture à une OD 600 nanomètres de 5,0.

Diluer la culture avec de l’eau et un milieu d’infiltration double pour correspondre aux 600 nanomètres DO nécessaires à l’injection avant l’injection. Confirmer la DO 600 nanomètres de l’atoum de la suspension de fasion pour préparer les feuilles à l’injection. Grattez doucement l’épiderme au site d’injection avec une pointe de pipette pour faciliter l’afflux de solution AUM Fasion.

Évitez de rompre le limbe de la feuille ce faisant. Tenez la seringue contenant la suspension de fasion AUM perpendiculairement au limbe de la feuille, en touchant le canon contre le champ intercostal à traiter, poussez doucement la sortie sur la face inférieure de la feuille. Dans le même temps, appuyez doucement sur la face supérieure de la feuille pour éviter que le limbe ne se déplace ou ne se rompe.

Appuyez doucement sur le piston de la seringue. La solution de mode AUM pénétrera dans les espaces intercellulaires à l’intérieur du limbe des feuilles, comme l’indiquent les zones traitées apparaissant plus foncées, vertes et humides. Assurez-vous que la seringue reste perpendiculaire à la feuille pendant l’injection.

Sinon, la suspension bactérienne peut être éjectée sous haute pression. Répétez cette procédure à plusieurs positions jusqu’à ce que tout le champ intercostal soit infiltré avec aum, aum, fass. Poursuivez ensuite avec le champ intercostal suivant après l’injection, incubez les plantes dans des conditions déterminées par le DOE lorsque la période d’incubation est terminée.

Commencez l’échantillonnage. Stabilisez la feuille à l’aide d’un essuie-tout portatif et utilisez un emprunteur en liège pour retirer quatre à cinq disques foliaires des champs intercostaux traités aux positions et aux moments indiqués par le DOE. Ne retirez pas toute la feuille de la plante pendant l’échantillonnage.

Déterminez la masse de chaque échantillon et placez-le dans un tube de réaction en plastique de 1,5 millilitre étiqueté avec le nom et la masse de l’échantillon. Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius avant la quantification des protéines. Le processus peut être interrompu à ce stade pendant plusieurs mois, en fonction de la stabilité de l’échantillon et de la température de stockage pour extraire les protéines des échantillons de disques foliaires.

Ajouter trois millilitres de tampon d’extraction par milligramme de masse d’échantillon et broyer les disques de feuilles dans le tube de réaction à l’aide d’un pilon électrique jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros fragments. Pour éviter de surchauffer l’échantillon, placez le tube sur de la glace chaque fois que le tube est chaud après la centrifugation. Pour éliminer les solides dispersés, transférez le surnageant dans un tube réactionnel propre de 1,5 millimètre.

Mesurez la fluorescence rouge DS deux fois de suite. Dans un lecteur bien joué équipé de 530 filtres d’excitation de 25 nanomètres et de 590 filtres d’émission de 35 nanomètres pour chaque échantillon. Faites la moyenne de la fluorescence sur les deux lectures et les trois réplicats techniques et soustrayez la valeur enregistrée pour le témoin à blanc contenant zéro microgramme par millilitre de MS rouge.

Soustrayez également cette valeur des anches des dilutions standard et utilisez ces valeurs corrigées à blanc pour une régression linéaire produisant une courbe de référence. La pente de la courbe de référence est ensuite utilisée pour convertir la fluorescence mesurée pour les échantillons en concentrations de rouge DS. La procédure de détermination de la concentration des deux anticorps G 12 ne sera pas présentée ici, mais sera détaillée dans le manuscrit ci-joint.

Le logiciel Design Expert est utilisé pour l’analyse et l’évaluation des données dans le nœud d’analyse. Choisissez la réponse à analyser et sélectionnez initialement aucune dans l’onglet transformation. Passez à l’onglet Résumé de l’ajustement, qui fournit des informations générales sur les facteurs importants pour le système faisant l’objet de l’enquête.

Le logiciel vous proposera un modèle initial en fonction de sa signification dans l’onglet modèle. Un modèle initial est présélectionné en fonction des résultats du résumé de l’ajustement. Utilisez le mode automatisé pour modifier ce modèle dans l’onglet Innova.

Étudiez le modèle suggéré et les facteurs inclus si nécessaire. Supprimez manuellement tous les facteurs dont les valeurs P sont supérieures à un seuil prédéfini ou ceux qui sont peu probables en fonction de considérations mécanistes en revenant à l’onglet modèle, en passant la sélection en mode manuel et en éliminant les facteurs appropriés du modèle. Passez à l’onglet Diagnostics pour confirmer la qualité du modèle et détecter les valeurs aberrantes potentielles dans le jeu de données qui ont une forte influence sur le modèle.

En examinant tous les onglets de l’outil de diagnostic, ajustez le type de transformation dans l’onglet correspondant si la boîte Tracé de Cox le suggère et redémarrez la procédure d’analyse dans l’onglet Graphiques du modèle. Visualisez le modèle évalué pour un nombre limité de facteurs numériques tels que trois. La représentation de la surface de réponse est utile pour évaluer les caractéristiques optimales.

Les surfaces de réponse manuelle illustrent uniquement l’impact de deux facteurs sur la réponse faisant l’objet de l’enquête. L’effet de tout facteur supplémentaire sur la réponse est révélé en modifiant sa valeur ou son niveau dans la fenêtre d’outils des facteurs. Il est également possible d’attribuer des facteurs à l’axe du tracé en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris dans la fenêtre d’outils des facteurs et en sélectionnant l’axe de variable indépendant souhaité.

Manipulez les niveaux de facteurs et attribuez-les aux coordonnées du graphique à l’aide de l’outil Facteurs. Exportez des graphiques à l’aide de la commande exporter le graphique vers un fichier dans l’onglet Fichier. Utilisez le sous-nœud numérique dans le nœud d’optimisation pour optimiser numériquement la réponse souhaitée, en fonction des facteurs du modèle auxquels certaines contraintes peuvent à leur tour être appliquées via l’onglet critères.

Calculez et examinez des solutions numériques dans l’onglet solutions en fonction de l’entrée fournie dans l’onglet critères. Exportez ces solutions vers d’autres logiciels, tels qu’une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie, révélant les paramètres de facteur associés aux valeurs de réponse élevées ou faibles. Ceci est utile si plus de trois facteurs numériques sont étudiés, et la représentation 3D est difficile dans cette étude représentative.

La stratégie DOE a été utilisée pour examiner les effets de différents promoteurs et de cinq premiers RS sur l’expression transitoire de ds. Les facteurs rouges inclus dans le modèle d’expression transitoire et les plages étudiées sont présentés dans ce tableau. Les facteurs en gras sont propres à cette expérience.

Les facteurs en italique sont pour une autre expérience qui sera décrite plus tard. Au moins trois niveaux ont été sélectionnés pour tous les facteurs numériques discrets afin de permettre le calcul d’un modèle de base quadratique. Un algorithme de sélection optimale a été choisi pour la sélection des exécutions DOE afin d’obtenir les estimations les plus précises pour les coefficients du modèle de régression.

La conception initialement suggérée par l’expert en conception comprenait 90 essais, mais le FDS était insuffisant pour atteindre une erreur type de prédiction de 1 %. L’augmentation optimale de la conception à un total de 210 essais a résolu ce problème et a abouti à un FDS de 100 % avec une précision de prédiction plus uniforme sur l’ensemble de l’espace de conception indiqué par la courbe plate, les concentrations de rouge DS ont été déterminées pour les 210 essais et les données ont été transformées en log 10. Les facteurs du modèle ont été choisis par sélection arrière automatisée à partir d’un modèle cubique avec un niveau alpha de 0,100.

Il en a résulté un modèle significatif avec un manque d’ajustement non significatif et des valeurs élevées pour les coefficients de corrélation multiples. La valeur P de tous les facteurs du modèle était inférieure à 0,05, de sorte qu’il n’a pas été nécessaire de manipuler manuellement le modèle. Le modèle contenait trois interactions de facteurs mises en évidence en gras qui ne faisaient pas partie de la réévaluation initiale du modèle de base quadratique du graphique FDS.

L’utilisation de tous les facteurs inclus dans le modèle de prédiction final a révélé que la FDS pour l’erreur-type de prédiction n’avait pas diminué de manière significative en incluant les interactions supplémentaires à trois facteurs. Les outils de diagnostic de la qualité du modèle de l’expert en conception ont indiqué que la transformation des données était utile et qu’il n’y avait pas de facteurs manquants dans le modèle, car le tracé normal des résidus montrait un comportement linéaire et aucun modèle spécifique n’a été observé dans les résidus par rapport au graphique prédit. Il n’y avait pas non plus de tendance tout au long de l’expérience à indiquer une variable cachée dépendante du temps.

Au lieu de cela, les prédictions du modèle étaient en très bon accord avec la fluorescence rouge Diaz observée, car tous les points se trouvent près de la diagonale. Il a donc été supposé que le modèle sélectionné était utile pour prédire l’expression transitoire du rouge SD dans les feuilles de tabac sans plomb dérivées par différents promoteurs cinq combinaisons UTR primaires au cours d’une période d’incubation post-infiltration de huit jours, et un modèle de régression linéaire artificielle sans transformation des données a également été sélectionné pour illustrer les conséquences d’une sélection et d’une transformation erronées des facteurs. Comme on le voit clairement ici, le tracé normal des résidus s’écarte du comportement linéaire attendu et il existe un motif en forme de V dans le graphique des résidus par rapport au tracé prédit au lieu d’une dispersion aléatoire.

De plus, le graphique des résidus en fonction de l’exécution met en évidence deux valeurs extrêmes. Alors que les prédictions étaient médiocres pour les valeurs petites et élevées s’écartant de la diagonale, les surfaces de réponse optimales du modèle pour l’expression transitoire du rouge SD dans les feuilles de tabac sont présentées ici. Le modèle a prédit que l’âge des feuilles était un facteur significatif, avec des niveaux d’expression plus faibles dans les vieilles feuilles, par exemple, la deuxième feuille dans les parcelles A et B par rapport aux jeunes feuilles telles que la sixième feuille dans les parcelles C et D. La progression de l’accumulation de rouge SD dans les feuilles n’était pas linéaire ou exponentielle, mais suivait une courbe sigmoïdale pendant les huit jours d’incubation post-infiltration.

Les cinq combinaisons UTR principales avec le promoteur CAMV 35 SS ont entraîné une expression plus forte du rouge DS que les combinaisons avec le promoteur NOS. Bien que les cinq premiers UTR aient également eu un impact significatif sur l’expression droite de la DS, comme le montre la comparaison entre la TL et la CHS, la force de l’expression dépendait du promoteur qui l’accompagnait. Le modèle prédictif a également indiqué que certaines paires de combinaisons UTR de premier ordre, telles que nas CHS et CAMV 35 SS CHS, ont entraîné des niveaux d’expression équilibrés différant de moins de 30 % d’un rapport défini sur toutes les feuilles et des temps d’incubation supérieurs à deux jours.

Une telle expression équilibrée serait utile pour l’expression de protéines multimériques avec une stœchiométrie définie. L’approche DOE a également été utilisée pour optimiser les conditions d’incubation et les schémas de récolte pour la production simultanée de deux G 12 et DS rouge dans le tabac. Les facteurs affectant l’expression transitoire qui ont été inclus dans cette expérience sont en italique à partir de 600 nanomètres et le temps d’incubation.

Un modèle prédictif a été établi pour l’expression de chaque protéine chez les plantes à différents âges. Les jeunes feuilles ont été récoltées 40 jours après l’ensemencement, les vieilles feuilles ont été récoltées 47 jours après l’ensemencement. Ces quatre modèles ont ensuite été évalués et un modèle de consensus a été établi qui incluait chaque facteur jugé significatif dans les modèles individuels.

Il a été confirmé par la suite que le modèle de consensus était toujours une bonne représentation de tous les ensembles de données initiaux. Le modèle consensuel a ensuite été utilisé pour identifier les températures d’incubation optimales et les OD bactériennes de 600 nanomètres pour les deux protéines afin de prédire les concentrations de protéines dans toutes les feuilles et les positions des feuilles chez les jeunes et les vieilles plantes. L’intégration des profils de concentration avec les données sur la biomasse a ensuite permis d’obtenir un rendement absolu en protéines.

Les quantités absolues de protéines ont ensuite été corrélées avec les coûts associés en aval, ce qui a permis une analyse coûts-avantages pour le traitement de chaque feuille par âge de la plante. La même quantité de rouge SD et d’environ 65 % de deux G 12 a été trouvée dans les jeunes plants par rapport aux vieilles, malgré une biomasse moyenne inférieure d’environ 50 % reflétant l’expression plus élevée des protéines spécifiques chez les jeunes plants. Cela a révélé que les jeunes plantes étaient avantageuses pour l’expression transitoire car les protéines atteignaient des concentrations plus élevées pendant des périodes de croissance plus courtes malgré la biomasse globale plus faible par rapport aux vieilles plantes.

Enfin, il a également été constaté que le traitement de toutes les feuilles de vieilles plantes était plus coûteux que de jeter les feuilles une à trois et d’augmenter le nombre de plantes par lot. Par conséquent, les modèles basés sur le DOE conviennent non seulement pour marquer l’étape finale d’une expérience, mais aussi pour être combinés avec d’autres données afin de faciliter des aspects plus complexes de l’analyse de processus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer, de conduire et d’analyser un DOE pour étudier l’expression transitoire des protéines dans les plantes.