Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

La levure bourgeonnante Croce Visi a été largement utilisée pour étudier la biologie du vieillissement. Dans cet article, nous présentons un protocole général pour mesurer la durée de vie réplicative des cellules mères de levure. Bonjour, je suis Kristen Steffen du laboratoire de Brian Kennedy au Département de biochimie de l’Université de Washington.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour mesurer la durée de vie réplicative des cellules mères de levure. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les gènes qui influencent la durée de vie des cellules de levure. Alors commençons.

Pour l’expérience de durée de vie réplicative et la préparation des cellules de levure pour l’analyse de la durée de vie, des plaques YEPD solides doivent être préparées pour ce faire. Utilisez une technique stérile appropriée pour préparer ces plaques de gélose YEPD. Préparez au moins deux plaques pour quatre à cinq souches à analyser dans l’expérience de durée de vie.

Ces plaques doivent être préparées au moins deux jours avant l’expérience de durée de vie et laissées sécher avant de commencer l’essai de durée de vie. Si l’expérience n’a pas lieu dans les quatre à cinq jours suivant le versement des plaques, elles doivent être enveloppées dans un film de para ou de plastique et placées dans un incubateur réfrigéré pour éviter la dessiccation. Retirez les souches de levure des stocks congelés et des stries pour les colonies individuelles.

Sur les plaques de gélose YEPD. Jusqu’à six souches peuvent facilement être stries sur la même plaque YEPD en divisant la plaque en quartiers en forme de tarte de taille égale. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant deux jours.

Après l’incubation, retirez les cellules de l’incubateur et patchez les cellules d’une seule colonie sur une nouvelle plaque YEPD. À ce stade, les souches à analyser doivent être enrobées pour s’assurer que l’expérience de durée de vie réplicative est réalisée à l’aveugle. Où les dissecteurs ne connaissent pas l’identité des souches individuelles. Enchaîne.

Ensuite, incubez les cellules enrobées à 30 degrés Celsius jusqu’au lendemain soir. Retirez les cellules et patchez légèrement les cellules de chaque souche enrobée sur des plaques YEPD fraîches. Celles-ci serviront de plaques expérimentales utilisées pour la durée de vie répliquative.

Les cellules d’analyse doivent être placées le long d’une ligne verticale sur le côté gauche de la plaque YEPD. Ne transférez pas trop de cellules sur une seule plaque YEPD fraîche. Étant donné que cela provoquera une croissance épaisse des cellules pendant l’incubation pendant la nuit et affectera leur durée de vie réplicative, environ trois à cinq plaques par plaque sont optimales.

En supposant que l’analyse de la durée de vie réplicative sera effectuée sur 20 cellules de chaque patch, l’expérience de durée de vie est maintenant prête et tout ce qu’ils ont à faire est d’incuber toute la nuit sur la paillasse. Et puis demain on peut commencer la micro dissection pour positionner les cellules de levure sur la plaque et obtenir des cellules filles vierges. Pour l’analyse de la durée de vie répliquative.

Utiliser un microscope équipé d’un appareil de micro-dissection adapté aux levures. Transférez environ 50 cellules de la première souche du patch à une position sur la plaque distale aux cellules patchées. Si la platine de votre microscope est classée, ces gradations peuvent être utilisées pour s’assurer que les cellules seront faciles à trouver lors des itérations suivantes.

Parfois, les cellules peuvent se coincer dans l’aiguille, ce qui peut être un problème si elles sortent au mauvais moment. Pour vous assurer que l’aiguille est propre et exempte de cellules, touchez-la à la surface de la gélose à plusieurs reprises. Ensuite, créez un trou dans la gélose en forçant l’aiguille à travers la surface de la gélose.

Ce trou servira de marqueur pour vous orienter sur la plaque lors des itérations ultérieures de dissection et d’élimination des cellules de dotter. Veillez à ne pas mettre de cellules de levure dans le trou, sinon elles se développeront et formeront une colonie directement au-dessus du trou. Alignez verticalement les cellules de levure individuelles dans 20 positions régulièrement espacées avec un à trois diamètres d’aiguille entre chaque position de cellule.

Pour quelques cellules, placez deux cellules l’une à côté de l’autre au même endroit dans la ligne plutôt qu’une. Cela permet une redondance lors de la sélection de cellules filles vierges. Si l’une des cellules transférées ne parvient pas à se diviser entre les 10e et 11e positions de la ligne, créez une série horizontale de sept à huit trous dans la gélose.

Celui-ci servira de marqueur pour vous orienter sur la plaque lors des dissections ultérieures et des retraits de cellules filles. Encore une fois, veillez à ne pas mettre de cellules de levure dans les trous ou elles se développeront et formeront une colonie. Répétez cette procédure pour chaque patch sur la plaque, en continuant à disposer les cellules verticalement le long du même axe.

Il est important de se rappeler que lors de la création du trou dans l’AER pour que le nombre de trous créés corresponde au numéro de patch afin qu’il y ait un trou pour le premier patch, et deux trous pour le second. Une fois que les cellules ont été disposées pour chaque patch, paraformez la plaque et incubez à 30 degrés Celsius pendant environ deux heures. N’oubliez pas qu’à partir de ce moment, toutes les plaques doivent être parafilmées, sauf lors d’une dissection.

Afin d’éviter la dessiccation, répétez cette procédure pour chaque plaque. Dans l’expérience. Pour l’analyse de la durée de vie, il est important de s’assurer que chaque cellule commence comme une cellule fille vierge.

Pour ce faire, retirez d’abord les plaques de l’incubateur et vérifiez que la plupart des cellules de la matrice ont subi une division cellulaire. Donc, ce que nous avons ici, ce sont des cellules qui ont été alignées précédemment, et vous pouvez voir qu’après deux heures dans l’incubateur, elles ont commencé à se diviser. Et maintenant, nous avons une cellule mère, la plus grande attachée à son corps, la cellule fille vierge, et cette cellule fille vierge est une cellule qui sera utilisée pour commencer la vie.

Si vous avez besoin de plus de temps pour permettre aux divisions cellulaires de se terminer, remettez la plaque dans l’incubateur. En commençant par la première cellule du tableau. Utilisez l’aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère en plaçant doucement l’aiguille sur les cellules attachées.

Il est parfois utile de tapoter le côté de la base du microscope pendant que l’aiguille repose sur les cellules. Ensuite, placez la cellule fille détachée dans la ligne verticale des cellules, en remplaçant la cellule mère et toutes les cellules filles supplémentaires, et en les écartant temporairement. Répétez ces étapes pour chacune des cellules du tableau.

Si une cellule ne parvient pas à se diviser, prenez une cellule fille dans l’une des cellules redondantes situées à côté de la cellule de test. Une fois terminé, vous devriez avoir 20 cellules filles pour chaque patch alignées verticalement sur la plaque de durée de vie. Rassemblez toutes les cellules mères et les cellules filles supplémentaires dans une pile et transférez-les dans une zone près des parcelles appelée le cimetière.

Il est important de garder les cellules indésirables loin des cellules faisant l’objet d’une analyse de durée de vie afin d’éviter la formation de microcolonies et l’épuisement des nutriments locaux. Une fois les cellules séparées, para à partir de la plaque et incuber à 30 degrés Celsius pendant environ deux heures. Répétez ces étapes pour chaque plaque de l’expérience.

Pour mesurer la capacité de réplication des cellules individuelles, vous devrez préparer des fiches techniques de durée de vie. Une feuille de données de durée de vie peut être une simple grille où chaque ligne correspond à une cellule mère individuelle et chaque colonne correspond à un point d’âge. Veillez à étiqueter chaque fiche technique en fonction du nombre de souches à analyser.

Pour commencer, retirez d’abord les plaques de l’incubateur et vérifiez que la plupart des cellules de la matrice ont subi au moins une division cellulaire. Si vous avez besoin de plus de temps pour permettre à la division cellulaire de se terminer, remettez la plaque dans l’incubateur. Commencez par la première cellule de la puce sur la première plaque, et observez visuellement la ou les cellules mère et fille pour déterminer le nombre de divisions cellulaires qui se sont produites.

Il est généralement facile de déterminer le nombre de cellules filles qu’une mère a produites en se basant sur des modèles caractéristiques d’arrangement cellulaire. Celui-ci est très simple pour voir combien de cellules il a produit, car il y en a deux là-bas et elles sont de la même taille et elles sont toutes les deux plus petites que la mère. Notez le nombre de cellules filles produites par la cellule mère dans la case appropriée de la feuille de score de durée de vie.

Ensuite, utilisez l’aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère comme décrit précédemment en plaçant doucement l’aiguille sur les cellules attachées et en tapotant le côté de la base du microscope pendant que l’aiguille repose sur les cellules. Gardez la cellule mère dans sa position sur la ligne verticale et écartez temporairement la ou les cellules filles. Répétez ces étapes pour chacune des cellules du tableau.

Enfin, collectez toutes les cellules filles jetées et déplacez-les vers le cimetière situé près des parcelles d’origine. Parafilmez la plaque et incubez à 30 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Répétez l’élimination des cellules filles et l’incubation.

Étape pour chaque plaque de l’expérience. Répétez toute cette procédure jusqu’à ce que toutes les cellules mères aient cessé de se diviser. Gardez à l’esprit qu’à mesure que les cellules mères vieillissent, la progression du cycle cellulaire devient plus lente et qu’il sera souhaitable d’incuber la plaque pendant de plus longues périodes entre les points d’âge. Par la suite, les plaques peuvent être placées à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Les données brutes produites par une expérience de durée de vie réplicative sont une liste de nombres correspondant aux cellules filles produites par chaque cellule mère à chaque point d’âge. Comme on le voit ici. En additionnant chaque ligne de la feuille de score, on obtient la durée de vie réplicative de chaque cellule mère.

Les données d’autres cellules du même groupe expérimental peuvent être regroupées pour générer une courbe de survie et effectuer des calculs statistiques. La courbe devrait être à peu près cohérente avec la cinétique de Gomperts, montrant une forme sigmoïdale avec une faible mortalité précoce, suivie d’un déclin relativement rapide de la survie et d’un aplatissement de la courbe aux âges ultérieurs. Nous venons de vous montrer comment réaliser une expérience de durée de vie répliquative de levure.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules continueront à se diviser chaque fois qu’elles ne sont pas dans le froid. N’oubliez donc pas de mettre les plaques à quatre degrés pendant la nuit afin de ne pas vous retrouver avec trop de cellules filles à compter le matin. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.