Visualisation et quantification de l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN dans des clusters d’ARN in vitro à l’aide de reporters d’ARN brocoli fendu

Nous appliquons le test de reporter d’ARN brocoli fractionné pour détecter et quantifier l’appariement intermoléculaire de bases dans les amas d’ARN in vitro. Les sondes chimiques et les simulations suggèrent des interactions ARN mais ne peuvent pas les mesurer directement. Ce protocole permet une évaluation directe et précise au sein des clusters d’ARN.

Après avoir préparé les modèles d’ADN pour la transcription in vitro de l’ARN, essuyez la surface de travail, les supports à tubes et les pipettes avec une solution de décontamination de ribonucléase. Utilisez des pointes filtrées sans ribonucléase pour toutes les étapes de pipetage. Dégelez les solutions tampon de réaction et nucléotidiques fournies avec le kit de transcription ainsi que l’uridine triphosphate Cyanine 5, ou UTP-Cy5, sur glace.

Centrifugez tous les tubes à 2 000g pendant deux secondes avant utilisation. Ensuite, calculez le nombre de bases de thymine dans l’ADN. Déterminer les volumes requis d’UTP et UTP-Cy5 pour une réaction de transcription de 20 microlitres tout en maintenant une densité de marquage constante entre les espèces d’ARN.

Ensuite, préparez une réaction de transcription de 20 microlitres en combinant les réactifs présentés. Mélangez soigneusement en pipotetant de haut en bas et centrifugez à 2 000g pendant deux secondes. Après avoir incubé la réaction à 37 degrés Celsius pendant six heures, ajouter un microlitre de désoxyribonucléase fournie avec le kit, mélanger soigneusement par pipette, puis centrifuger à nouveau.

Puis écouver à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes supplémentaires. Transférez la réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 115 microlitres d’eau sans nucléase et 15 microlitres de solution d’arrêt d’acétate d’ammonium fournie avec le kit.

Après le mélange, centrifugez la solution à 2 000g pendant deux secondes. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de chloroforme de phénol dans le tube et mélangez doucement pour combiner les phases. Centrifugez à 16 000g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajoutez un volume égal de chloroforme à la solution transférée et mélangez soigneusement pour assurer une interaction de phase adéquate. Centrifugez maintenant à 16 000g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et répétez le processus de séparation de phase une fois de plus.

Ensuite, transférez la couche aqueuse d’environ 100 à 150 microlitres dans un nouveau tube. Ajoutez 900 microlitres d’isopropanol et mélangez soigneusement. Après avoir aliquoté la solution dans des tubes séparés, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit ou jusqu’à un mois.

Centrifugez l’échantillon d’ARN dans de l’isopropanol à 16 000g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement l’isopropanol sans déranger la pelote d’ARN. Ajoutez ensuite un millilitre d’éthanol à 70 % préparé dans de l’eau sans nucléase au pellet.

Centrifugez à 16 000g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré l’éthanol, ajoutez un millilitre d’éthanol à 70 % préparé dans de l’eau sans nucléase dans le tube et répétez la centrifugation. Lors du lavage final à l’éthanol, retirez la majeure partie de l’éthanol à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres.

Centrifugez brièvement à 2 000g pendant deux secondes dans une mini-centrifugeuse de paillas, puis retirez tout éthanol restant à l’aide d’une pipette de 20 microlitres. Une fois la pelote d’ARN sèche, resuspendez-la dans 20 microlitres d’eau sans nucléase. Gardez l’échantillon sur la glace et protégez-le de la lumière.

À l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume, mesurez la concentration et la pureté de l’ARN. Assurez-vous que le rapport d’absorption à 260 sur 280 nanomètres est d’environ 2,0 et que le rapport à 260 sur 230 nanomètres est supérieur à 2,0. Décongelez un tube de 100 millimolaires de spermine et 50 % de polyéthylène glycol 8 000 sur glace.

Préparez fraîchement un tampon de repliement d’ARN 10X en combinant les composants montrés. Après avoir bien mélangé les composants par pipette, centrifugez à 2 000g pendant deux secondes dans une mini-centrifugeuse de paillas. Pour la condition de co-repliage, dans un tube PCR de 200 microlitres, combinez de l’ARN transcrit in vitro transportant soit la séquence supérieure, soit la séquence inférieure, un tampon de repliement d’ARN et de l’eau sans nucléase.

Mélangez soigneusement en pipettant vers le haut et vers le bas et centrifugez comme démontré précédemment. Chauffez l’échantillon à 90 degrés Celsius pendant deux minutes. Transférez immédiatement l’échantillon à température ambiante.

Protégez de la lumière et incubez pendant une heure. Pour la condition de repliement séparé, chauffez l’échantillon d’ARN dans un tube PCR de 200 microlitres, puis placez-le immédiatement sur de la glace pendant au moins 15 minutes. Dans un tube PCR de 200 microlitres, combinez de l’ARN transcrit in vitro transportant soit la séquence supérieure, soit la séquence inférieure, un tampon de repliement d’ARN 10 fois, et de l’eau sans nucléase.

Incubez la réaction à température ambiante pendant 30 minutes, protégée de la lumière. Maintenant, combinez les échantillons d’ARN contenant les séquences supérieures et inférieures dans un seul tube PCR et mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugez à 2 000g pendant deux secondes dans une mini-centrifugeuse de paillas.

Incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Pour les deux affections, ajoutez six microlitres d’un prémélange à deux de spermine millimolaire et de polyéthylène glycol à 50 % 8 000. Après avoir mélangé le contenu, centrifugez à 2 000g pendant deux secondes dans une mini-centrifugeuse de paillard.

Mélangez maintenant deux microlitres d’un millimolaire DFHBI-1T à la réaction et centrifugez à nouveau. Chargez la réaction dans un verre de couvercle à chambre. Incubez la chambre à température ambiante pendant quatre heures dans le noir, le couvercle posé pour minimiser l’évaporation.

Chargez le verre de couverture à chambre sur l’étage du microscope. Allumez le laser, puis utilisez les oculaires pour localiser et focaliser l’échantillon. Configurez le microscope pour imager chaque région d’intérêt avec le canal cyanine 5 en premier à chaque plan Z.

Puis imagez la même région d’intérêt en utilisant le canal protéique fluorescent vert. Réglez le temps d’exposition à 500 millisecondes pour tous les canaux. Ensuite, réglez la puissance du laser à 80 % pour le canal protéique fluorescent vert et à 40 % pour le canal cyanine 5.

En utilisant une taille de pas Z de 150 nanomètres, imagez une région de glissement de couverture à l’extérieur de la gouttelette de réaction à température ambiante. Ensuite, quantifiez l’appariement intermoléculaire des bases à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Lors de l’induction du regroupement d’ARN, les deux ARN formaient des grappes individuellement ou ensemble.

La fluorescence de DFHBI-1T au sein des amas d’ARN était nettement plus faible pour les ARN supérieurs ou inférieurs seuls que pour la condition de co-repliage. Dans la condition de pliage séparé, le signal normalisé DFHBI-1T était de 0,031, comparable aux niveaux de référence observés uniquement en haut ou en bas. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top et shu-anti-bottom ont individuellement montré une fluorescence minimale de DFHBI-1T.

Le co-repliage du shu-top avec le shu-bottom ou du shu-anti-top avec le shu-anti-bottom produisait un signal DFHBI-1T plus élevé que le pliage séparé. Le co-repliement de shu-top et shu-bottom a entraîné une augmentation de 5,63 fois de la fluorescence normalisée de DFHBI-1T. Le plissement séparé du shu-haut et du shu-bottom n’a montré qu’une augmentation de 1,04 fois comparable aux niveaux de base.

Shu-top mélangé à shu-anti-bottom et shu-anti-top mélangé à shu-bottom présentait une fluorescence DFHBI-1T plus élevée que les paires de même orientation dans les deux conditions de pliage. Le co-repliage de shu-top avec shu-anti-bottom et shu-anti-top avec shu-bottom a entraîné respectivement des augmentations de fluorescence DFHBI-1T de 61,86 et 82,60 fois. Le repliement séparé de ces paires mixtes a donné des augmentations plus faibles, de 2,69 et 4,94 fois respectivement.

La considération la plus importante est qu’une génération robuste de signaux peut nécessiter des réactifs de compression tandis que la sensibilité dépend d’une dimérisation et d’un repliement efficaces des ARN de brocoli scindés. Ce test complète les approches de tirage d’ARN vers le bas et d’électrophorèse sur gel pour étudier l’appariement intermoléculaire de bases dans les amas d’ARN. Cet essai peut examiner les effets des séquences d’ARN, des hélicases et des ions sur l’appariement intermoléculaire de bases au sein des amas d’ARN.