Modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation

Nos recherches portent sur l’utilisation de l’électroporation, en particulier des impulsions microsecondes bipolaires, afin de traiter le cancer. Actuellement, nous étudions l’ablation des tissus mous, mais nous allons également passer à la transfection in vivo en utilisant ces impulsions. Notre protocole vous permet en effet d’avoir une visualisation plus efficace des seuils d’électroporation irréversibles et réversibles.

Il peut également être un peu meilleur qu’un système basé sur des cubes, car il nous permet de voir en 3D plutôt que dans un environnement 2D. Et un environnement 3D serait beaucoup plus similaire à ce que nous verrions dans les tissus. À l’avenir, nous chercherons à essayer de traduire ce que nous voyons dans ce modèle in vivo, et ce que ce modèle fait vraiment, c’est éclairer les choix de paramètres que nous allons faire lorsque nous essayons de fournir des choses telles que des vaccins à ADN, des chimiothérapies, ainsi que des systèmes CRISPR-Cas9.

Pour commencer, placez la suspension cellulaire et les réactifs requis dans une enceinte de biosécurité. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire préparée avec une solution de collagène bovin de type 1 dans un rapport de 1:1. Placez le mélange sur de la glace ou dans un bain de billes froides pour éviter une polymérisation prématurée.

Ensuite, pipetez 500 microlitres de la solution combinée pour enrober le fond de chaque puits d’une plaque de 12 puits. Tournez doucement la plaque pour vous assurer que le gel entre en contact avec les parois de chaque puits. Incuber les gels dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 6 heures ou jusqu’à ce que les gels deviennent fermes.

Ensuite, inclinez la plaque du puits et ajoutez doucement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits, en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque. Retirez le raccord de leurre en plastique de deux aiguilles de seringue en acier inoxydable 304 de 1,64 millimètre. Mettez une aiguille de côté pour servir d’électrode de broche.

Pour l’autre aiguille, aplatissez les 5 derniers millimètres d’une extrémité. Ensuite, coupez une section d’un tube en acier inoxydable 316 d’un diamètre de 19 millimètres suffisamment long pour qu’il soit aligné contre le fond d’une plaque de puits pour créer l’électrode annulaire. Concevez un porte-électrode à l’aide d’un logiciel de CAO pour ajuster les composants de l’électrode.

Insérez l’anneau et les électrodes dans le porte-électrode pour assembler l’électrode et appuyez sur l’aiguille pour ajuster l’extrémité aplatie dans le support pour fixer l’électrode annulaire. Dans une armoire de biosécurité, inclinez la plaque préparée et aspirez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits. Ajouter 20 microlitres de 5 microgrammes par microlitre de solution plasmidique de protéine fluorescente verte dans les puits aspirés.

Faites tourner doucement la plaque pour vous assurer que la solution se répartit uniformément sur la surface du gel. Incuber les gels dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Ensuite, insérez la sonde de température à fibre optique dans l’électrode de la broche et commencez à enregistrer la température.

Connectez le fil positif de l’électroporateur à l’électrode à broche et le fil négatif à l’aiguille, en fixant l’électrode annulaire. Allumez maintenant la plaque chauffante et chauffez les gels pour maintenir une température de 37 degrés Celsius. Insérez ensuite l’anneau assemblé et l’électrode de la sonde de température dans le puits et assurez-vous que le gel a atteint une température de 37 degrés Celsius.

Activez l’électroporateur pour administrer le traitement. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu de culture à tous les gels qui semblent secs et continuez à électrifier tous les gels non traités. Une fois tous les traitements terminés, incubez les gels dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes.

Après l’incubation, ajoutez délicatement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits le long de la paroi de la plaque. Incuber à nouveau les gels dans l’incubateur humidifié pendant 24 heures. Inclinez la plaque et aspirez le milieu de culture de chaque puits.

Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de PBS dans chaque puits le long des parois de la plaque. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 minutes. Ensuite, aspirez le PBS de chaque puits.

Ajoutez doucement 500 microlitres de PBS dans chaque puits en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque. Tournez doucement la plaque, puis inclinez-la et aspirez le PBS de chaque puits. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de PBS frais dans chaque puits pour garder les gels hydratés pour l’imagerie.

Ensuite, imagez la plaque à l’aide de techniques de microscopie fluorescente standard. Après l’imagerie, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits de la plaque et incubez pendant 24 heures. Répétez l’intégralité du flux de travail d’imagerie et de récupération pour chaque point temporel désigné.

Après avoir créé un modèle informatique, utilisez le logiciel du microscope pour mesurer le diamètre des bords extérieur et intérieur de la région en forme de tore le long des axes verticaux et horizontaux. Faites la moyenne des diamètres extérieur et intérieur respectivement et divisez par 2 pour calculer les rayons correspondants. Enfin, à l’aide de la table de correspondance créée précédemment, dérivez l’intensité du champ électrique aux rayons mesurés.

Le rayon extérieur de la région transfectée a été utilisé pour quantifier le seuil d’électroporation réversible ou RE en le corrélant avec les intences de champ électrique à partir d’un modèle informatique. Alors que le rayon intérieur a été utilisé pour déterminer le seuil d’électroporation irréversible ou IRE. Les trois protocoles d’impulsions microsecondes bipolaires ont abouti à des régions de transfection en forme de tore avec des limites RE et IRE clairement visibles.

Parmi les formes d’onde testées, la forme d’onde équilibrée en rafale 2-1-1 a généré le seuil IRE le plus élevé, tandis que la forme d’onde asymétrique 2-1-1 a montré le plus bas. Un protocole d’électroporation monopolaire standard utilisant 420 volts a abouti à une région de transfection circulaire avec un seuil d’ENR de 642 volts par centimètre, mais n’a pas réussi à produire la mort cellulaire, empêchant la détermination du seuil d’IRE. La déformation des tissus au fil du temps due à la dégradation du gel a fait perdre aux régions transfectées leur forme circulaire, ce qui rend difficile la quantification précise de l’ER et de l’IRE.

Le désalignement de l’anneau et des électrodes avec le fond du puits a également produit des modèles de transfection asymétriques non circulaires, ce qui a compliqué la mesure du seuil.