Name: Modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez la modélisation computationnelle pour quantifier les seuils d'électroporation réversible et irréversible dans un modèle tissulaire tridimensionnel. Cette méthode optimise les protocoles de transfection cellulaire.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1000 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 200 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles à pointe émoussée en acier inoxydable 304</td><td>McMaster Carr</td><td>Référence 75165A753</td><td></td></tr><tr><td>Tube en acier inoxydable 316</td><td>McMaster Carr</td><td>Référence 89785K319</td><td></td></tr><tr><td>Acrylique</td><td>McMaster Carr</td><td>Référence 8505K754</td><td></td></tr><tr><td>Cabinet de biosécurité</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de CAO</td><td>Dassault Systèmes</td><td>SolidWorks (en anglais)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Nuaire</td><td>NU-C200R</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Hbio</td><td>45-0662</td><td>Un appareil sur mesure et un système BTX ECM 830 ont été utilisés dans cette étude</td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10009CV</td><td>Cela peut varier&nbsp ; si vous utilisez une lignée cellulaire autre que HEK293</td></tr><tr><td>Falcon Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat transparent à fond plat traitée TC, avec couvercle</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>N’importe quelle plaque à 12 puits peut être utilisée, assurez-vous simplement que les dimensions du puits sont prises en compte lors de la fabrication du porte-électrode.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de température à fibre optique</td><td>Micronor Inc.</td><td>TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide GFP</td><td>Aldeveron</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>D’autres lignées cellulaires peuvent être utilisées, il suffit de s’assurer que le bon milieu de culture est utilisé</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Refroidissement thermoélectrique Société américaine</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>Bain de glace ou de billes réfrigéré</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Découpeuse laser</td><td>McMaster Carr</td><td>Référence 7344N11</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de simulation</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysique 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Fiole T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Solution de collagène bovin de type I</td><td>Biomatrice avancée</td><td>5005</td><td>3 mg/mL</td></tr></tbody></table>

modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

L’anneau et l’électrode à broche ont délivré avec succès un plasmide d’ADN codant pour une protéine fluorescente verte (GFP) dans des imitations de tissu de collagène 3D intégrées avec des cellules HEK293. La quantification du seuil d’ER a été obtenue en mesurant le rayon extérieur de la région transfectée et en dérivant l’intensité de champ correspondante à partir du modèle de calcul du dispositif expérimental, comme le montre la figure 2. Le seuil IRE a été...

Modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

Nos recherches portent sur l’utilisation de l’électroporation, en particulier des impulsions microsecondes bipolaires, afin de traiter le cancer. Actuellement, nous étudions l’ablation des tissus mous, mais nous allons également passer à la transfection in vivo en utilisant ces impulsions. Notre protocole vous permet en effet d’avoir une visualisation plus efficace des seuils d’électroporation irréversibles et réversibles.Il peut également être un peu meilleur qu’un système basé sur des cubes, car il nous permet de voir en 3D plutôt que dans un environnement 2D. Et un environnement 3D serait beaucoup plus similaire à ce que nous verrions dans les tissus. À l’avenir, nous chercherons à essayer de traduire ce que nous voyons dans ce modèle in vivo, et ce que ce modèle fait vraiment, c’est éclairer les choix de paramètres que nous allons faire lorsque nous essayons de fournir des choses telles que des vaccins à ADN, des chimiothérapies, ainsi que des systèmes CRISPR-Cas9.Pour commencer, placez la suspension cellulaire et les réactifs requis dans une enceinte de biosécurité. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire préparée avec une solution de collagène bovin de type 1 dans un rapport de 1:1. Placez le mélange sur de la glace ou dans un bain de billes froides pour éviter une polymérisation prématurée.Ensuite, pipetez 500 microlitres de la solution combinée pour enrober le fond de chaque puits d’une plaque de 12 puits. Tournez doucement la plaque pour vous assurer que le gel entre en contact avec les parois de chaque puits. Incuber les gels dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 6 heures ou jusqu’à ce que les gels deviennent fermes.Ensuite, inclinez la plaque du puits et ajoutez doucement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits, en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque. Retirez le raccord de leurre en plastique de deux aiguilles de seringue en acier inoxydable 304 de 1,64 millimètre. Mettez une aiguille de côté pour servir d’électrode de broche.Pour l’autre aiguille, aplatissez les 5 derniers millimètres d’une extrémité. Ensuite, coupez une section d’un tube en acier inoxydable 316 d’un diamètre de 19 millimètres suffisamment long pour qu’il soit aligné contre le fond d’une plaque de puits pour créer l’électrode annulaire. Concevez un porte-électrode à l’aide d’un logiciel de CAO pour ajuster les composants de l’électrode.Insérez l’anneau et les électrodes dans le porte-électrode pour assembler l’électrode et appuyez sur l’aiguille pour ajuster l’extrémité aplatie dans le support pour fixer l’électrode annulaire. Dans une armoire de biosécurité, inclinez la plaque préparée et aspirez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits. Ajouter 20 microlitres de 5 microgrammes par microlitre de solution plasmidique de protéine fluorescente verte dans les puits aspirés.Faites tourner doucement la plaque pour vous assurer que la solution se répartit uniformément sur la surface du gel. Incuber les gels dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Ensuite, insérez la sonde de température à fibre optique dans l’électrode de la broche et commencez à enregistrer la température.Connectez le fil positif de l’électroporateur à l’électrode à broche et le fil négatif à l’aiguille, en fixant l’électrode annulaire. Allumez maintenant la plaque chauffante et chauffez les gels pour maintenir une température de 37 degrés Celsius. Insérez ensuite l’anneau assemblé et l’électrode de la sonde de température dans le puits et assurez-vous que le gel a atteint une température de 37 degrés Celsius.Activez l’électroporateur pour administrer le traitement. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu de culture à tous les gels qui semblent secs et continuez à électrifier tous les gels non traités. Une fois tous les traitements terminés, incubez les gels dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes.Après l’incubation, ajoutez délicatement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits le long de la paroi de la plaque. Incuber à nouveau les gels dans l’incubateur humidifié pendant 24 heures. Inclinez la plaque et aspirez le milieu de culture de chaque puits.Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de PBS dans chaque puits le long des parois de la plaque. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 minutes. Ensuite, aspirez le PBS de chaque puits.Ajoutez doucement 500 microlitres de PBS dans chaque puits en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque. Tournez doucement la plaque, puis inclinez-la et aspirez le PBS de chaque puits. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de PBS frais dans chaque puits pour garder les gels hydratés pour l’imagerie.Ensuite, imagez la plaque à l’aide de techniques de microscopie fluorescente standard. Après l’imagerie, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits de la plaque et incubez pendant 24 heures. Répétez l’intégralité du flux de travail d’imagerie et de récupération pour chaque point temporel désigné.Après avoir créé un modèle informatique, utilisez le logiciel du microscope pour mesurer le diamètre des bords extérieur et intérieur de la région en forme de tore le long des axes verticaux et horizontaux. Faites la moyenne des diamètres extérieur et intérieur respectivement et divisez par 2 pour calculer les rayons correspondants. Enfin, à l’aide de la table de correspondance créée précédemment, dérivez l’intensité du champ électrique aux rayons mesurés.Le rayon extérieur de la région transfectée a été utilisé pour quantifier le seuil d’électroporation réversible ou RE en le corrélant avec les intences de champ électrique à partir d’un modèle informatique. Alors que le rayon intérieur a été utilisé pour déterminer le seuil d’électroporation irréversible ou IRE. Les trois protocoles d’impulsions microsecondes bipolaires ont abouti à des régions de transfection en forme de tore avec des limites RE et IRE clairement visibles.Parmi les formes d’onde testées, la forme d’onde équilibrée en rafale 2-1-1 a généré le seuil IRE le plus élevé, tandis que la forme d’onde asymétrique 2-1-1 a montré le plus bas. Un protocole d’électroporation monopolaire standard utilisant 420 volts a abouti à une région de transfection circulaire avec un seuil d’ENR de 642 volts par centimètre, mais n’a pas réussi à produire la mort cellulaire, empêchant la détermination du seuil d’IRE. La déformation des tissus au fil du temps due à la dégradation du gel a fait perdre aux régions transfectées leur forme circulaire, ce qui rend difficile la quantification précise de l’ER et de l’IRE.Le désalignement de l’anneau et des électrodes avec le fond du puits a également produit des modèles de transfection asymétriques non circulaires, ce qui a compliqué la mesure du seuil.

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Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

Un tourbillon microfluidique plate-forme d'électroporation assistée a été développé pour la livraison séquentielle de plusieurs molécules dans des populations de cellules identiques avec contrôle de dosage précis et indépendant. Basé sur la taille de l'étape de purification de la cellule cible de l'électroporation précédentes du système aidé à améliorer l'efficacité d'administration moléculaire et la viabilité des cellules traitées.

Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

Ce protocole décrit les techniques de microfabrication requises pour construire un dispositif d’électroporation microfluidique en laboratoire sur puce. La configuration expérimentale effectue des transfections contrôlées au niveau d’une seule cellule dans un flux continu et peut être étendue à des débits plus élevés avec un contrôle basé sur la population. Une analyse est fournie démontrant la capacité de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire en temps...

La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Ce travail décrit le développement d’électrodes interdigitées flexibles pour la mise en œuvre dans des modèles 3D de tumeurs cérébrales, à savoir la culture in vitro , le modèle in ovo et le modèle murin in vivo . La méthode proposée peut être utilisée pour évaluer les effets des champs électriques pulsés sur les tumeurs à différents niveaux de complexité.

Dispositifs électroniques organiques flexibles pour la thérapie par champs électriques pulsés du glioblastome

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

Pour l’étude des réponses des cellules excitables in vitro, le protocole décrit la surveillance optique des changements dans la génération de potentiel d’action dus à l’électroporation sur un modèle cellulaire excitable simple de cellules HEK à enrichissement tet-on génétiquement modifiées, ainsi que les changements de tension transmembranaire avec extraction automatisée des paramètres pertinents.

Surveillance des changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action dans les cellules HEK à pointes Tet-On génétiquement modifiées

Ici, nous présentons la manipulation génétique aiguë d’organoïdes corticaux humains tranchés par électroporation. Ces modèles d’organoïdes corticaux sont particulièrement susceptibles d’être injectés car les structures semblables aux ventricules peuvent être facilement identifiées après le tranchage, ce qui permet l’étude fonctionnelle du développement cortical humain, des troubles neurodéveloppementaux et de l’évolution corticale.

Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

L’électroporation est l’utilisation de champs électriques pulsés (PEF) pour créer des pores transitoires dans les cultures cellulaires afin d’introduire une cargaison moléculaire. Cette technique est récemment devenue largement utilisée dans la recherche et les milieux cliniques. Nous décrivons ici les techniques d’électroporation utilisant le « système de cytométrie par électroporation » récemment développé pour effectuer la microscopie à fluorescence sur cellules vivantes.

Protocole de cytométrie par électroporation pour la microscopie à fluorescence de cellules vivantes à l’aide de la culture de cellules U2 OS

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer un dispositif microfluidique unique à deux couches pour étudier la régulation électromécanique de l’homéostasie du tissu épithélial. L’appareil applique des courants électriques physiologiques statiques perpendiculaires au plan tissulaire, ce qui a un impact sur l’adhésion, la prolifération et l’extrusion entre les cellules. L’imagerie de cellules vivantes et les mesures de contraintes mécaniques révèlent les mécanismes de ces processus.

Révéler le contrôle électromécanique de l’homéostasie tissulaire à l’aide d’un dispositif microfluidique à deux couches

Ce protocole décrit un flux de travail complet et reproductible pour la simulation et la validation du champ électrique spécifique au patient et de la validation de l’électrochimiothérapie (ECT) pour les métastases spinales. Le flux de travail intègre l’imagerie multimodale, la segmentation semi-automatique et manuelle, la modélisation de la conductivité tissulaire, la simulation linéaire par éléments finis du champ électrique, et la validation expérimentale via une analyse de recouvrement de...

Simulation du champ électrique spécifique au patient lors de l’électrochimiothérapie par métastase spinale

Découvrez la modélisation computationnelle pour quantifier les seuils d'électroporation réversible et irréversible dans un modèle tissulaire tridimensionnel. Cette méthode optimise les protocoles de transfection cellulaire.

Modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation

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