Génération et analyse transcriptomique unicellulaire des organoïdes du carcinome hépatocellulaire après un traitement médicamenteux

Nous nous concentrons sur la manière dont les organoïdes du CHC réagissent au traitement médicamenteux et sur l’évolution de leurs études translationnelles au travail. Ce protocole est utile pour les organoïdes du CHC, et peut également être adapté à d’autres systèmes organoïdes tumoraux. Pour commencer, établissez un carcinome hépatocellulaire ou des organoïdes dérivés du patient par HCC, et préparez-les à une perturbation thérapeutique.

Préparez la solution de stock de lenvatinib dans du diméthylsulfe, ou DMSO, conformément aux instructions du fabricant. Diluez la solution de base dans un milieu de culture pré-chaud immédiatement avant utilisation, à la concentration de travail prédéfinie. Préparer suffisamment de solution pour obtenir des volumes finaux égaux dans tous les puits, en assurant la même concentration de DMSO sur chaque puits.

Ensuite, ajoutez un milieu contenant du lenvatinib à 20 micromolaires le long de la paroi de chaque puits pour éviter de perturber les dômes matriciels. Inclure un contrôle de véhicule avec la même concentration finale de DMSO. Incuber les organoïdes dans des conditions de culture standard pendant la période de traitement prédéfinie.

Pour les traitements dépassant 72 heures, remplacez le milieu contenant le médicament toutes les 48 à 72 heures, afin d’assurer un calendrier de remplacement cohérent sur tous les puits. Enregistrez des images de base en champ clair avant traitement. Obtenir des images à intervalles fixes pendant le traitement en utilisant les mêmes réglages de microscope, le même grossissement et les positions de champ.

Pour une évaluation morphologique de la réponse au traitement, utilisez des réglages d’exposition, un grossissement et des seuils d’analyse identiques pour toutes les images. Mesurez la courbe de croissance de la surface organoïde en calculant la surface organique totale, par puits ou champ, à chaque point temporel, et en normalisant les valeurs à la ligne de base. Pour mesurer le diamètre moyen de l’organoïde, déterminer le diamètre des organoïdes intacts individuels et calculer la valeur moyenne par puits.

Ensuite, déterminez le nombre d’organoïdes survivants en comptant les organoïdes intacts morphologiquement identifiables, tout en excluant tout débris ou fragment effondré. Effectuer un test de viabilité de luminescence tridimensionnel au point final du traitement si une évaluation supplémentaire de la viabilité en vrac est requise conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, tracez les courbes de croissance de la zone organoïde au fil du temps.

Comparez le diamètre moyen des organoïdes entre les groupes traités par véhicule et ceux traités par lenvatinib. Comparez également les décomptes d’organoïdes survivants entre les groupes de traitement. Veillez à utiliser des plannings d’imagerie, des critères d’inclusion et des paramètres d’analyse cohérents pour garantir la reproductibilité.

Sélectionner des puits organoïdes avec une morphologie 3D intacte, suffisamment de matière pour la capture d’une seule cellule et aucune contamination visible. Enregistrez des images en champ clair de chaque sélection bien avant la dissociation, en utilisant les mêmes réglages de microscope, la même grossissement et les critères de sélection du champ. Collecter les organoïdes à des points temporels correspondants entre les groupes témoins et traités, tout en maintenant la même densité de placage, le même schéma de traitement et les mêmes conditions de remplacement du milieu sur tous les échantillons.

Aspirez complètement le milieu de culture de chaque puits. Lavez chaque puits deux fois avec du PBS bien froid pour enlever le milieu résiduel et les débris. Ajoutez un millilitre de solution de récupération à cellules glacées dans chaque puits, puis faites couper sur la glace pendant 20 à 30 minutes.

Pipeter doucement toutes les cinq à sept minutes pendant l’incubation pour faciliter la dissolution de la matrice. Transférez le matériau dissous dans des tubes pré-refroidis à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre ou coupée pour minimiser les contraintes de cisaillement. On ne procède à la dissociation enzymatique qu’une fois que la matrice est en grande partie dissoute et qu’il reste un minimum de résidus visibles de gel.

Centrifugez la suspension organoïde récupérée à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille. Resuspendez le pellet dans un millilitre d’enzyme de dissociation cellulaire recombinante, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes.

Pipeter doucement huit à dix fois toutes les deux à trois minutes, en utilisant une pointe P1000 à large calibre, pour favoriser la dissociation. Arrêtez la digestion lorsque la plupart des fragments d’organoïdes se sont dispersés en cellules uniques, et que seuls de petits grappes résiduelles subsistent. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de PBS glacé contenant un sérum bovin fœtal à 2 % pour arrêter la digestion.

Ensuite, filtrez la suspension à travers une tamoire à cellules de 40 micromètres. Lavez une fois avec du PBS pour éliminer les enzymes résiduelles, les agrégats et les débris. Comptez les cellules en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.

Après avoir assuré la viabilité cellulaire de 85 % ou plus, ajustez la concentration finale de la cellule à 700 à 1 200 cellules par microlitre. Excluez les échantillons présentant des débris excessifs, des cellules mortes abondantes, de grands agrégats visibles ou une dissociation incomplète. Répétez la filtration avant le chargement si des granulats sont présents.

Le contrôle du procédé et les échantillons traités dans des conditions identiques, incluant l’enzyme de dissociation, le temps de digestion, la fréquence de pipettement, la méthode de filtration, la concentration cellulaire et la stratégie de chargement. Enfin, après l’amplification de la bibliothèque à une seule cellule, effectuez le séquençage à une seule cellule. Organoid a survécu et s’est étendu sous des conditions standard de culture tridimensionnelle du premier au sixième jour après la récupération.

Dès le premier jour, les organoïdes apparaissaient comme de petites structures compactes, tandis qu’au sixième jour, ils présentaient une taille accrue et une morphologie bien définie. Les organoïdes traités au lenvatinib étaient plus petits et présentaient une morphologie modifiée par rapport aux témoins traités par DMSO. L’analyse quantitative a montré une réduction du diamètre moyen des organoïdes, après traitement au lenvatinib, par rapport aux contrôles DMSO.

Ce protocole nous permet d’étudier les changements d’état cellulaire, de composition cellulaire et d’expression génique après traitement. Le plus grand défi est de préserver la viabilité des cellules, en maintenant un traitement simple cohérent dans tous les groupes. L’analyse en aval cellulaire peut être réalisée selon cette procédure, incluant le clustering, l’analyse des expériences sur les gènes différentiels, l’analyse d’enrichissement des voies et l’inférence de trésorerie.