Modèle murin d’embolie microvasculaire pour microscopie à deux photons in vivo utilisant des microspheres en polystyrène fluorescent

En utilisant cette méthode d’injection de microsphères, nous visons à démêler les conséquences à court et long terme du bouchage capillaire afin d’étudier les mécanismes potentiels de dégagement de l’embolie dans le réseau capillaire cérébral. Il permet l’imagerie in vivo en temps réel et le suivi des particules fluorescentes dans le réseau capillaire cortical. Les microspheres et les conséquences locales peuvent être suivies pendant des semaines après l’injection.

Nos études aident à comprendre les lésions tissulaires locales causées par les occlusions microvasculaires. Ces résultats pourraient, espérons-le, conduire à de nouvelles stratégies de traitement. Nous pouvons désormais étudier jour après jour et pendant des semaines comment le bouchage capillaire modifie les vaisseaux, active les cellules, modifie le flux sanguin et endommage la barrière hémato-encéphalique.

Pour commencer, pincez l’orteil d’une souris anesthésiée pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Effectuer une incision médiane d’environ 0,5 centimètre au-dessus de la trachée sous la mandibule à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces de disséque. Disséquez le tissu conjonctif superficiel du fascia cervical à l’aide de pinces de micro-suture pour exposer les muscles hyoïdes sternaux sous-jacents.

Séparez maintenant les muscles hyoïdes sternaux gauche et droit en déchirant doucement le tissu conjonctif entre eux. Rétractez le muscle omohyoïdien droit caudal-latéralement avec un crochet de tissu. Assurez-vous que le triangle carotide droit, y compris l’artère carotide commune, l’artère carotide interne et l’artère carotide externe, soit clairement visible.

Ensuite, retirez tout fascia et tissu adipeux restants entourant l’artère carotide commune. Séparez soigneusement l’artère carotide commune du nerf vague. Placez deux fils 4/0 1,5 autour de l’artère carotide commune et nouez-les lâchement, en veillant à ce que les nœuds ne gênent pas la circulation sanguine.

Retirer le fascia et le tissu adipeux de l’artère carotide interne et de l’artère pariétale postérieure. Ensuite, liguez temporairement l’artère pariétale postérieure et toutes les branches latérales carotides internes, y compris l’artère occipitale, en nouant un nœud avec un fil 4/0 1,5. Retirer le fascia et le tissu adipeux de l’artère carotide externe et de l’artère temporale.

Placez deux nœuds lâches autour de l’artère carotide externe et de l’artère temporale en utilisant un fil 4/0 taille 1,5. Placez le fil le plus distal aussi loin que possible de la bifurcation en forme de Y, et utilisez-le pour liganer de façon permanente l’artère carotide externe et l’artère temporale. Laissez le nœud proximal défait.

Homogénéisez et soniez les microsphères de 10 micromètres pour obtenir une suspension uniforme des particules individuelles. Ajoutez 20 microlitres de microsphères homogénéisées à 140 microlitres de FITC-Dextran pour obtenir un volume final de 160 microlitres de mélange contenant 1,44 fois 10 à la puissance de cinq microsphères. Rétractez brièvement la seringue reliée au cathéter pour créer un sas.

Ensuite, immergez la pointe du cathéter dans le mélange préparé FITC-Dextran/Tween20/microsphère et retirez lentement la seringue jusqu’à ce que le mélange soit dans le cathéter. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le cathéter. Placez la seringue avec le cathéter chargé dans la pompe à seringue.

Réglez la pompe à 10 microlitres par minute et faites fonctionner jusqu’à ce qu’une petite goutte de mélange microsphere apparaisse à l’extrémité du cathéter. Placez maintenant une pince pour un vaisseau sur l’artère carotide interne et resserrez l’un des nœuds proximaux préalablement préparés autour de l’artère carotide commune. À l’aide de microciseaux, réalisez une petite incision diagonale dans l’artère carotide externe à environ 0,5 millimètre de distance par rapport au fil de ligatura, en veillant à ce que la taille de l’incision soit légèrement inférieure au diamètre du cathéter.

Absorbez tout sang avec un chiffon stérile. Allumez brièvement la pompe à seringue pour former une goutte de mélange de microsphère à l’extrémité du cathéter, afin de confirmer qu’il ne reste plus d’air dans la pointe du cathéter. Ouvrez l’incision de l’artère carotide externe et insérez le cathéter à l’aide de micro-pinces fines.

Ensuite, fixez le cathéter dans l’artère carotide externe en resserrant la suture proximale autour de l’artère carotide externe. Pompez progressivement à 10 microlitres par minute jusqu’à ce que l’artère s’élargisse visiblement et que le colorant vert FITC remplisse l’artère carotide externe, confirmant ainsi une injection réussie. Ensuite, retirez la pince du vaisseau de l’artère carotide interne.

Ensuite, augmentez le débit de la pompe à seringue à 20 microlitres par minute. Confirmez la réussite de l’injection de microsphère en vérifiant que la bifurcation de l’artère carotide interne, distale à l’artère pariétale postérieure, est remplie de colorant FIC. Une fois l’injection réussie, retirez le fil qui ligait l’artère carotide commune afin de permettre au mélange microsphérique de s’écouler vers l’artère carotide interne.

Pendant l’injection, le colorant FITC peut encore être observé dans l’artère carotide externe. Coupez la pompe à seringue dès que le mélange dans le cathéter atteint la barre des 80 microlitres pour arrêter l’injection. Ensuite, ligadez l’artère carotide commune, clipsez la carotide interne, puis retirez doucement le cathéter tout en maintenant le fil de fixation en place.

Liguez définitivement l’artère carotide externe en resserrant le fil qui maintenait le cathéter. Retirez la pince du vaisseau et les fils autour de l’artère carotide commune, de l’artère carotide interne et de l’artère pariétale postérieure pour rétablir le flux sanguin. Le succès de la chirurgie de l’embolie microvasculaire a été confirmé par l’imagerie post mortem du corps entier et du cerveau complet sur place, quatre jours après l’opération.

Une tranche cérébrale sagittale a montré un logement de microspheres dans le cerveau. Les cerveaux de souris extraits un jour après l’opération ont montré que les microsphères étaient principalement logées dans l’hémisphère ipsilatéral, dans le territoire de flux des artères cérébrales moyenne et antérieure. Le nombre de microspheres dans les tranches de cerveau a été significativement augmenté lorsque Tween20 a été ajouté au mélange de microsphères.

Les souris ont perdu moins de poids et se sont rétablies plus rapidement après l’opération lorsqu’elles ont été injectées avec un mélange de microsphère contenant Tween20. Les images de microscopie à fluorescence du cortex cérébral prises 0,5 heure après l’opération ont montré des points blancs individuels, représentant des microspheres occultant les capillaires. Les images de projection à deux photons par pile z montraient des microsphères provoquant des embolies microvasculaires cérébrales avec une perfusion altérée.

Les embolies provoquent également une perturbation de la barrière hémato-encéphalique avec une fuite visible de colorant depuis les vaisseaux.