Une méthode d’imagerie optique compatible avec la microscopie électronique à balayage pour la cartographie céraire mesoscopique de toutes les cellules

Nos recherches portent sur la connectomique. Nous développons des méthodologies d’acquisition optique ou d’images électroniques à haut débit, permettant l’analyse d’un circuit neuro et des caractéristiques de connectivité synaptique pour déchiffrer la logique fondamentale de connexion des circuits neurologiques. La connectomique à haute révolution originale est limitée à de petits volumes cérébraux en raison de l’acquisition coûteuse et de la précision des données, tandis que l’analyse microscopique rapide et l’étude microscopique ciblée offrent un potentiel pour la connectomique cérébrale globale.

Comparé à d’autres approches microscopiques, telles que divers microscopes Larsens, l’OMLIT capture des images de tous les neurones avec des informations sur les dendrites et les axones. Outre sa compatibilité avec le microscope électronique, il existe d’autres images à résolution nanométrique sous EF. OMLIT aide à construire des modèles cérébraux complets, cartographiant toutes les projections à longue portée, y compris leur direction, leur intensité et leur caractère, aux côtés des micro-circuits locaux en combinaison avec le thème sériel. Il offre un aperçu de l’architecture structurée et du flux d’information à travers l’ensemble du cerveau.

Nous développons l’imagerie automatisée OMLIT et l’acquisition de données EM guidées par des IR définis par OMLIT, permettant une collecte et une analyse efficaces de données connectomiques sur des volumes cérébraux importants ou complets. Pour commencer, sélectionnez soit un film capton soit D50 d’une épaisseur de 50 micromètres, monté sur le système d’enroulement motorisé. À l’aide d’un système de sputtering à double tête magnétron, déposez un film uniforme et fin de chrome ou d’autres métaux tels que l’aluminium, l’argent ou le cuivre sur la surface du ruban.

Placez la bande à une distance de 80 millimètres de la cible en sting. Effectuez le procédé sous courant continu, et à une pression d’un pascal régulée par 99,99 % de gaz argon. Maintenant, réglez la vitesse d’enroulement de la bande à 0,6 millimètre par seconde pour obtenir une épaisseur de revêtement métallique de 50 nanomètres.

Après le dépôt, retirez la bande du système une fois qu’elle a refroidi à température ambiante. Évaluez l’épaisseur et l’uniformité du revêtement à l’aide d’un profileur au stylet, d’une microscopie à force atomique ou d’une microscopie électronique à balayage. Pour une stratégie à faible réflectivité, nettoyez et rendez la bande hydrophile à l’aide d’un nettoyant plasma à 80 watts tout en déplaçant la bande à sept millimètres par seconde.

Après le traitement, placez des gouttelettes d’eau sur la surface du ruban pour confirmer qu’elles se propagent rapidement en un film fin. À l’aide d’un petit meuleur ou d’un outil de coupe similaire, découpez grossièrement la résine du côté de l’échantillon pour enlever la résine vierge environnante et exposer la zone d’échantillon. Placez le bloc incrusté en résine dans le porte-échantillon et resserrez-le pour bien fixer le bloc.

Montez le porte-échantillon sur le bras mobile du microtome. Installez un couteau en verre ou un couteau de découpe diamant à un angle de 45 degrés sur le porte-couteau. Sous le microscope, découpez la surface de l’échantillon en forme de pyramide et lissez-la, puis découpez et lissez les quatre côtés du bloc d’échantillon pour éliminer l’excès de résine.

Faites pivoter le bouton pour aligner les bords avant et arrière du bloc en position horizontale. Retirez le couteau de taille et remplacez-le par un couteau diamanté, placé à un angle de 45 degrés. Réglez l’angle d’inclinaison de la base du microtome à six degrés et déplacez lentement le porte-couteau à l’aide du bouton jusqu’à ce que le bord avant du couteau soit à un à deux millimètres de la surface de l’échantillon.

Observez la bande brillante entre la surface de l’échantillon et le tranchant, et ajustez l’angle d’inclinaison pour que la bande soit uniforme de haut en bas et de côté à côté. Maintenant, injectez de l’eau distillée dans la rainure du couteau diamanté pour humidifier la lame. Retirez un peu d’eau avec une seringue jusqu’à ce que le niveau de liquide baisse et que le reflet paraisse argenté.

Ensuite, réglez l’épaisseur de la section, la vitesse de coupe et la fenêtre de coupe dans l’unité de commande. Ajustez la vitesse de coupe à 0,6 millimètre par seconde et l’épaisseur de la section à 60 nanomètres, selon la qualité de l’échantillon. Commencez à faire la coupe avec le microtome.

Une fois les sections stables et uniformes produites, il faut mettre le processus en pause. Ensuite, utilisez un pinceau fin pour enlever les sections coupées et les débris. Installez maintenant à la fois le bobine de ruban enduit et un bobine vide sur le système automatique de collecte à section ultra fine.

Sécuriser le mécanisme de verrouillage et effectuer un essai pour confirmer un mouvement fluide de la bande à vitesse constante et une bonne collecte sur la bobine de reprise. Immergez la tête de collecte du dispositif de collecte avec ruban adhésif dans le bain-marie du couteau diamanté et ajustez la tête pour qu’elle soit parallèle au tranchant à 1,5 fois la longueur de la tranche de l’échantillon. Sécuriser le dispositif de collecte et reprendre la sectionnement, tout en faisant fonctionner simultanément le dispositif de collecte de bande.

Après avoir collecté suffisamment de sections continues, pause le sectionnage. Coupez le ruban dans une zone sans sections. Faites fonctionner le dispositif de collecte de bande jusqu’à ce que toute la bande soit enroulée sur la bobine.

Ensuite, retirez la bobine et placez-la dans un four de séchage électronique. Nettoyez le dispositif de collecte de ruban et le microtome et remet tous les accessoires à leur place. Pour le montage sur une plaquette de silicium, retirez le film protecteur transparent du ruban conducteur double face.

Appliquez le ruban parallèlement au ruban conducteur double face, en plaçant jusqu’à trois segments de ruban sur chaque morceau. Placez la plaquette en silicium sur la platine du microscope optique, et fixez-la avec un ruban adhésif non résidual. Utilisez une lentille à objectif cinq X pour obtenir une image d’ensemble de la plaquette de silicium, du ruban et de l’échantillon.

Sur l’image d’ensemble, faites le contour de chaque section et triez-les, puis ajoutez des points de mise au point et d’exposition pour effectuer une imagerie automatique à un grossissement de 20 ou 50 X sur l’ensemble de la plaquette. Après l’imagerie, enregistrez les images et vérifiez leur qualité, en refocalisant et en réimageant si certaines sont floues ou de mauvaise qualité. Importez la pile d’images TIFF dans VAST 22 en sélectionnant importer, suivi d’importer le volume d’images des images vers le fichier VSV.

Connectez une tablette externe et utilisez l’outil pinceau et dessinez le mode segmentation pour segmenter et tracer manuellement les structures. Utilisez les raccourcis A et Z pour naviguer entre les tranches d’image. Visualisez maintenant la structure segmentée en trois dimensions en sélectionnant fenêtre, suivie d’un visualiseur 3D, visualisez et mettez à jour.

Enfin, enregistrez les résultats de segmentation après avoir sélectionné fichier et sauvegarder segmentation. Dans les images à haute réflectivité, les régions du lumen cytoplasmique et vasculaire présentaient une intensité plus élevée comparées aux zones environnantes, tandis que dans les images à faible réflectivité, les régions du lumen cytoplasmique et vasculaire présentaient une intensité plus faible. Les résultats quantifiés ont démontré que les stratégies de haute et faible réflectivité.

Chacune présentait des avantages en termes de contraste et d’entropie informationnelle. L’imagerie microscopique optique OMLIT a permis d’identifier des axones, vaisseaux sanguins, corps cellulaires et dendrites. La segmentation manuelle des images d’omelettes, utilisant VAST, montrait de nombreux corps cellulaires très bien disposés, des dendrites et des axones.

Les résultats segmentés ont été combinés avec l’image originale pour produire une visualisation tridimensionnelle : les images OMLIT agrandies montraient une résolution insuffisante pour révéler des structures plus fines. Les images de microscopie électronique de la même région ont révélé des synapses, des mitochondries, des noyaux cellulaires et des vésicules.