Analyse de profilage de thrombus : une plateforme basée sur la microfluidique pour caractériser de manière exhaustive la thrombogenèse biomécanique

Nous avons développé une nouvelle méthode capable de capturer adéquatement les attributs biomécaniques de la thrombose et de détecter également les anomalies prothrombotiques chez l’humain. Pour commencer, utilisez une plaquette en silicium pour fabriquer un moule maître photorésine SU8 via photolithographie standard basée sur le design, puis fixez le moule maître au fond d’une boîte de Pétri de 15 centimètres avec du ruban adhésif. Préparez le mélange de polydiméthylsiloxane, ou PDMS, en mélangeant la base prépolymère et l’agent de durcissement du kit d’élastomère en silicone à un rapport poids de 10 pour 1.

Versez le mélange PDMS sur le moule maître. Ensuite, placez la plaque contenant le mélange PDMS dans un dessicateur sous vide pour le dégazer. Durcez thermiquement le mélange PDMS en le plaçant dans un incubateur réglé à 75 degrés Celsius pendant deux heures.

Après avoir retiré l’échantillon de l’incubateur, découpez soigneusement les PDMS durcis du moule maître, puis séparez les PDMS durcis en unités individuelles de puces. À l’aide d’une aiguille de sonde, percez les trous aux emplacements désignés pour créer l’entrée et la sortie. Dans une hotte chimique, utilisez une lingette humide à 75 % d’éthanol pour nettoyer les lames en verre et les sécher.

Ensuite, à l’aide d’un générateur haute fréquence, traitez les lames en verre pendant 30 secondes et les puces PDMS pendant 20 secondes. Alignez chaque éclat avec une glissière en verre et appuyez doucement sur la surface de la culasse en verre pour la lier. Maintenant, fixez la liaison thermique des appareils en les plaçant dans un four réglé à 150 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après collage, conservez les appareils à température ambiante dans des conditions sans poussière. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez la partie plastique des aiguilles de la sonde et pliez les tubes métalliques à 90 degrés pour créer des connecteurs pour les dispositifs microfluidiques. Après avoir mis en place les réactions pour conjuguer le fibrinogène et les anticorps nécessaires avec Alexa Fluor, centrifugez les colonnes de purification à 1 100 G pendant deux minutes pour retirer le tampon de stockage.

Après avoir écarté le flux, chargez la solution de réaction sur la colonne de purification montée dans un flacon de collecte compatible et centrifugez à 1 100 g pendant cinq minutes pour récolter le mélange requis. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez l’absorbance de la protéine et du signal du colorant. Calculez la concentration en protéines et le rapport fluorescence/molaire protéique.

Conservez les colorants à quatre degrés Celsius dans le noir. Ajoutez de l’héparine au tampon Tyrode à une concentration finale de 0,32 unité par millilitre pour 10 millilitres de sang à collecter, puis préparez la seringue en aspirant 500 microlitres de tampon Tyrode au pH 7,4. Après avoir prélevé le sang par ponction venaise dans la seringue contenant de l’héparine, transférez-le dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres et maintenez-le à 37 degrés Celsius.

Diluez le monomère du facteur Von Willebrand à deux microgrammes par millilitre dans PBS. Pré-recouvrir les dispositifs microfluidiques avec le monomère de facteur de von Willebrand dilué et les incuber pendant une heure à température ambiante. Maintenant, incubez l’échantillon de sang avec un capteur fluorescent réglé 1 ou 2 pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, connectez un dispositif microfluidique avec des connecteurs d’entrée et de sortie et des tubes. Connectez l’autre extrémité du connecteur d’entrée à un tuyau contenant le PBS, puis connectez l’autre extrémité du connecteur de prise à une seringue. Montez la seringue sur une pompe à seringue et le dispositif microfluidique sur un microscope inversé.

Manœuvrez manuellement l’étage du microscope pour localiser le site de la sténose. Remplissez le canal microfluidique et le tube avec du PBS à l’aide de la pompe à seringue à un débit de 0,5 millilitres par minute. Inspectez l’appareil pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est présente autour du site de la sténose.

Reliez le tube d’entrée à l’échantillon de sang et perfonez l’échantillon de sang à travers le canal microfluidique à l’aide de la pompe à seringue à un débit de 0,018 millilitres par minute. Dans un microscope inversé, réglez le temps d’exposition et le gain pour chaque canal de fluorescence dans le logiciel. Réalisez l’imagerie à fluorescence multicolore en temps réel en alternant entre les quatre canaux et en excitant un fluoro-4 à la fois.

Ajustez le plan de mise au point au thrombus et enregistrez les signaux fluorescents au site de la sténose pendant 15 à 30 minutes. Pour l’analyse des données, ouvrez le fichier de données avec ImageJ version 1.53. Utilisez le canal C ajusté SZ 22 pour identifier le contour du thrombus.

Ensuite, en utilisant les sélections de polygones, sélectionnez approximativement la zone du thrombus. Pour chaque canal, éliminez le signal de fond en sélectionnant image, ajustement, puis Seuil. Enfin, mesurez la surface et l’intensité moyenne du signal dans le thrombus en sélectionnant Analyser et en choisissant Mesurer.

Des instantanés représentatifs ont montré des thrombes formés dans le sang sain au sein du canal sténotique avec des plaquettes, du fibrinogène, du facteur von Willebrand et de la P-sélectine visualisés à l’aide du jeu de capteurs 1, et des plaquettes, phosphatidylsérine, intégrine alpha IIb bêta 3 E-positive, une intégrine alpha IIb bêta 3 activée visualisée à l’aide du jeu de capteurs 2. Une seule image de canal de fluorescence a été traitée en sélectionnant la zone du thrombus, en supprimant le signal de fond et en mesurant la surface du signal ainsi que la luminosité moyenne afin de permettre une analyse quantitative. L’analyse continue de l’intensité du signal fluorescent au fil du temps a généré une courbe signal en fonction du temps pour l’accumulation des plaquettes lors de la formation du thrombus.

Pour chaque point temporel, les intensités totales du signal ont été obtenues pour quatre biomarqueurs dans le jeu de capteurs un et quatre biomarqueurs dans le jeu de capteurs deux. La taille du thrombus a été calculée et un profil de thrombus en sept dimensions a été généré. Actuellement, aucun biotest n’est disponible pour évaluer la tendance prothrombotique des patients humains, et nos travaux tentent de combler cette lacune.

En détectant l’activité biomécanique des échantillons de sang, notre test peut évaluer de manière exhaustive les attributs prothrombotiques des sujets. Notre test peut être développé en test clinique pour détecter la tendance prothrombotique chez les patients, et il peut également être utilisé pour dépister des médicaments antithrombotiques de nouvelle génération.