Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez une souris à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence à deux photons

Fixez une souris anesthésiée avec une fenêtre crânienne sur son cortex moteur sur un tapis roulant.

La souris exprime un rapporteur de la protéine kinase-A dans les neurones corticaux.

Placez le tapis roulant sous un objectif FLIM à deux photons.

Ajoutez une gouttelette d’eau entre l’objectif et la fenêtre crânienne.

Laissez la souris se réveiller et s’acclimater au tapis roulant.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, localisez la zone d’imagerie. Fermez l’enceinte du microscope pour bloquer la lumière externe.

Réglez les paramètres d’imagerie, lancez la rotation du tapis roulant pour induire la locomotion et commencez l’imagerie.

La locomotion forcée active la PKA, qui phosphoryle le rapporteur, rapprochant ses fluorophores donneur et accepteur.

Le microscope dirige un laser infrarouge, incitant le donneur à transférer de l’énergie à l’accepteur, réduisant ainsi la durée de vie de la fluorescence du donneur.

Lorsque la locomotion s’arrête, la PKA et le rapporteur retournent à leur état inactif, ce qui diminue le transfert d’énergie et augmente la durée de vie de la fluorescence du donneur.

Analysez les images pour comparer les niveaux de PKA corticale au repos et en locomotion.

Au moins deux semaines après l’installation de la fenêtre crânienne, réglez la longueur d’onde du laser d’excitation à deux photons à 960 nanomètres et confirmez une absence de réponse au pincement des orteils chez la souris expérimentale anesthésiée. Placez la souris anesthésiée sur le tapis roulant motorisé et montez la plaque de tête de la souris sur le support de plaque de tête de la configuration du tapis de course. Nettoyez la surface de la lamelle de la fenêtre crânienne avec de l’éthanol à 70 % et placez le tapis roulant motorisé sous l’objectif 2pFLIM.

Appliquez une goutte d’eau distillée entre la lamelle de la fenêtre crânienne de l’objectif et laissez la souris se réveiller et s’acclimater à l’environnement du tapis roulant et du microscope pendant au moins 10 minutes. Naviguez jusqu’au point d’injection sous épi-illumination et documentez les caractéristiques repères sous fond clair pour faciliter l’imagerie de la même région d’intérêt lors des sessions d’imagerie ultérieures.

Éteignez la source lumineuse épi-illumination. Fermez le boîtier du banc de microscope 2pFLIM. Pour activer les tubes photomultiplicateurs du microscope 2pFLIM, activez le contrôle de tension de commande matérielle. Pour acquérir une image 2pFLIM de pile Z, définissez la taille de l’image sur 128 x 128 pixels. La vitesse de balayage est de 2 millisecondes par ligne, le champ de vision est de 90 à 100 micromètres dans le cadre, avec une moyenne de trois images.

Ajustez les paramètres d’imagerie en fonction de la préparation et de la configuration matérielle. Et inspectez l’image acquise en mode FLIM. Utilisez un champ de vision réduit, une vitesse de balayage réduite, une puissance laser accrue et un nombre accru d’images à moyenner pour augmenter le nombre de photons intégrés et réduire l’erreur d’estimation de la durée de vie si nécessaire.

Assurez-vous d’obtenir suffisamment de photons par région d’intérêt. Un nombre de photos intégré réalisable pour un soma positif en vue est d’environ 1 000 à 10 000 photons.

Lorsque l’image a été optimisée, acquérez des images de base répétées de la pile Z à intervalles réguliers pendant au moins 15 minutes à vitesse 0 sur le tapis de course. Réglez ensuite la rotation du tapis roulant à environ centimètres par seconde pendant 15 minutes lors de l’acquisition d’images 2pFLIM, suivie d’au moins 20 minutes d’acquisition d’images après avoir désactivé la rotation du tapis roulant pour évaluer la durée de l’activité de la protéine kinase A après l’arrêt de la locomotion forcée.

Pour l’analyse d’images 2pFLIM, ouvrez les images en vue film et cliquez sur les champs de portée minimale et maximale de comptage de photons uniques pour saisir les valeurs de portée minimale et maximale de comptage de photons uniques appropriées. Cliquez sur le champ de valeur de temps 0 pour entrer la valeur de temps 0, puis cliquez sur le champ de valeur de seuil de luminance minimale de durée de vie pour entrer la valeur de seuil souhaitée entre 5 et 30 photons.

Cliquez sur le bouton Nouveau groupe et attribuez un nom de groupe d’expérience pour générer un groupe qui combine les données de chaque image FLIM ajoutée. Cliquez sur Région d’intérêt dans le module de contrôle de la région d’intérêt et dessinez une région d’intérêt autour d’un soma T-ACCR alpha-positif. Déplacez les limites Z inférieure et supérieure dans les curseurs de contrôle de la pile Z pour réduire la plage de la pile Z et minimiser la contamination du signal provenant des photons d’arrière-plan et d’autres creux Z et cliquez sur Plus pour ajouter l’image FLIM au groupe.

Cliquez sur calc pour calculer la durée de vie moyenne dans l’erreur d’estimation de la durée de vie pour la région d’intérêt, puis ouvrez le fichier suivant de la série d’imagerie 2pFLIM. Mesurez le même soma T-ACCR alpha-positif dans chaque image consécutive au fil du temps, en ajustant la région d’intérêt autour du soma si nécessaire. Une fois que toutes les images ont été analysées, sélectionnez le temps d’émission de photons moyen delta photoémission moyenne delta T0 dans le module de commandes de groupe, puis cliquez sur le champ du numéro de référence pour entrer l’index des images qui vous intéressent afin de définir les images utilisées pour calculer la durée de vie de référence.

Ensuite, cliquez sur tracer pour générer un graphique contenant la réponse FLIM à l’activité positive de T-ACCR alpha pendant l’expérience dans les régions d’intérêt définies afin de permettre une comparaison de l’activité de la protéine kinase A pendant la locomotion de la kinase dans différentes régions d’intérêt.