Name: Isolement des neutrophiles Protocole (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez l'isolation des neutrophiles humains à partir de sang total par gradient de densité. Cette méthode standardisée permet d'étudier les réponses inflammatoires et les fonctions immunitaires in vitro.

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Le financement du NIH R01 HL56621.

Isolement des neutrophiles Protocole <ol><li> Amener tous les réactifs à température ambiante. </li><li> Collecter 5,0 ml de milieux d&#39;isolement des neutrophiles dans le tube de la centrifugeuse. Soigneusement couche de 5,0 ml de sang sur les médias de séparation. Effectuez cette étape lentement et soigneusement, et avec la pointe de la pipette à proximité de la surface du média pour éviter de mélanger le sang et les médias. </li><li> Centrifuger à 500 RCF pendant 35 min à 20-25 ° C. Le sang doit se séparer en 6 bandes distinctes: le plasma, les monocytes, les milieux d&#39;isolement, les neutrophiles, des milieux d&#39;isolement de plus, et les globules rouges culot (figure 1). Si ces bandes ne sont pas claires, le processus de séparation n&#39;était pas propre et aura besoin d&#39;être répété. </li><li> Retirer délicatement les trois couches supérieures (plasma, des monocytes et des milieux d&#39;isolement) en utilisant une pipette. Eliminer ces couches. </li><li> Soigneusement pipette la couche de neutrophiles et de l&#39;ensemble des milieux d&#39;isolement sous les neutrophiles. Placer la solution dans un tube à centrifuger propre. </li><li> Diluer la solution des neutrophiles à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +. Inverser le tube à quelques reprises de suspendre les cellules. </li><li> Centrifuger la solution des neutrophiles à 350 RCF pendant 10 minutes. Une pastille rouge doit être présent au fond du tube, contenant des neutrophiles et des résidus de globules rouges (hématies). Enlever le surnageant avec une pipette avec soin afin que le culot n&#39;est pas perturbé. </li><li> Pour lyser les globules rouges résiduels, ajouter 2 ml de tampon de lyse des érythrocytes au tube. Pour resuspendre le culot, vortex le flacon à un réglage de 3-4. Évitez d&#39;augmenter le réglage de vortex au-dessus de 4, car cela pourrait provoquer des neutrophiles pour l&#39;activer. Il peut être nécessaire de vortex pendant quelques secondes, ou de «pouls» du vortex pour dissoudre le culot. </li><li> Centrifuger le tube à 250 RCF pendant 5 min. Enlever le surnageant avec une pipette. Répétez le processus de lyse, si nécessaire. </li><li> Ajouter 500 ul de HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 + dans chaque tube. Encore une fois, vortex pour remettre le culot à un réglage de 3-4. Diluer à 10 ml avec HBSS sans Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li> Centrifuger les tubes à 250 RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et le jeter. </li><li> Reprendre le culot dans 250 ul de HBSS / Solution HSA (2% HSA). Les cellules peuvent ensuite être comptés et ajusté à la concentration voulue. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

La méthode de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. Cette méthode est basée sur la méthode de séparation des leucocytes mononucléaires par Boyum (1968) qui a été modifiée pour la séparation des neutrophiles par Ferrante et Thong (1980). Après la collecte d&#39;un donneur, du sang entier anticoagulé peut être avec de l&#39;EDTA, du citrate ou héparine. Comme ils sont de courte durée, les neutrophiles doit être u...

<table><tbody><tr><td>Poly(R) des lymphocytes</td><td>Réactif</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM peut être utilisé comme alternative</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Solution saline équilibrée sans chlorure de calcium</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine</td><td>Réactif</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des érythrocytes</td><td>Réactif</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuger</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexeur</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur et poire</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Réactif</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Réactif alternatif au Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Autre</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, stérilisable par rayonnement gamma</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Solution saline équilibrée avec chlorure de calcium</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des neutrophiles protocole

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophiles polynucléaires neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants chez les humains et chez les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire. En raison de leur rôle clé dans l&#39;inflammation, les fonctions des neutrophiles tels que la locomotion, la production de cytokines, la phagocytose, et lutter contre des cellules tumorales sont largement étudiés. Afin de caractériser les fonctions spécifiques des neutrophiles, une méthode propre, rapide, fiable et de les séparer des autres cellules sanguines est souhaitable pour des études in vitro, en particulier depuis les neutrophiles sont de courte durée et doit être utilisé dans 2-4 heures de la collecte. Ici, nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total à l&#39;aide des médias disponibles dans le commerce de séparation qui est un mélange de sodium et de métrizoate Dextran 500. La procédure se compose de couches de sang entier sur le moyen gradient de densité, la centrifugation, la séparation de la couche de neutrophiles, et la lyse des hématies résiduelles. Les cellules sont ensuite lavées, comptées et resuspendues dans un tampon à la concentration voulue. Quand elle est réalisée correctement, cette méthode a été démontré que le rendement des échantillons de&gt; 95% des neutrophiles avec la viabilité&gt; 95%.

Les neutrophiles sont parmi les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire, et de leurs fonctions et mécanismes ont été largement étudiés in vitro. Nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant des milieux de séparation disponibles commercialement.

Isolement des neutrophiles Protocole

Les granulocytes polymorphonucléaires neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants chez l'être humain et font partie des premières cellules à arriver sur le site d'une inflammation...

Protocole d'isolement des neutrophiles. Cette procédure permettra d'extraire les globules blancs à partir d'un échantillon de sang total à l'aide d'un équipement comprenant une centrifugeuse et des flacons. Agiter vigoureusement, seringue et aiguille, filtre stérile pour seringue.Matériaux Milli pour marque MX gv 0,22 micromètre. La séparation des neutrophiles par le procédé de Hank nécessite deux types de solutions HBSS. La HBSS contenant du chlorure de calcium sera utilisée pour préparer une solution avec de l'albumine sérique humaine.Le HBSS sans chlorure de calcium sera utilisé pour suspendre et laver les neutrophiles. Veuillez prendre soin d'utiliser la solution de HBSS appropriée dans cette procédure. L'albumine sérique humaine ou HSA est une protéine du plasma sanguin qui maintient le pH et la pression onmotique.Ne pas utiliser le tampon d'hémolyse à base d'amalgame de sérum bovin. Ce produit est fabriqué par Roche Diagnostics, le milieu d'isolement des polynucléaires NIM de Cedar Line Labs, le milieu de séparation Lymph light Poly, à protéger de la lumière et à conserver au réfrigérateur pour de meilleurs résultats. Tous les réactifs doivent être à température ambiante au m

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Biology

Biologie

Cette vidéo présente un test in vitro pour étudier l’interaction neutrophile-biofilm. Les bactéries pathogènes intégrées dans le biofilm et les neutrophiles isolés ont été marqués à l’aide de marqueurs fluorescents, et la réponse immunitaire des neutrophiles et l’évasion de la réponse immunitaire par les bactéries ont été évaluées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Un essai in vitro pour étudier l’interaction entre les neutrophiles et le biofilm

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d'isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l'adhésion avec les cellules cancéreuses.

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant. L’isolement des neutrophiles du sang humain par la méthode de séparation par gradient de densité et la différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) le long de la voie granulocytaire sont décrits ici ; Tester leur rôle sur la sensibilité des cellules du lymphome aux agents anti-lymphomes.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Nous décrivons ici un procédé permettant l'obtention et l'identification d'une sous-population nouvellement caractérisé par des phagocytes géantes neutrophile dérivé. Ces cellules se développent dans la culture à partir de neutrophiles frais du sang humain, et sont caractérisées par la phagocytose, l'autophagie, immensément grande taille, et la durée de vie prolongée. Cette méthode est indispensable d'étudier plus avant cette sous-population de neutrophiles dérivé unique.

Développement et identification d'une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant In vitro

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Ici, nous proposons une approche fiable pour isoler les neutrophiles de densité faible et normale du sang total en utilisant l’isolement magnétique (sélection négative) et le milieu à gradient de densité discontinu. Il garantit l’isolement intact des cellules de haute pureté (≥93 %), facilitant ainsi l’analyse précise en aval des sous-populations de neutrophiles, ce qui est crucial pour comprendre leurs rôles dans la santé et la maladie.

L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

Découvrez l'isolation des neutrophiles humains à partir de sang total par gradient de densité. Cette méthode standardisée permet d'étudier les réponses inflammatoires et les fonctions immunitaires in vitro.

Isolement des neutrophiles Protocole

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