Le clonage de navette basé sur CRISPR : une méthode de clonage à haut débit
June 13th, 2025
Nous décrivons un protocole pour une méthode de clonage à haut débit, le clonage de navette basé sur CRISPR (clonage CRISPRshuttle), qui permet le transfert de fragments d’ADN d’intérêt entre vecteurs sans avoir besoin d’amplification PCR des fragments d’ADN.
Nous décrivons notre protocole pour une méthode de clonage à haut débit, CRISPRshuttle. Ce qui implique le transfert de fragments d’ADN cibles entre vecteurs sans qu’il soit nécessaire d’amplifier les fragments d’ADN par PCR. Techniques existantes telles que l’infusion de passerelle et le clonage univectoriel, l’amplification PCR. Cette approche nécessite des procédures spécifiques à chaque fragment, y compris la conception primaire et la validation des sécrétions. Ces balises demandent beaucoup de travail et de temps. La navette CRISPR élimine la PCR tout en transférant des fragments d’ADN cibles entre les vecteurs dans des réactions séquentielles en éprouvette. Cette méthode dépasse la nécessité d’une manipulation spécifique des fragments et accélère ainsi la construction des échantillons.
[Narrateur] Pour commencer, préparez un mélange maître pour un nombre donné de réactions de digestion en combinant les réactifs affichés à l’écran. Disposez des tubes de 0,2 millilitre correctement étiquetés dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace. Préparez le mélange maître pour un nombre N de réactions en mélangeant des quantités appropriées de CAS9, d’ARNsg 10, de tampon CAS9 et d’eau traitée au DEPC. Mélangez soigneusement le mélange principal et faites-le tourner. Aliquote 3,75 microlitres du mélange principal dans chaque tube de réaction. Ajoutez 0,75 microlitre de plasmide PLX 304 ORF de 0,03 micromolaire dans chaque tube bien mélangé et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure. Préparez un mélange maître en combinant 0,14 microlitre de pBIDC-UASC-pLXvect linéarisé de 3,36 micromolaires et 1,8 microlitre de mélange maître d’assemblage Gibson. Mélangez soigneusement le mélange principal et faites-le tourner. Maintenant, aliquote 1,94 microlitres du mélange principal dans chaque tube. Ajoutez 1,66 microlitre de plasmide clivé CAS9 dans chaque tube. Bien mélanger et incuber à 50 degrés Celsius pendant une heure. Décongeler les cellules bactériennes compétentes sur de la glace. Aliquote 10 microlitres des cellules décongelées dans chaque tube de 1,5 millilitre pré-réfrigéré. Mélangez délicatement 10 microlitres des cellules compétentes avec un microlitre de produit d’assemblage Gibson. Placez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Choquez les tubes à 42 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez-les sur de la glace pendant deux minutes. Ajoutez 100 microlitres de milieu SOC préchauffé dans chaque tube et agitez à 250 tr/min pendant une heure à 37 degrés Celsius. Enfin, placez les cellules sur des plaques de gélose LB contenant 15 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Cette figure montre les résultats représentatifs de l’analyse de restriction des plasmides UAS-ADNc/ORF générés à l’aide du système CRISPRshuttle. Dans cette analyse, la digestion par restriction de 15 constructions UAS-ADNc/ORF avec PVU2 a révélé que tous les échantillons présentaient les motifs de fragments attendus à environ 1072 paires de bases et 1 820 paires de bases.
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Aperçu
Cet article présente un protocole pour une méthode de clonage à haut débit connue sous le nom de clonage par navette basé sur CRISPR (clonage CRISPRshuttle). Cette technique innovante facilite le transfert de fragments d'ADN entre vecteurs sans nécessiter d'amplification par PCR.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génie génétique
- Biologie moléculaire
- Technologie CRISPR
Contexte
- Les méthodes de clonage traditionnelles nécessitent souvent une amplification par PCR.
- La technologie CRISPR a révolutionné la manipulation génétique.
- Les méthodes à haut débit sont essentielles pour les études à grande échelle.
- Un transfert efficace des vecteurs est crucial pour diverses applications.
Objectif de l'étude
- Présenter une nouvelle méthode de clonage.
- Rationalisez le processus de transfert de fragments d'ADN.
- Éliminer le besoin de PCR dans les procédures de clonage.
Méthodes utilisées
- Développement du protocole de clonage CRISPRshuttle.
- Évaluation de l'efficacité dans le transfert d'ADN.
- Comparaison avec les méthodes de clonage traditionnelles.
- Application de la méthode dans divers systèmes de vecteurs.
Résultats principaux
- Transfert réussi de fragments d'ADN entre vecteurs.
- Temps et ressources considérablement réduits par rapport aux méthodes PCR.
- Haute efficacité démontrée lors de plusieurs tests.
- Potentiel de larges applications dans la recherche génétique.
Conclusions
- Le clonage CRISPRshuttle est une alternative viable aux méthodes traditionnelles.
- Cette méthode améliore l'efficacité en génie génétique.
- Des études futures peuvent tirer parti de cette technique pour des manipulations génétiques complexes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
High-throughput generation of genome-wide plasmid libraries is a critical enabler for systematic gene function studies and target validation in biopharma R&D. CRISPR-based shuttle cloning (CRISPRshuttle) eliminates PCR amplification, streamlining the transfer of DNA fragments between vectors and accelerating library construction. This capability enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assembly of genome-scale plasmid libraries for functional genomics screens.
- Supports systematic interrogation of gene function across diverse biological pathways.
- Facilitates biological de-risking and robust target validation by enabling high-throughput construct generation.
- Improves predictive confidence for downstream target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plasmid constructs for scalable screening workflows without PCR-induced sequence artifacts.
- Standardizes cloning outputs, supporting reproducibility and quantitative assay development.
- Accelerates readiness for high-throughput compound evaluation and phenotypic screening platforms.
- Enables efficient reuse of donor plasmid resources across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Streamlines the generation of disease-relevant genetic constructs for preclinical model development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid construct iteration.
- Reduces technical bottlenecks in translational biomarker and mechanistic studies.
- Enhances risk-adjusted advancement decisions by providing robust genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
CRISPRshuttle cloning integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless transition from hypothesis-driven gene selection to high-throughput construct generation and screening.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling rapid, scalable cloning of gene targets.
- Screening: Delivers standardized, PCR-free constructs for reproducible assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative outputs on cloning efficiency and construct integrity, supporting data-driven decision making.
- Translational Research: Facilitates the generation of constructs for disease-relevant models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput cloning platform for ongoing portfolio needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers high efficiency (>94%) and scalability, enabling rapid library generation by small teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by accelerating construct availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9-mediated cleavage and Gibson assembly techniques.
- Needs access to compatible donor plasmids and CRISPRshuttle-ready vectors.
- Demands standardized protocols for cross-team reproducibility and data integrity.
- Adaptation may be needed for diverse vector backbones or organism-specific systems.
- Efficiency and throughput are dependent on reagent quality and workflow optimization.
