Name: Le clonage de navette basé sur CRISPR : une méthode de clonage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Découvrez le clonage de navette CRISPR pour l'ingénierie génétique, une méthode à haut débit qui transfère des fragments d'ADN entre vecteurs sans amplification PCR. Cette technique innovante optimise les procédures de clonage moléculaire.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Poudre d’agar</td><td>Chembase</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Système automatisé d’analyse d’images numériques sur gel</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel E.Z.N.A.</td><td>Oméga</td><td>Réf. D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Mini Kit d’ADN plasmidique I</td><td>Oméga</td><td>Réf. D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>ONÉ</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>ONÉ</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN rapide à haut rendement</td><td>ONÉ</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>ONÉ</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur PCR</td><td>LongGene</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase Platinum SuperFi II</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>ONÉ</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start Haute-Fidélité 2x Master Mix</td><td>ONÉ</td><td>Référence M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Référence : Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Le Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>Promega</td><td>Référence M1801</td><td></td></tr><tr><td>Cellule chimiquement compétente Trans 10</td><td>TransGen</td><td>Référence CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoïde</td><td>Réf. LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>ONÉ</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoïde</td><td>LP0021 (en anglais)</td><td></td></tr></tbody></table>

le clonage de navette basé sur crispr : une méthode de clonage à haut débit

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Nous avons utilisé CRISPRshuttle pour construire une collection de plasmides UAS-cDNA/ORF couvrant 1 397 gènes humains conservés chez la drosophile7. L’analyse de restriction a révélé que CRISPRshuttle atteint une efficacité de 94,5 % pour l’utilisation de vecteurs de destination compatibles avec CRISPRshuttle contenant deux séquences répétitives et de 96,1 % pour l’utilisation de vecteurs de destination sans séquences répétitives7. Nos données ont démontré qu’en g...

Le clonage de navette basé sur CRISPR : une méthode de clonage à haut débit

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Nous décrivons notre protocole pour une méthode de clonage à haut débit, CRISPRshuttle. Ce qui implique le transfert de fragments d’ADN cibles entre vecteurs sans qu’il soit nécessaire d’amplifier les fragments d’ADN par PCR. Techniques existantes telles que l’infusion de passerelle et le clonage univectoriel, l’amplification PCR. Cette approche nécessite des procédures spécifiques à chaque fragment, y compris la conception primaire et la validation des sécrétions. Ces balises demandent beaucoup de travail et de temps. La navette CRISPR élimine la PCR tout en transférant des fragments d’ADN cibles entre les vecteurs dans des réactions séquentielles en éprouvette. Cette méthode dépasse la nécessité d’une manipulation spécifique des fragments et accélère ainsi la construction des échantillons.[Narrateur] Pour commencer, préparez un mélange maître pour un nombre donné de réactions de digestion en combinant les réactifs affichés à l’écran. Disposez des tubes de 0,2 millilitre correctement étiquetés dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace. Préparez le mélange maître pour un nombre N de réactions en mélangeant des quantités appropriées de CAS9, d’ARNsg 10, de tampon CAS9 et d’eau traitée au DEPC. Mélangez soigneusement le mélange principal et faites-le tourner. Aliquote 3,75 microlitres du mélange principal dans chaque tube de réaction. Ajoutez 0,75 microlitre de plasmide PLX 304 ORF de 0,03 micromolaire dans chaque tube bien mélangé et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure. Préparez un mélange maître en combinant 0,14 microlitre de pBIDC-UASC-pLXvect linéarisé de 3,36 micromolaires et 1,8 microlitre de mélange maître d’assemblage Gibson. Mélangez soigneusement le mélange principal et faites-le tourner. Maintenant, aliquote 1,94 microlitres du mélange principal dans chaque tube. Ajoutez 1,66 microlitre de plasmide clivé CAS9 dans chaque tube. Bien mélanger et incuber à 50 degrés Celsius pendant une heure. Décongeler les cellules bactériennes compétentes sur de la glace. Aliquote 10 microlitres des cellules décongelées dans chaque tube de 1,5 millilitre pré-réfrigéré. Mélangez délicatement 10 microlitres des cellules compétentes avec un microlitre de produit d’assemblage Gibson. Placez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Choquez les tubes à 42 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez-les sur de la glace pendant deux minutes. Ajoutez 100 microlitres de milieu SOC préchauffé dans chaque tube et agitez à 250 tr/min pendant une heure à 37 degrés Celsius. Enfin, placez les cellules sur des plaques de gélose LB contenant 15 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Cette figure montre les résultats représentatifs de l’analyse de restriction des plasmides UAS-ADNc/ORF générés à l’aide du système CRISPRshuttle. Dans cette analyse, la digestion par restriction de 15 constructions UAS-ADNc/ORF avec PVU2 a révélé que tous les échantillons présentaient les motifs de fragments attendus à environ 1072 paires de bases et 1 820 paires de bases.

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Les méthodologies de ciblage génique peuvent être utilisées pour générer des souris transgéniques avec des allèles knockout, knock-in et marqués.  Ici, nous décrivons une méthode améliorée de recombinaison chez E. coli, que nous appelons « sous-clonage plus insertion », qui peut être utilisée pour générer rapidement des vecteurs de ciblage génique personnalisés.

Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Ce protocole décrit les étapes pour le clonage de plusieurs ARN à guide unique dans un vecteur de vecteur de guide RNA, qui est particulièrement utilisé dans la création de knockouts multi-gènes utilisant la technologie CRISPR / Cas9. La génération de double knockouts dans les organoïdes intestinaux est une application possible de cette méthode.

Un protocole pour l&#39;élimination des gènes multiples dans les petits organoïdes intestinaux de souris à l&#39;aide d&#39;un concatériste CRISPR

Ici, un simple, efficace et rentable de clonage de sgRNA est exposée.

CRISPR Guide RNA clonage pour systèmes mammaliens

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Ce protocole décrit la transfection plasmique à haut débit des cellules de mammifères dans une plaque de 384 puits utilisant la technologie acoustique d'éjection de gouttelettes. La distribution et le multiplexage d'ADN, longs et sujets aux erreurs, mais aussi la distribution de réactifs transfection, sont pilotés par un logiciel et exécutés par un dispositif de nanodistributeur. Les cellules sont ensuite ensecées dans ces puits préremplis.

Multiplexage et transfection d'ADN à haut débit à l'aide de la technologie de nanodispensation acoustique

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Les systèmes CRISPR-Cas et les protéines anti-CRISPR ont été intégrés dans le schéma des portes booléennes chez Saccharomyces cerevisiae. Les nouveaux petits circuits logiques ont montré de bonnes performances et approfondi la compréhension des facteurs de transcription basés sur dCas9 / dCas12a et des propriétés des protéines anti-CRISPR.

Circuits numériques géniques basés sur des systèmes CRISPR-CAS et des protéines anti-CRISPR

Nous présentons un protocole d’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass), une méthode pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-ADNc/ORF chez la drosophile en utilisant des ressources d’ADNc/ORF accessibles au public. CRISPRmass peut être appliqué à l’édition de diverses banques de plasmides.

Assemblage modulaire basé sur CRISPR pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF

La lignée cellulaire THP-1 est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des monocytes/macrophages humains dans divers domaines de recherche liés à la biologie. Cet article décrit un protocole pour une ingénierie efficace basée sur CRISPR-Cas9 et l’isolement de clones unicellulaires, permettant la production de données phénotypiques robustes et reproductibles.

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Découvrez le clonage de navette CRISPR pour l'ingénierie génétique, une méthode à haut débit qui transfère des fragments d'ADN entre vecteurs sans amplification PCR. Cette technique innovante optimise les procédures de clonage moléculaire.

Le clonage de navette basé sur CRISPR : une méthode de clonage à haut débit

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