Isolement des neutrophiles Protocole

Protocole d’isolement des neutrophiles. Cette procédure permettra d’extraire les globules blancs d’un équipement d’échantillonnage de sang total, d’une centrifugeuse et de flacons. Vortex sir aiguille et seringue filtre seringue.

Milli pour marque MX gv 0.22 Micromètre matériaux. La séparation des neutrophiles entre le sort Hank et la solution saline nécessite deux types de solutions HBSS. HBSS avec du chlorure de calcium sera utilisé pour faire une solution avec de l’albumine sérique humaine.

L’HBSS sans chlorure de calcium sera utilisé pour suspendre et laver les neutrophiles. Veuillez prendre soin d’utiliser la solution HBSS appropriée dans cette procédure. L’albumine sérique humaine ou HSA est une protéine du plasma sanguin qui maintient le pH et la pression SMO.

N’utilisez pas de tampon de lyse des globules rouges amalgamé de sérum bovin. Ceci est fabriqué par Roche Diagnostics, média d’isolement des neutrophiles NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly milieu de séparation protégé de la lumière et conservé au réfrigérateur pour de meilleurs résultats. Tous les réactifs doivent être à température ambiante au moment de l’utilisation.

Sortez les réactifs du réfrigérateur une heure avant l’expérience. Préparer la solution H-B-S-S-H-S-A pour la séparation des neutrophiles. Pipette HBSS avec du chlorure de calcium dans le flacon.

Aspirez HSA dans la seringue. Évitez de piéger les bulles d’air. Retirez l’aiguille de la seringue et remplacez-la par le filtre.

Injectez du HSA à travers le filtre dans le vortex de flacon HBSS lorsque vous avez vos autres matériaux prêts et à température ambiante, acquérez environ 15 millilitres de sang total. Cela donnera 10 à 15 millilitres de 10 à la huitième neutrophiles. Le donneur ne doit pas avoir consommé d’alcool ou de médicaments en vente libre pendant les 24 heures précédant le don de l’échantillon de sang.

Ceux-ci peuvent perturber le processus de séparation. Le sang total peut être anticoagulé avec du citrate d’EDTA ou de l’héparine en ajoutant neuf parties de sang à une partie de K, trois parties d’EDTA, de citrate de sodium ou d’héparine selon les instructions du fabricant. Les étapes suivantes seront décrites dans cette procédure.

Séparez et retirez le plasma et les monocytes. Séparez et acquérez une couche de neutrophiles lyse lyse les globules rouges libres en suspension des neutrophiles première séparation. Acquisition des neutrophiles dans la couche NIM.

Prélever cinq millilitres de milieu d’isolement dans le tube de centrifugation. Placer le média d’isolement plus bas dans le tube lui permet d’agir comme un filtre, car la centrifugeuse forcera le sang à le traverser avec soin. Appliquez cinq millilitres de sang sur le NIM pour une séparation propre.

Faites très attention à ne pas mélanger les solutions. Effectuez cette étape lentement et soigneusement et avec la pointe de votre pipette près de la surface du fluide de résolution pour éviter le mélange centrifuge. La solution à 500 RCF pendant 35 minutes.

À 20 à 25 degrés Celsius, le sang doit se séparer en six bandes distinctes. Les six bandes sont les monocytes plasmatiques, les milieux d’isolement, les neutrophiles, d’autres milieux d’isolement et la pastille de globule rouge au bas. Si ces six bandes ne sont pas claires et distinctes, le processus de séparation n’était pas propre et devrait être répété.

Les causes courantes de mauvaise séparation comprennent un ancien milieu d’isolement, un donneur ayant consommé de l’alcool au cours des 72 dernières heures ou un donneur ayant consommé d’autres médicaments tels que le Tylenol ou l’aspirine. Retirez et jetez soigneusement les monocytes plasmatiques et le milieu d’isolement. Placez ces couches dans un tube refermable et jetez-les avec précaution, pipetez la couche de neutrophiles et tous les milieux d’isolement sous les neutrophiles dans une lime centrifuge propre pour récupérer autant de neutrophiles que possible.

Il est souvent plus facile d’inclure également une partie du support d’isolation de la couche inférieure. Ne dérangez pas la palette par le bas. Deuxième déclaration, affiner la couche de neutrophiles.

Diluer la solution de neutrophiles à 10 millilitres avec HBSS sans calcium. Retournez le tube plusieurs fois pour suspendre la centrifugeuse des cellules. La solution des neutrophiles.

350 RCF pendant 10 minutes. À 20 à 25 degrés Celsius, une pastille rouge doit être présente au fond du tube contenant des neutrophiles et des globules rouges résiduels. Retirez le supra natin à l’aide de la pipette.

Attention. à déranger le granulé au fond. Lyse des globules rouges.

Les globules rouges de l’échantillon doivent maintenant être détruits par lyse. Pour lys les globules rouges résiduels, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges dans le tube à résuser. Suspendez le vortex de pastille dans le flacon à une position de trois à quatre.

Évitez d’augmenter le réglage du vortex au-dessus de quatre, car cela pourrait provoquer l’activation des neutrophiles. Il peut être nécessaire de faire un tourbillon pendant plusieurs secondes ou d’pulser le vortex pour dissoudre le palais. Centrifugez la solution de lyse à 250 RCF pendant cinq minutes.

Utilisez l’option de démarrage progressif pour minimiser les dommages à l’échantillon. Retirez le supra natin à l’aide d’une pipette. Répétez le processus de lyse.

Si nécessaire, libérez la suspension de neutrophiles, ajoutez 500 microlitres de HBSS sans calcium dans chaque tube. Vortex la pastille à un réglage de trois à quatre, diluer à 10 millilitres avec HPSS sans centrifugeuse à calcium. Les neutrophiles à 250 RCF pendant cinq minutes aspirent le piège et le jettent.

Remettre le granulé en suspension dans 250 microlitres de HBSS avec solution HSA, deux fois 10 à six. Les neutrophiles par millilitre sont généralement collectés.