1. הכנה לעבודה אספטית
- השגו והחלו את פריטי ה- PPE הבאים: חלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל (ללא דמעות או חורים) ומשקפי בטיחות(איור 1). לבטיחות במקרה של שימוש בלהבה פתוחה, לקשור את השיער הארוך.
איור 1: PPE: חלוק מעבדה, כפפות לטקס ומשקפי בטיחות. - היבט חשוב שני של טכניקה אספטית הוא עיקור ואחסון נאותים של מדיה / ריאגנטים לשימוש במעבדה. הכן מדיום מרק נוזלי(למשל,ציר סויה טריפטי) ומדיה מבוססת אגר(למשל,R2A) על ידי שקילה של הכמות הנכונה של אבקת בסיס מיובש, אשר מתווסף לכמות המתאימה של מים דה מיוננים.
- עבור מדיום המרק, להמיס את האבקה על צלחת חמה עם חום נמוך מוחל, ולחלק את הנוזל או בנפחים 100 מ"ל לתוך צלוחיות בורג זכוכית העליון, או בנפחים 10 מ"ל לתוך מבחנות בורג זכוכית העליון. בעזרת מוט ערבוב מגנטי, מערבבים את מדיום האגורוז על מערבל הצלחת החמה עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין.
- החלת סרט אוטומטי על הגורמים המכילים, ובודד את המדיה באופן אוטומטי בהתאם להוראות היצרן (למשל,20 דקות ב- 121 °C(איורים 2 ו - 3). שים לב שצבע הפסים בקלטת ההקלבה האוטומטית צריך להשתנות מלבן (טרום-autoclave) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית). למרות שינוי הצבע בדרך כלל מציין כי עיקור היה מוצלח, בדיקות עיקור באמצעות ערכות רצועת נבג ניתן לבצע כדי לאמת את תהליך autoclaving.
איור 2: הקלטת המוחלת אוטומטית על חומר.
איור 3: שים לב לשינוי הצבע של פסים בקלטת אוטומטית מלבן (טרום-אוטוקלבה) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית). - מצננים את המרק הנוזלי לטמפרטורת החדר, ואז מאחסנים בטמפרטורת החדר או בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- מצננים את מדיום האגורוז על ידי הנחת המיכל באמבט מים מוגדר ~ 50 מעלות צלזיוס. לאחר התקררות, ניתן לשפוך את המדיה למנות פטרי סטריליות. אפשר למדיום להתקרר ולחזק, ולאחר מכן להתאחד לאחסון בטמפרטורות שצוינו על-ידי היצרן.
- ישנם מספר סוגים של מדיה תרבותית כי לא ניתן autoclaved כמו הטמפרטורות הגבוהות להשפיל מרכיבים קריטיים. חיטוי אלה דורשים עיקור מסנן באמצעות מערכת סינון ואקום המשתמשת מסנן 0.22-μm, ואחריו אחסון בטמפרטורה המתאימה.
- לפני ביצוע העבודה על הספסל, לחטא את פני השטח באמצעות פתרון מתאים (למשל,אקונומיקה 500-ppm). זה מוריד את הסיכון להעברת מזהמים משטח העבודה לתרבויות ומדיה סטרילית.
- כדי להקים שדה סטרילי, הפעל מבער בונזן. סוג הלהבה המתאים ביותר לחיטוי לולאות חיטוי מתכת הוא להבה כחולה עזה, עם קונוס כחול מוחלט שנצפו באמצע(איור 4).
איור 4: העברת חיידקים מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית ללוח פטרי לא מחוסן אחר המכיל מדיום גדילה מבוסס אגר. - לאט לאט להעביר את הלולאה המחסנת דרך החלק החם ביותר של הלהבה (קצה החרוט הכחול). הלולאה צריכה להפוך אדומה חמה לצורך עיקור.
2. העברות חיידקים: מצלחת פטרי לצלחת פטרי
- תרחיש אחד של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה מבוסס אגר.
- ראשית, פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורה, והקשו בעדינות על לולאת החקוס החמה והמיערת על פני השטח של אגר.
- יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
- בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
- עבור כל חלק של פס הבידוד (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש או לבוא במגע עם לולאות הפיקוח.
- מניחים את הצלחות המפוספסות באינקובטור לצמיחה בן לילה.
3. העברות חיידקים: מתרבות מרק לצלחת פטרי
- תרחיש שני של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה, כפי שנצפו בדרך כלל על ידי עכוז, לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל 2-3x דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- מנמיכים בזהירות את לולאת החנק המעוקרת לתוך הצינור/הבקבוקון, ולחצו בעדינות על צד המיכל כדי להתקרר רגע לפני הכניסה לתרבות המרק.
- הסירו לולאה אחת של תרבות המרק(איור 5)והחליפו מיד את המכסה.
איור 5: לולאה אחת של תרבות מרק. - בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
- עבור כל חלק של הרצף (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש לולאות חיטוי.
- מניחים את הצלחות המפוספסות לבידוד באינקובטור לצמיחה בן לילה.
4. העברות חיידקים: מצלחת פטרי עם צמיחה לבינוני נוזלי סטרילי
- תרחיש שלישי של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי המכילה פס תרבות מבודד לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
- פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורים, וקררו את לולאת החנק החמה על ידי הקשה עליה בעדינות על משטח אגר.
- יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל 2 עד 3 פעמים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, אל תניח את המכסה על הספסל.
- בזהירות להוריד את המושבה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי, בעדינות להסעיר את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
- עקר להבה את לולאת החנק על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר מאוחר יותר עשויים להשתמש לולאות חיטוי.
- מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
- הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
- צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
- הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.
5. העברות חיידקים: מתרבות מרק למדיום צמיחה נוזלי סטרילי
- תרחיש רביעי של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- בזהירות להוריד את לולאת החנק לתוך הצינור / בקבוקון, ולחץ בעדינות על הצד של המיכל להתקרר רק לפני הכניסה לתרבות המרק.
- הסר לולאה אחת של תרבות מרק, ומיד להחליף את הכובע.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- בזהירות להוריד את הלולאה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי סטרילי, בעדינות להתסיס את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
- עקר את לולאת ההשמדה (איור 6) כדי למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה שעשויים מאוחר יותר להשתמש בלולאות המחסנות.
איור 6: לולאה מחסן שהופכת ללחמה אדומה בזמן שהיא מעוקרת עם מבער בונזן. - מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
- הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
- צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
- הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר
טכניקה אספטית היא מיומנות בסיסית הנהוגה בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית הדורשת איזון של תשומת לב ותרגול במעבדה. שימוש נכון בטכניקה זו מפחית את הסבירות לזיהום חיידקי או פטרייתי של ריאגנטים, מדיה תרבותית ודגימות סביבתיות. טכניקה אספטית חיונית גם כדי להבטיח שלמות נתונים ולשמור על טוהר ספריות התרבות שעשויות להיות מורכבות מטילוקים נדירים וקשים מאוד לתרבות. מקורות הזיהום בסביבת המעבדה כוללים מיקרואורגניזמים מוטסים (כולל אלה הנצמדים לאבק וחלקיקי מוך), חיידקים הנמצאים בסביבת העבודה של ספסל המעבדה או על כלי זכוכית או ציוד לא סטריליים, ומיקרואורגניזמים המועברים מגופו ושיערו של החוקר. השימוש בטכניקה אספטית הוא גם אמצעי בטיחות שמוריד את הפוטנציאל להעברת מיקרואורגניזמים לחוקרים, וזה חשוב במיוחד בעת עבודה עם פתוגנים.
1. הכנה לעבודה אספטית
- השגו והחלו את פריטי ה- PPE הבאים: חלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל (ללא דמעות או חורים) ומשקפי בטיחות(איור 1). לבטיחות במקרה של שימוש בלהבה פתוחה, לקשור את השיער הארוך.
איור 1: PPE: חלוק מעבדה, כפפות לטקס ומשקפי בטיחות. - היבט חשוב שני של טכניקה אספטית הוא עיקור ואחסון נאותים של מדיה / ריאגנטים לשימוש במעבדה. הכן מדיום מרק נוזלי(למשל,ציר סויה טריפטי) ומדיה מבוססת אגר(למשל,R2A) על ידי שקילה של הכמות הנכונה של אבקת בסיס מיובש, אשר מתווסף לכמות המתאימה של מים דה מיוננים.
- עבור מדיום המרק, להמיס את האבקה על צלחת חמה עם חום נמוך מוחל, ולחלק את הנוזל או בנפחים 100 מ"ל לתוך צלוחיות בורג זכוכית העליון, או בנפחים 10 מ"ל לתוך מבחנות בורג זכוכית העליון. בעזרת מוט ערבוב מגנטי, מערבבים את מדיום האגורוז על מערבל הצלחת החמה עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין.
- החלת סרט אוטומטי על הגורמים המכילים, ובודד את המדיה באופן אוטומטי בהתאם להוראות היצרן (למשל,20 דקות ב- 121 °C(איורים 2 ו - 3). שים לב שצבע הפסים בקלטת ההקלבה האוטומטית צריך להשתנות מלבן (טרום-autoclave) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית). למרות שינוי הצבע בדרך כלל מציין כי עיקור היה מוצלח, בדיקות עיקור באמצעות ערכות רצועת נבג ניתן לבצע כדי לאמת את תהליך autoclaving.
איור 2: הקלטת המוחלת אוטומטית על חומר.
איור 3: שים לב לשינוי הצבע של פסים בקלטת אוטומטית מלבן (טרום-אוטוקלבה) לשחור (לאחר ההקלבה האוטומטית). - מצננים את המרק הנוזלי לטמפרטורת החדר, ואז מאחסנים בטמפרטורת החדר או בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- מצננים את מדיום האגורוז על ידי הנחת המיכל באמבט מים מוגדר ~ 50 מעלות צלזיוס. לאחר התקררות, ניתן לשפוך את המדיה למנות פטרי סטריליות. אפשר למדיום להתקרר ולחזק, ולאחר מכן להתאחד לאחסון בטמפרטורות שצוינו על-ידי היצרן.
- ישנם מספר סוגים של מדיה תרבותית כי לא ניתן autoclaved כמו הטמפרטורות הגבוהות להשפיל מרכיבים קריטיים. חיטוי אלה דורשים עיקור מסנן באמצעות מערכת סינון ואקום המשתמשת מסנן 0.22-μm, ואחריו אחסון בטמפרטורה המתאימה.
- לפני ביצוע העבודה על הספסל, לחטא את פני השטח באמצעות פתרון מתאים (למשל,אקונומיקה 500-ppm). זה מוריד את הסיכון להעברת מזהמים משטח העבודה לתרבויות ומדיה סטרילית.
- כדי להקים שדה סטרילי, הפעל מבער בונזן. סוג הלהבה המתאים ביותר לחיטוי לולאות חיטוי מתכת הוא להבה כחולה עזה, עם קונוס כחול מוחלט שנצפו באמצע(איור 4).
איור 4: העברת חיידקים מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית ללוח פטרי לא מחוסן אחר המכיל מדיום גדילה מבוסס אגר. - לאט לאט להעביר את הלולאה המחסנת דרך החלק החם ביותר של הלהבה (קצה החרוט הכחול). הלולאה צריכה להפוך אדומה חמה לצורך עיקור.
2. העברות חיידקים: מצלחת פטרי לצלחת פטרי
- תרחיש אחד של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי אחת המציגה צמיחה של איזולט בתרבית לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה מבוסס אגר.
- ראשית, פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורה, והקשו בעדינות על לולאת החקוס החמה והמיערת על פני השטח של אגר.
- יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
- בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
- עבור כל חלק של פס הבידוד (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש או לבוא במגע עם לולאות הפיקוח.
- מניחים את הצלחות המפוספסות באינקובטור לצמיחה בן לילה.
3. העברות חיידקים: מתרבות מרק לצלחת פטרי
- תרחיש שני של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה, כפי שנצפו בדרך כלל על ידי עכוז, לצלחת פטרי סטרילית המכילה מדיום צמיחה.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל 2-3x דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- מנמיכים בזהירות את לולאת החנק המעוקרת לתוך הצינור/הבקבוקון, ולחצו בעדינות על צד המיכל כדי להתקרר רגע לפני הכניסה לתרבות המרק.
- הסירו לולאה אחת של תרבות המרק(איור 5)והחליפו מיד את המכסה.
איור 5: לולאה אחת של תרבות מרק. - בצע פס לבידוד באמצעות צלחת פטרי טרייה המכילה מדיום תרבות, עם המכסה מעט פתוח.
- עבור כל חלק של הרצף (3 סה"כ לצלחת), לחטא את לולאת החנק רגע לפני השימוש. כמו כן, לחטא את הלולאה מיד לאחר ביצוע הרצף הסופי על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר עשויים מאוחר יותר להשתמש לולאות חיטוי.
- מניחים את הצלחות המפוספסות לבידוד באינקובטור לצמיחה בן לילה.
4. העברות חיידקים: מצלחת פטרי עם צמיחה לבינוני נוזלי סטרילי
- תרחיש שלישי של העברת חיידקים הוא מצלחת פטרי המכילה פס תרבות מבודד לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
- פתחו מעט את צלחת הפטרי המכילה את תרבית החיידקים הטהורים, וקררו את לולאת החנק החמה על ידי הקשה עליה בעדינות על משטח אגר.
- יש לאחזר מושבה מבודדת אחת מפני השטח של הלוח באמצעות לולאת החנק המקוררת, ולסגור את צלחת הפטרי.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל 2 עד 3 פעמים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, אל תניח את המכסה על הספסל.
- בזהירות להוריד את המושבה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי, בעדינות להסעיר את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
- עקר להבה את לולאת החנק על מנת למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה אשר מאוחר יותר עשויים להשתמש לולאות חיטוי.
- מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
- הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
- צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
- הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.
5. העברות חיידקים: מתרבות מרק למדיום צמיחה נוזלי סטרילי
- תרחיש רביעי של העברת חיידקים הוא מתרבות מרק המציגה צמיחה לצינור / בקבוקון המכיל מדיום צמיחה נוזלי סטרילי.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את התרבות החיידקית הטהורה, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- בזהירות להוריד את לולאת החנק לתוך הצינור / בקבוקון, ולחץ בעדינות על הצד של המיכל להתקרר רק לפני הכניסה לתרבות המרק.
- הסר לולאה אחת של תרבות מרק, ומיד להחליף את הכובע.
- הסר את המכסה מן המבחנה (או הבקבוקון) המכיל את מדיום הצמיחה הנוזלי סטרילי, ולהעביר את פתיחת המיכל פעמיים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. כדי למנוע זיהום, לא להניח את הכובע על הספסל.
- בזהירות להוריד את הלולאה המופקת לתוך מדיום מרק נוזלי סטרילי, בעדינות להתסיס את הלולאה על מנת לשחרר את החיידקים. החליפו מיד את המכסה.
- עקר את לולאת ההשמדה (איור 6) כדי למנוע זיהום של משטח הספסל וכשיקול לאחרים במעבדה שעשויים מאוחר יותר להשתמש בלולאות המחסנות.
איור 6: לולאה מחסן שהופכת ללחמה אדומה בזמן שהיא מעוקרת עם מבער בונזן. - מניחים את הבקבוקון לתוך אינקובטור לצמיחה בן לילה.
- הסר את הבקבוקון מדגירה למחרת. בצע סדרת דילול כדי למנות את התרבות.
- צלחת הדילולים מהסדרה על מדיה תרבות agarose, ודגורת הצלחות בן לילה.
- הסר את הצלחות למחרת, ולהתבונן לכל זיהום.
טכניקה אספטית היא מיומנות בסיסית במיקרוביולוגיה, ויש לה יישומים מכריעים במחקר סביבתי.
אם תרביות מיקרוביולוגיות מזוהמות, הזמן, העבודה והעלויות הכספיות שיידרשו ממעבדה כדי "לנקות" או להחליף את התרביות, במיוחד מבודדים נדירים מסביבות ייחודיות, עלולות להיות גבוהות מאוד ובלתי אפשריות, וחלק מהדגימות עשויות להיות בלתי ניתנות להחלפה.
שימוש נכון בטכניקות אספטיות מפחית את הסבירות לזיהום חיידקי ופטרייתי של ריאגנטים, אמצעי תרבית ודגימות סביבתיות, וגם מונע זיהום צולב בין דגימות. זהו גם אמצעי בטיחות שמפחית את ההעברה הפוטנציאלית של חיידקים לנסיין, וזה חשוב במיוחד בעבודה עם פתוגנים.
סרטון זה יציג את עקרונות האספסיס; מספר טכניקות חשובות לשמירה על ריאגנטים ותרביות סטריליות; ולבסוף, כמה מהשימושים שלהם במדעי הסביבה.
המטרה של שימוש בטכניקות אספטיות היא ליצור ולתחזק סביבת עבודה סטרילית, ציוד וריאגנטים, כדי למזער זיהום של דגימות ביולוגיות. מקורות זיהום נפוצים כוללים מיקרואורגניזמים הנישאים באוויר, חיידקים הנמצאים על ספסל המעבדה או הציוד, ואלה מהשיער, הגוף והבגדים של החוקר.
שני סוגים של חומרים הם מרכזיים להסרה או למניעה של זיהום במעבדה: כימיקלים לחיטוי וחום. פתרונות כגון 70% אתנול ואקונומיקה מדוללת משמשים לעתים קרובות לחיטוי ציוד, משטחי עבודה וכפפות של נסיינים לפני שהם עוסקים בעבודה אספטית.
במקביל, חיידקים על או בתוך כלים, כלי זכוכית ומדיה נוזלית יכולים להיהרג בחום בחיטוי, שהוא תא המעקר תוכן באמצעות חשיפה לאדים בלחץ בטמפרטורה גבוהה. בנוסף, כלים כגון מוטות זכוכית המשמשים לציפוי מפוזר ולולאות חיסון מתכת ניתנים לעיקור בחום באמצעות מקור להבה, כגון מבער בונסן.
השימוש במקור להבה הוא גם אחת הדרכים הנפוצות ביותר להקמת סביבת עבודה אספטית. החום מהלהבה גורם להסעת אוויר, יוצר זרם מעלה המרים את כל המזהמים הנישאים באוויר מסביבת המבער, ויוצר "שדה סטרילי" בו ניתן לבצע עבודות ניסוי אספטיות.
כעת, לאחר שהבנתם את העקרונות מאחורי טכניקות אספטיות ומדוע הן חשובות, בואו נעבור על פרוטוקול ליצירת סביבת עבודה אספטית, יצירת מצע גידול סטרילי והעברה אספטית של חיידקים בין תנאי תרבות שונים.
לפני תחילת העבודה האספטית, חשוב שהנסיין ילבש ציוד מגן אישי מתאים, או PPE. המטרה היא גם למנוע מהנסיין לזהם את הדגימות ותרביות המעבדה, וגם למנוע העברה של חיידקים פתוגניים פוטנציאליים לחוקר. פריטי PPE כוללים מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.
השלב הבא הוא לעקר ולאחסן כראוי את מצע הגידול שישמש לתרבית הדגימות המיקרוביאליות. ראשית, שקלו את הכמות הנכונה של רכיבי מדיום מוצקים, והוסיפו אותם לנפח המתאים של ממס נוזלי שצוין על ידי היצרן, כגון מים נטולי יונים, במיכל הניתן לחיטוי הוסף מוט ערבוב מגנטי, הנח את המיכל על מערבל פלטה חמה, והמיס את רכיבי המדיום המוצק בחום נמוך ותוך ערבוב.
סגור את המכולות הבינוניות. אם משתמשים בכלי זכוכית עם מכסה הברגה, הקפידו לא להדק את המכסה לחלוטין, מכיוון שהאוויר בתוך הכלים יתרחב עקב חימום במהלך החיטוי וצריך לברוח. ללא מילוט, הגז עלול לגרום לכלי השיט להיקרע. שים חתיכת סרט חיטוי על הכלים, ובצע חיטוי של המדיה בהתאם להוראות היצרן, כגון 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. לאחר החיטוי, ודא שהפסים על סרטי החיטוי השחירו, מה שמצביע על הטמפרטורה המתאימה.
למצעי גידול נוזליים, הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר, ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר או בקירור לפי הצורך. עבור מצעי גידול מוצקים מבוססי אגר, תנו להם להתקרר לכ-50? C, ואז יוצקים לצלחות פטרי סטריליות. הניחו לאגר להתקרר ולהתמצק לפני האחסון בטמפרטורה המתאימה.
עבור מדיה שלא ניתן לבצע חיטוי עקב נוכחותם של רכיבים רגישים לחום, יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן 0.22 מ'.
טכניקת ליבה בעבודה מיקרוביולוגית היא העברה אספטית של תרביות חיידקים בין מצעי גידול שונים, מוצקים ונוזליים כאחד. לפני שמתחילים, נקו את משטח ספסל המעבדה עם חומר חיטוי. זה מוריד את הסיכון לזיהום תרביות או מדיה סטרילית.
העברת תרביות חיידקים עושה בדרך כלל שימוש בכלי הנקרא לולאת חיסון, שצריך לעקר לפני השימוש על ידי חימום בלהבה.
הפעל מקור להבה. העבירו לאט את לולאת החיסון דרך קצה הלהבה. הלולאה תהפוך לאדום לוהט. כדי להעביר מושבת חיידקים מצלחת אגר מוצקה, פתח מעט את צלחת הפטרי והקש בעדינות על לולאת החיסון החמה על חלק ריק של משטח האגר כדי למנוע הרג חום של החיידקים. מגרדים מושבה בודדת עם לולאת החיסון, וסוגרים את הצלחת.
כדי להעביר חיידקים ממצע גידול נוזלי, הסר את המכסה ממיכל התרבות. כדי לסייע במניעת זיהום, הימנע מהנחת הפקק על הספסל. העבירו את פי המיכל 2-3 פעמים דרך החלק החם ביותר של הלהבה. לאחר מכן, גע בזהירות בלולאת החיסון החמה והמעוקרת בחלק הפנימי של המיכל ותן לו להתקרר לפני הכנסתו לתרבית המרק. הסר לולאה אחת של התרבית, וסגור מיד את המכסה.
להעברת החיידקים המתקבלים למצע גידול סטרילי, הסר את המכסה ממיכל עם המרק הסטרילי והעביר את פתח המיכל דרך הלהבה 2-3 פעמים. לאחר מכן, הורד בזהירות את לולאת החיסון לתוך המדיום, וערבב בעדינות כדי לשחרר את החיידקים. סגור מיד את המכסה. יש לעקר את לולאת החיסון לאחר השימוש.
אם מעבירים חיידקים לצלחת אגר סטרילית, פתחו את המכסה של צלחת פטרי טרייה עם אגר לא מחוסן. פס את לולאת החיסון עם תרבית החיידקים הלוך ושוב על פני מגזר אחד של האגר. עקרו את הלולאה וקררו אותה על ידי נגיעה בחלק ריק של האגר, ואז צרו פס נוסף על האגר בזווית קהה לפס הראשון, הקפידו לחצות את הרצף הראשון ב-1-2 החבטות הראשונות אך הימנעו מלגעת ברצף הראשון בתנועות הבאות. חזור על העיקור והפסים פעמיים נוספות. סגור את צלחת הפטרי, ועקר את לולאת החיסון.
לאחר החיסון, יש לדגור את המרק או צלחת האגר בטמפרטורת הגידול האידיאלית עבור המיקרואורגניזם הנתון כדי להשיג תרבית בת קיימא. על מדיום מוצק, מדשאה או גדיל רציף של חיידקים יהיו גלויים על אגר המכוסה בשני הפסים הראשונים, אך יש להשיג מושבות בודדות בפס האחרון. טכניקות אספטיות גרועות יגרמו לצמיחה של עובש ומזהמים אחרים על הצלחת.
טכניקות אספטיות חשובות בניסויים רבים הכוללים דגימות מיקרוביאליות מהסביבה. במחקר זה, החוקרים בודדו בקטריופאג'ים, שהם נגיפים מדביקי חיידקים, מחיידק האדמה הנפוץ Arthrobacter. תרביות Arthrobacter גודלו לראשונה בתנאים אספטיים. לאחר מכן נשטפו דגימות אדמה וסוננו במאגר פאג'ים, ותמיסת הפאג'ים עורבבה עם תרבית החיידקים וציפתה על צלחות אגר. דשא חיידקי היה נוצר על הצלחת, אבל היו קרחות, או "פלאק", במקומות שבהם הנגיף הדביק והרג את החיידקים. לאחר מכן ניתן היה לטהר את הפאג'ים מהלוחות הללו למחקר נוסף.
מלבד השימוש במבערי Bunsen, ניתן לשמור על סביבות עבודה אספטיות גם בתחנות עבודה מיוחדות הידועות בשם קולטי אדים למינאריים, המשתמשות בזרימת אוויר מכוונת ובמסננים כדי לשמור על סטריליות. כאן, מדענים עבדו במכסה זרימה כדי לבודד חיידקים ווירוסים פתוגניים פוטנציאליים מדגימות מים. מבודדים אלה גודלו לאחר מכן יחד עם אמבות. מכיוון שאמבות בדרך כלל אוכלות חיידקים או "פגוציטוז", כל חיידק שהיה מסוגל להתנגד לעיכול אמבלי ולהישאר באורגניזמים האלה יכול גם להישאר בר קיימא בתאים אנושיים ולגרום למחלות.
לבסוף, התנאים הסטריליים מאפשרים מחקר מפורט של מנגנונים אקולוגיים כמו היווצרות גושי שורש בצמחי קטניות - איברים מלאי חיידקים ש"מקבעים" חנקן אטמוספרי לאמוניה, המשמשת את הצמח לגידול. החוקרים כאן יצרו "מיקרוקוסמוס" לחקר תהליך הגושים באמצעות לוחות פטרי מחורצים עם מצע גידול צמחים, הניחו שתילים לתוכם וחיסנו את השתילים בחיידקי ריזוביאל יוצרי גושים. הסביבה האספטית של מכסה המנוע מונעת זיהום של התרבויות בחיידקים או פטריות אחרות.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על טכניקות אספטיות במדעי הסביבה. כעת עליך להבין מדוע תנאי עבודה אספטיים חשובים; כיצד לבצע ניסויים מיקרוביולוגיים באופן אספטי; וכמה יישומים של טכניקות אספטיות למחקר סביבתי. כמו תמיד, תודה שצפית!
התוצאה של ההליך מדגימה טכניקה אספטית נכונה וטכניקה אספטית גרועה. איור 7 ממחיש את הזיהום שיכול לנבוע מטכניקה אספטית גרועה בעת שפיכת לוחות אגרוז (צלחת עליונה: מדיום סטרילי; צלחות תחתונות: מדיה מזוהמת).
איור 7: זיהום שיכול לנבוע מטכניקה אספטית גרועה בעת שפיכת צלחות אגרוז. צלחת עליונה: מדיום סטרילי; לוחיות תחתונות: מדיה מזוהמת.
מלבד שימוש במבערי בונסן, סביבות עבודה אספטיות יכולות להישמר גם בתחנות עבודה מיוחדות המכונות ברדסים לזרימת למינאר, המשתמשים בזרימת אוויר מכוונת ומסננים לשמירה על סטריליות.
שימוש נכון בטכניקה אספטית חיוני למיקרוביולוגים סביבתיים בעת דגימה בשטח ובמעבדה בעת עבודה עם מדיה, ריאגנטים ובידודים בתרביתות. טכניקה אספטית גרועה בתחום יכולה לגרום להעברת מיקרואורגניזמים מהטכנאי לדגימות סביבתיות קריטיות, כמו גם לזיהום צולב של חיידקים מדגם אחד למשנהו. אירועים כאלה הם בעלי חשיבות, למשל, במחקרים אקולוגיים מיקרו...
Chapters in this video
0:00
Overview
1:10
Principles of Aseptic Technique
3:02
Preparation for Aseptic Work
5:10
Aseptic Transfer of Bacteria Between Liquid Media and Petri Plates
8:13
Applications
10:20
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved