Microscopie à deux photons pour l’imagerie in vivo de la microvascularisation du cerveau de souris

Commencez avec une souris anesthésiée avec une plaque frontale fixée sur une fenêtre corticale mince du crâne préparée chirurgicalement.

Positionnez la souris en position couchée. Retirez la peau médiale de la cuisse pour exposer la veine fémorale.

Injectez un conjugué de colorant fluorescent dans la veine pour marquer le plasma sanguin, permettant ainsi la visualisation des vaisseaux sanguins.

Suturez l’incision.

Retournez la souris et fixez la plaque frontale dans un harnais pour stabiliser la souris.

Transférez la configuration sur une platine de microscope à deux photons.

Ajoutez une solution saline sur la fenêtre corticale. Abaissez la lentille de l’objectif jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec la solution saline.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, localisez la zone d’imagerie.

Passez à l’imagerie à deux photons.

Le laser du microscope focalise une lumière proche infrarouge de faible énergie dans le cerveau.

Au point focal du laser, deux photons combinent leur énergie pour exciter le colorant, rendant les vaisseaux sanguins fluorescents.

Identifiez un lit capillaire – un réseau de petits vaisseaux sanguins reliant les artères aux veines – et agrandissez-le.

Acquérir des images pour analyser la microvascularisation du cerveau.

Dans cette procédure, retirez la peau de la cuisse médiale gauche de la souris. Ensuite, localisez la veine fémorale. À l’aide d’une seringue de 1 millilitre et d’une aiguille de calibre 30, prélevez 130 microlitres de la solution de colorant fluorescent. Injectez lentement 100 microlitres de colorant dans la veine fémorale.

Après avoir retiré l’aiguille, appliquez une pression constante et douce sur le site d’injection pour arrêter tout saignement, et laissez le colorant circuler pendant cinq minutes. Ensuite, fermez le site chirurgical avec des sutures. Retournez délicatement la souris sur le ventre et placez-la dans le harnais de la plaque de tête de souris. Pour l’imagerie à deux photons in vivo, déplacez l’appareil chirurgical vers le microscope à deux photons et assurez-vous de maintenir le niveau d’anesthésie de l’animal.

Ensuite, placez une petite quantité de solution saline à 0,9 % dans le réservoir de la plaque de tête et abaissez l’objectif du microscope de manière à ce qu’il entre en contact avec la solution saline. Ensuite, localisez la zone d’intérêt à l’aide de l’objectif de visualisation en fond clair. Ensuite, commencez l’imagerie à deux photons. Localisez un lit capillaire sur l’écran de visualisation et agrandissez cette zone à l’aide du zoom optique 2. Acquérez des images des capillaires à l’aide du logiciel d’imagerie à deux photons.