Name: Visualisation et quantification de l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN dans des clusters d’ARN in vitro à l’aide de reporters d’ARN brocoli fendu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez une méthode de détection directe et quantitative de l'appariement intermoléculaire de bases d'ARN dans des clusters in vitro. Ce protocole utilise le système de rapporteur Broccoli fendu et la microscopie à fluorescence pour mesurer précisément les interactions ARN-ARN.

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	<li>Jain, A., Vale, R. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+phase+transitions+in+repeat+expansion+disorders.">RNA phase transitions in repeat expansion disorders.</a> Nature. 546, 243-247 (2017).</li><li>Langdon, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+structure+determines+specificity+of+a+polyQ-driven+phase+separation.">mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation.</a> Science. 360, 922-927 (2018).</li><li>Tauber, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+RNA+condensation+by+the+DEAD-box+protein+eIF4A.">Modulation of RNA condensation by the DEAD-box protein eIF4A.</a> Cell. 180, 411-426 (2020).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+intermolecular+base+pairing+in+Drosophila+germ+granules+by+mRNA+folding+and+its+implications+in+fly+development.">Controlling intermolecular base pairing in Drosophila germ granules by mRNA folding and its implications in fly development.</a> Nat Commun. 16, 8135 (2025).</li><li>Van Treeck, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+self-assembly+contributes+to+stress+granule+formation+and+defining+the+stress+granule+transcriptome.">RNA self-assembly contributes to stress granule formation and defining the stress granule transcriptome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115, 2734-2739 (2018).</li><li>Bose, M., Rankovic, B., Mahamid, J., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+architectural+role+of+specific+RNA&#8211;RNA+interactions+in+oskar+granules.">An architectural role of specific RNA&#8211;RNA interactions in oskar granules.</a> Nat Cell Biol. 26, 1934-1942 (2024).</li><li>Jambor, H., Brunel, C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+oskar+3&#8242;+UTRs+promotes+hitchhiking+for+RNA+localization+in+the+Drosophila+oocyte.">Dimerization of oskar 3&#8242; UTRs promotes hitchhiking for RNA localization in the Drosophila oocyte.</a> RNA. 17, 2049-2057 (2011).</li><li>Majumder, S., Coupe, S., Fakhri, N., Jain, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-encoded+intermolecular+base+pairing+modulates+fluidity+in+DNA+and+RNA+condensates.">Sequence-encoded intermolecular base pairing modulates fluidity in DNA and RNA condensates.</a> Nat Commun. 16, 4258 (2025).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensates+in+RNA+repeat+sequences+are+heterogeneously+organized+and+exhibit+reptation+dynamics.">Condensates in RNA repeat sequences are heterogeneously organized and exhibit reptation dynamics.</a> Nat Chem. 14, 775-785 (2022).</li><li>Poudyal, R. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequence+and+structure+control+assembly+and+function+of+RNA+condensates.">RNA sequence and structure control assembly and function of RNA condensates.</a> RNA. 27, 1589-1601 (2021).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2&#8242;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2&#8242;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nat Protoc. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo.">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nat Methods. 14, 75-82 (2017).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+simulations+for+RNA+folding+in+mixtures+of+monovalent+and+divalent+cations.">Theory and simulations for RNA folding in mixtures of monovalent and divalent cations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116, 21022-21030 (2019).</li><li>Maity, H., Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odd&#8211;even+disparity+in+the+population+of+slipped+hairpins+in+RNA+repeat+sequences+with+implications+for+phase+separation.">Odd&#8211;even disparity in the population of slipped hairpins in RNA repeat sequences with implications for phase separation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120, e2301409120 (2023).</li><li>Liao, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intermolecular+base+pairing+using+AMT+crosslinking+in+mammalian+cells+during+oxidative+stress.">Characterization of intermolecular base pairing using AMT crosslinking in mammalian cells during oxidative stress.</a> bioRxiv. , (2025).</li><li>Kirsch, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+the+detection+of+mRNA&#8211;sRNA+interactions+using+AMT-crosslinking+in+vitro.">A streamlined protocol for the detection of mRNA&#8211;sRNA interactions using AMT-crosslinking in vitro.</a> Biotechniques. 67, 178-183 (2019).</li><li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+eukaryotic+RNA+interactomes+reveals+principles+of+higher-order+organization+and+regulation.">In vivo mapping of eukaryotic RNA interactomes reveals principles of higher-order organization and regulation.</a> Mol Cell. 62, 603-617 (2016).</li><li>Alam, K. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+split+aptamer+for+visualizing+RNA&#8211;RNA+assembly+in+vivo.">A fluorescent split aptamer for visualizing RNA&#8211;RNA assembly in vivo.</a> ACS Synth Biol. 6, 1710-1721 (2017).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+transcription+of+nucleic+acids+with+efficient+T7+promoters.">Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters.</a> Commun Biol. 3, 439 (2020).</li><li>Imburgio, D., Rong, M., Ma, K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+promoter+recognition+and+start+site+selection+by+T7+RNA+polymerase+using+a+comprehensive+collection+of+promoter+variants.">Studies of promoter recognition and start site selection by T7 RNA polymerase using a comprehensive collection of promoter variants.</a> Biochemistry. 39, 10419-10430 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Shanaa, O. A., Rumyantsev, A., Sambuk, E., Padkina, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+production+of+RNA+aptamers+and+nanoparticles:+problems+and+prospects.">In vivo production of RNA aptamers and nanoparticles: problems and prospects.</a> Molecules. 26, (2021).</li><li>Rangan, P., DeGennaro, M., Jaime-Bustamante, K., Coux, R. X., Martinho, R. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+control+of+germ-plasm+RNAs.">Temporal and spatial control of germ-plasm RNAs.</a> Curr Biol. 19, 72-77 (2009).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+self-assembly+of+germ+granule+mRNAs+into+homotypic+clusters.">Sequence-independent self-assembly of germ granule mRNAs into homotypic clusters.</a> Mol Cell. 78, 941-950 (2020).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViennaRNA+package+2.0.">ViennaRNA package 2.0.</a> Algorithms Mol Biol. 6, 26 (2011).</li><li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 136, 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+Spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of Spinach.</a> J Am Chem Soc. 136, 1198-1201 (2014).</li><li>Guet, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Spinach-tagged+RNA+and+gene+localization+to+image+gene+expression+in+live+yeast.">Combining Spinach-tagged RNA and gene localization to image gene expression in live yeast.</a> Nat Commun. 6, 8882 (2015).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E2756-E2765 (2015).</li><li>Zinskie, J. A., Roig, M., Janetopoulos, C., Myers, K. A., Bruist, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+small+nucleolar+RNA+tagged+with+the+broccoli+aptamer+in+yeast.">Live-cell imaging of small nucleolar RNA tagged with the broccoli aptamer in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 18, (2018).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>MgCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028</td><td>Utilisé pour la préparation de 10 et plus : Tampon de repliement de l’ARN.</td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>AM9640G</td><td>Utilisé pour la préparation de 10 et plus : Tampon de repliement de l’ARN.</td></tr><tr><td>50 % PEG 8000</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td>Composant du kit de ligase ARN T4 ; utilisé comme réactif de regroupement moléculaire pour induire le regroupement de l’ARN. & nbsp ;</td></tr><tr><td>Éthanol absolu, 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>T038181000CS</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon de lavage ARN.</td></tr><tr><td>Phénol acide :chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>AM9722</td><td>Utilisé pour la purification de l’ARN.</td></tr><tr><td>Aminoallyl-UTP-Cy5</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-821-CY5</td><td>Utilisé pour le marquage de l’ARN lors de la transcription in vitro.</td></tr><tr><td>Verre de couverture à chambre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409PK</td><td>Chambre d’imagerie pour les réactions de regroupement ARN.</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>C298-500</td><td>Utilisé pour la purification de l’ARN.</td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Lucerne</td><td>410</td><td>Utilisé comme fluorophore pour la détection de l’aptamère d’ARN brocoli.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>D12345</td><td>Anhydre ; qualité en biologie moléculaire ; utilisé pour la préparation au DFHBI-1T. & nbsp ;</td></tr><tr><td>ADN propre & Kit de concentration</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td>Utilisé pour le nettoyage des produits ADN avant la transcription de T7.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel d’ADN</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td>Utilisé pour l’extraction par gel.</td></tr><tr><td>Bain sec</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td>Utilisé pour chauffer des échantillons d’ARN dans des tubes de microcentrifuge.</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>NIH (Instituts nationaux de la santé)</td><td>N/A</td><td>logiciels d’analyse d’images open source ; utilisé pour la quantification de l’intensité de fluorescence et l’analyse du ROI.</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse sur gel &nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B2-BP</td><td>Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.</td></tr><tr><td>Colorant de charge en gel, violet (6 fois)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>Utilisé comme colorant de charge pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.</td></tr><tr><td>Microscope à illumination instantanée structurée</td><td>VisiTech international</td><td>VT-iSIM</td><td>Un microscope confocal capable d’imager la fluorescence GFP et Cy5.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>327272500</td><td>Utilisé pour la purification de l’ARN.</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>AM1334</td><td>Utilisé pour la transcription in vitro de la T7. Le kit comprend des solutions nucléotidiques (ATP, CTP, GTP, UTP) et de la DNase.</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-284</td><td>Tube de 1,5 mL ; utilisé pour stocker des modèles d’ADN pour la transcription in vitro, les produits d’ARN, ainsi que les aliquotes de spermine et de DFHBI-1T. & nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Z763845</td><td>Utilisé pour des centrifugations brèves.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td>Spectrophotomètre de microvolume pour mesurer la concentration et la qualité de l’ADN et de l’ARN.</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase &nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>AM9937</td><td>Utilisé pour la resuspension de granulés d’ARN, la préparation de lavages d’ARN et de tampons de repliage, ainsi que la dilution de spermine et DFHBI-1T.</td></tr><tr><td>Calculateur de masse molaire en ligne</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)</td><td>N/A</td><td>Outil en ligne utilisé pour calculer la masse d’ARN à partir de la quantité molaire (par exemple, pmol).</td></tr><tr><td>Tubes PCR en polypropylène</td><td>Corning</td><td>3745</td><td>200 & mu ; Les tubes L PCR utilisés pour la PCR, la transcription in vitro et les réactions de regroupement de l’ARN</td></tr><tr><td>Alimentation de base PowerPac</td><td>Bio-rad</td><td>1645050</td><td>Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.</td></tr><tr><td>Cycleur thermique PCR Proflex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-840-73</td><td>Utilisé pour la PCR, la transcription in vitro et le chauffage d’échantillons d’ARN dans des tubes PCR.</td></tr><tr><td>Q5 Haute fidélité 2 fois ; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Utilisé comme 2 fois ; Mix master haute fidélité.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée &nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Utilisé pour la purification et la pelletation d’ARN. & nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de décontamination RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>AM9782</td><td>Utilisé pour nettoyer les établis de laboratoire et les surfaces afin de minimiser la contamination par RNase.</td></tr><tr><td>Spermine & nbsp ; Tétrahydrochlorure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141-1G</td><td>Utilisé pour induire le regroupement d’ARN.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon Tris (pH 7,0).</td></tr><tr><td>Agarose ultrapure</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>16500500</td><td>Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.</td></tr></tbody></table>

visualisation et quantification de l’appariement intermoléculaire de bases d’arn dans des clusters d’arn in vitro à l’aide de reporters d’arn brocoli fendu

Visualization and Quantification of Intermolecular RNA Base Pairing in in vitro RNA Clusters Using Split Broccoli RNA Reporters

Visualisation et quantification de l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN dans des clusters d’ARN in vitro à l’aide de reporters d’ARN brocoli fendu

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Le protocole présente deux méthodes pour déterminer la cinétique des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 et Brocoli. La première méthode décrit comment mesurer la cinétique des aptamères fluorogéniques in vitro avec un lecteur de plaques, tandis que la deuxième méthode détaille la mesure de la cinétique des aptamères fluorogéniques dans les cellules par cytométrie en flux.

Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques

Le protocole fournit des instructions pour modifier l’ARN avec du sulfate de diméthyle pour les expériences de profilage mutationnel. Il comprend le sondage in vitro et in vivo avec deux méthodes alternatives de préparation de bibliothèque.

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