Modèle de maladie microfluidique in vitro pour étudier les interactions endoteléliales du sang entier et la dynamique des caillots sanguins en temps réel

Nous présentons un modèle in vitro de maladie vasculaire pour étudier des interactions de sang entier avec l’endothélium patient-dérivé. Ce système permet l’étude des propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales primaires dans diverses circonstances. La méthode est particulièrement adaptée pour évaluer la thrombogénicité in situ et la thérapie anticoagulation pendant les différentes phases de la coagulation.

Ce modèle de maladie in vitro, peut être utilisé pour étudier l’interaction du sang entier et des cellules dérivées du patient, en particulier l’endothélial, pour évaluer la thrombogénicité et l’efficacité des agents anticoagulants. Il s’agit de cellules d’endothélium peuvent être utilisés dans diverses circonstances et peuvent être modifiées en introduisant des microfluidiques sur mesure ou en ajustant les paramètres du flux sanguin. En outre, ce modèle peut être employé pour étudier la dynamique de thrombus dans des conditions inflammatoires, ou pour évaluer les effets de la thérapie d’anticoagulant et d’antiplaquettaire.

En fin de compte, ces approches peuvent être utilisées dans une méthode de médecine personnalisée. Après avoir obtenu un échantillon chirurgical de tissu d’artère pulmonaire humaine, enduire le plat de culture cellulaire de haute affinité de 60 millilitres avec deux millilitres de cinq microgrammes par milliliter fiboronectin et incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. À la fin de l’incubation, utiliser des forceps stériles dans une armoire à écoulement laminaire dans des conditions stériles, pour transférer le tissu dans une boîte de Pétri de PBS.

Si le tissu est encore dans un anneau, couper l’artère ouverte avec des ciseaux, en prenant soin de ne pas toucher la couche la plus interne du récipient, comme l’endothélium est facilement endommagé et enlevé. Après avoir enlevé la fibronectine, ajouter quatre millilitres de milieu cellulaire endothélial complet au plat et utiliser des forceps pour transférer l’échantillon de tissu dans le milieu, utiliser un scalpel pour gratter soigneusement la couche interne du vaisseau dans le milieu, en prenant soin d’éviter les accumulations lipidiques qui sont observées dans la paroi du navire. Une fois les cellules récoltées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

Si les fibroblastes contaminent la culture, utilisez la séparation des cellules d’affinité magnétique pour un CD144, selon les instructions du fabricant pour purifier les cellules. En général, la culture est définie comme pure, lorsque la cytométrie du débit détecte 10 % ou moins de cellules contaminantes. Lorsque le nombre suffisant de cellules endothéliales ont été obtenues à des fins expérimentales, les cellules endothéliales primaires peuvent être caractérisées pour la présence de marqueurs spécifiques aux cellules endothéliales et pour l’absence de marqueurs musculaires et épithéliales lisses.

Pour la préparation des chambres d’écoulement, codez un canal d’une glissière de six puits avec 30 microlitres de gélatine de 0,1 % et incubez cette diapositive pendant au moins 15 minutes à 37 degrés Celsius. En plus des chambres d’écoulement commerciales, des chambres d’écoulement sur mesure avec des dimensions spécifiques peuvent être utilisées pour étudier l’influence de la géométrie vasculaire sur la dynamique des caillots. Pendant que la diapositive est en incubation, recueillir les cellules d’une culture cellulaire endothéliale de l’artère pulmonaire confluente avec EDTA et trypsine et sédiments que les cellules par centrifugation, suspendre la pastille dans 600 microlitres de milieu cellulaire endothélial complet et avec force, mais doucement, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque canal, ajouter 50 microlitres supplémentaires de milieu cellulaire endotélial complet au canal , pour fournir un milieu suffisant pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, changer le milieu le lendemain pour laver les cellules non liées.

Après six jours de culture, les cellules auraient dû former un monocouche confluent stable. Le septième jour de la culture des cellules endothéliales de l’artère pulmonaire, acquérir un échantillon de sang veineux de sujets qui ne reçoivent pas de traitement anticoagulation dans 109 tubes anticoagulants de citrate monosodique et transférer le sang dans un tube de 50 millilitres. Le sang peut contenir des virus et d’autres agents infectieux.

Par conséquent, il est important de toujours porter des gants et de suivre les conseils de sécurité pour travailler avec du matériel humain. Fluorescently étiqueté les cellules sanguines avec 1 à 10.000 concentration de Calcein AM Rouge et 50 microgrammes par millilitre et ajouter Alexa 488 fibrinogen, puis incuber le sang à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre une absorption complète. 30 minutes avant la perfusion, traiter les cellules endothéliales de l’artère pulmonaire avec 100 microlitres d’une histamine micromolaire dans le milieu cellulaire endothélial et 1% sérum bovin fœtal sans autres additifs.

Et utilisez une seringue de 20 millilitres remplie de tampon de lavage pour rincer les tubes du système d’écoulement, charger une seringue de 3 à 20 millilitres avec deux millilitres de tampon de lavage et charger la seringue sur une pompe à seringues. Utilisez une deuxième seringue de 20 millilitres pour remplir les tubes d’écoulement avec des hippies plus tampon contenant 1% d’albumine sérique bovine et utiliser une forme de coude Laura connecteur pour connecter soigneusement les tubes à la diapositive micro, connecter la sortie de la diapositive à la seringue, réparer par microscopie en plaçant la cellule contenant glisser sur la scène et l’assemblage de la configuration pour l’expérience , ajustez le microscope et définissez les paramètres de l’imagerie. Recalcification du sang emphatique.

Et c’est un co-sponsor heureux de la coagulation, en outre essayer d’éviter la formation de bulles d’air, car cela endommagera la couche cellulaire endothéliale et influencer vos résultats. Immédiatement avant la perfusion, diluer le sang à deux reprises avec le tampon de recalcification et placer le tube d’entrée de la micro glissière dans le tube de sang, appuyez sur démarrer sur la pompe à seringues. Dès que le sang commence à couler sur l’endothélium, appuyez sur démarrer sur le microscope pour acquérir des images en utilisant les canaux actifs présélectionnés et la région des positions d’intérêt, toutes les 15 secondes pendant cinq minutes.

À la fin de l’analyse, arrêtez l’enregistrement et la pompe à seringues et nettoyez correctement. L’étiquetage des plaquettes avec Calcein AM Red et l’ajout de fibrinogen conjugué Alexa 488 permettent d’étude de la formation de thrombus par adhérence plaquettaire et fibre et dépôt. Dans des conditions non stimulées, il n’y a pas de liaison de plaquettes ou de fibrine à l’endothélium.

La stimulation avec l’histamine entraîne une augmentation immédiate de l’adhérence plaquettiste, qui atteint un plateau après 2,5 minutes, à ce moment-là, les plaquettes commencent à sécréter des facteurs d’autocrine qui induisent une agrégation plaquettiste et un clivage fibrinogen à la fibrine, entraînant des fibres et des dépôts à trois minutes et la formation d’un agrégat stable avec les plaquettes après quatre minutes. Le traitement par un anticoagulant direct inhibe à la fois la formation de caillots et l’adhérence plaquettière par rapport au sang non traité. L’analyse immunofluorescente des interactions endothéliales de plaquette de cellules d’artère pulmonaire après cinq minutes de perfusion, révèle le maintien de la cellule endothéliale, contacts cellulaires, comme confirmé par la coloration vasculaire de cadhérine endothéliale, indiquant que les caillots sanguins se forment sur des couches endothéliales de modèle plutôt que sur la matrice sous-jacente entre les lacunes endothéliales.

Les cellules endothéliales ombilicales humaines démontrent moins d’adhérence plaquettaires et de dépôt de fibrine comparées à l’endothélium pulmonaire d’artère. Notamment, les cellules endothéliales primaires malades d’artère pulmonaire des patients chroniques d’hypertension pulmonaire thromboembolic, montrent une adhérence accrue de plaquette et un dépôt plus fibrin comparé aux cellules saines. La thrombogénicité de l’endothélium dépend de facteurs multiples comme l’origine du lit vasculaire ou les parties du fond biologique.

En utilisant ce protocole, les dysfonctionnements intrinsèques dans les composants vasculaires et sanguins, ainsi que l’efficacité de la thérapie anticoagulée peuvent être testés au cours de différentes phases de thrombose hémostase. Ce protocole peut être utilisé pour comprendre le sang et les interactions théo, dans diverses maladies thromboemboliques avec le potentiel ultime de prédire les réponses spécifiques du patient à la thérapie anticoagulante.