1. הפקת דנ"א מדגימות מזון
- הוסף 500 μL של מטריצת תערובת PCR שנרכשה לכל אחד מ-2 צינורות מכסה הברגים באמצעות צינור העברה או 200-1,000 מיקרופיפט בנפח מתכוונן של 200-1,000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עם הצינור בין כל aliquot לערבב באופן שווה את מטריצת PCR.
- תייג צינור בורג אחד "ללא רכיבים מהונדסים גנטית" והשני "בדיקה".
- יש לשקול 0.5 גרם של מזון מוסמך ללא רכיבים מהונדסים גנטית ולשים אותו במרגמה.
- מוסיפים 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וטוחנים עם עלה במשך 2 דקות כדי ליצור רפש.
- מוסיפים עוד 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וממשיכים לטחון עם עלה עד שההתרפסות הופכת לחלקה מספיק כדי להזרים.
- Pipet 50 μL של תרחיף הקרקע לצינור בורג-cap המכיל 500 μL של PREMIX PCR שכותרתו "ללא מהונדס גנטית" באמצעות סימן 50-μL על צינור מדורג. צינור סיכום.
- חזור על שלבים 1.3-1.6 כדי להכין את דגימת המזון לבדיקה.
- Pipet 50 μL של מזון מבחן הקרקע slurry לצינור בורג-cap שכותרתו "מבחן". צינור סיכום.
- מערבולת מזון ללא GMO וצינורות PCR מזון מבחן במשך 1 דקות ומניחים צינורות באמבט מים 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אם אין מערבולת זמינה, להקפל את הצינור מספר פעמים לערבב לפני הצבה באמבט מים.
- מניחים צינורות בצנטריפוגה למשך 5 דקות. גלולה מוצקה צריכה להיווצר בתחתית הצינור. אם הכדור אינו נוצר לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב במשך 2 דקות מרווחים עד שנוצר גלולה.
- צינורות יכולים לשמש באופן מיידי עבור PCR או מאוחסנים במקרר עד שבוע אחד.
2. הגדרת תגובות PCR
- מספר צינורות PCR 1-6 וראשי תיבות אותם. המספרים אמורים להתאים לתוכן הצינור הבא המפורט בטבלה 1.
- מניחים כל צינור PCR מסומן במחזיק microTube עם כובעים פתוחים.
- באמצעות עצה חדשה עבור כל תוספת, להוסיף 20 μL של פריימר המצוין על טבלה 1 לכל צינור PCR. צינורות כובע.
- באמצעות קצה טרי עבור כל צינור, להוסיף 20 μL של דגימת ה- DNA המצוין על שולחן 1 לכל צינור PCR, להיות בטוח pipette רק מן supernatant והימנעות גלולה מוצק בתחתית הצינורות.
- לאחר כל דגימת DNA הוא pipetted לתוך צינור PCR המתאים, להשתמש pipette לערבב DNA פריימר על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה; סיכום צינורות.
- מקם צינורות PCR ב אופניים תרמי ולתכנת את רוכב האופניים עבור:
דנטורה ראשונית: מחזור אחד ב 94 °C (70 °F) במשך 2 דקות.
הגברה: 40 מחזורים ב 94 °C (74 °F) במשך 1 דקות (denature), 59 °C (חישול), ו 72 °C (72 °F) במשך 2 דקות (הארכה).
הארכה סופית: מחזור אחד ב 72 °C (72 °F) במשך 10 דקות.
החזקה: 4 °C ללא הגבלת זמן.
3. 3% הכנת ג'ל אגרוז
- באמצעות מעבדה או סרט מיסוך, יש להדביק בבטחה את הקצוות הפתוחים של מגש הג'ל. ודא שהקלטת אטומה בשולי המגש כדי למנוע אגרוז מותך לדלוף החוצה.
- לשקול 3 גרם של agarose לתוך בקבוקון 250 מ"ל או גדול יותר ארלנמאייר.
- הוסף 100 מ"ל של מאגר 1x TAE (נרכש או מוכן מהתרכיז).
- בעזרת צלחת חמה מגנטית עם מוט ערבוב, מחממים את הכוס עד שאגורז מומס לחלוטין במאגר והפתרון רותח ומתבהר. לחלופין, מיקרוגל יכול לשמש על ידי הצבת בתנור וחימום במשך 30 מרווחים, באמצעות מוט ערבוב לערבב כל 10 שניות, חוזר עד התערובת רותחת ומתבהר.
- הפוך בקבוק ארלנמאייר 50 מ"ל לתוך הפתיחה של בקבוקון 250 מ"ל לשמש ריפלוקס, מניעת פתרון אגרוז מתאדה.
- אפשר פתרון אגרוז להתקרר עד 60 °C (60 °F), ויוצקים 30-50 מ"ל לתוך כל מגש ג'ל מודבק.
- מניחים מסרק ג'ל לתוך זוג החיצנים הראשונים כדי ליצור בארות ג'ל.
- אפשר ג'ל להתקרר לחלוטין לפני הסרת סרט הדבקה ומסרק. הג'ל יתמצק ויהפוך בהיר לענן כאשר הוא מוכן, כ-10-20 דקות.
4. אלקטרופורזה של מוצרי PCR
- מניחים ג'ל אגרוז 3% עשוי מראש על מגש ג'ל או משתמשים במגש ג'ל ששימש ליציקת ג'ל אגרוז 3% שנשפך.
- החלק מגש ג'ל לתוך תא האלקטרופורזה עם בארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה (שחור).
- יוצקים 1x חיץ TAE לתוך התא, מספיק כדי לקבל 2 מ"מ של חוצץ מעל החלק העליון של מגש הג'ל.
- להשיג צינורות PCR מן רוכב האופניים התרמי ומניחים מחזיק microTube.
- באמצעות טיפ פיפטה טרי בכל פעם, להוסיף 10 μL של צבע טעינה תפוז G שנרכש (LD) לכל מדגם ומערבבים היטב.
- טען 20 μl של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל בסדר המצוין (טבלה 2).
- הפעל אלקטרופורזה ג'ל במשך 30 דקות ב 100 V.
- הסר מגש ג'ל מהתא וג'ל שקופית כדי להסיר מהמגש. מניחים ג'ל במגש כתמים.
- יש לטבול ג'ל בכתם ג'ל DNA שנרכש במשך 5 דקות, ולנער בזהירות את המגש כדי לעזור להפיץ את הכתם לאורך הג'ל.
- מעבירים את הג'ל למיכל כביסה ושוטפים במי ברז (40-55 מעלות צלזיוס) למשך כ-10 מעלות.
- יש להקנות על ידי שטיפת 3x במי ברז חמים למשך 6 דקות כל אחד עם רעידות עדינות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, יש להמשיך להתיר במים חמים עד להגעה לניגוד הרצוי.
| מספר צינור | תחל | דגימת דנ"א |
| 1 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 2 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 3 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 4 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 5 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
| 6 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
טבלה 1. רשימה של מספרי הצינור המתאימים, פריימרים, ודגימות DNA.
| ובכן 1 | מדגם 1 בקרת מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 2 | דגימה 2 בקרת מזון ללא מהונדס גנטית עם פריימרים מהונדסים גנטית 20 μL. |
| ובכן 3 | מדגם 3 מזון בדיקה עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 4 | מדגם 4 מזון בדיקה עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 5 | דגימת 5 GMO DNA חיובי עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 6 | דגימת 6 GMO DNA חיובי עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 7 | סרגל משקל מולקולרי PCR 20 μL. |
| ובכן 8 | תשאירו ריקים. |
טבלה 2. הסדר המתאים לטעון 20 μL של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל.
מקור: מעבדות של מרגרט וורקמן וקימברלי פריי - אוניברסיטת דפול
שינוי גנטי של מזונות היה נושא שנוי במחלוקת בשל חששות שנויים במחלוקת על בריאות ובטיחות הסביבה. ניסוי זה מדגים הבנה טכנית של האופן שבו DNA מזון מזוהה גנטית, ומאפשר קבלת החלטות משכילה על הבטיחות ואת הסכנות הפוטנציאליות של שימוש אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMOs) באספקת מזון.
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) משמשת להגברת DNA מזון כדי לבדוק את נוכחותו של DNA מהונדס גנטית במוצרי מזון. נוכחות של רצועות DNA ספציפיות מזוהה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל למשוך DNA מזון שחולץ דרך ג'ל אגרוז 3%, ריכוז צפוף מספיק כדי להפריד את רצועות ה- DNA המכיל את ה- DNA מהונדס גנטית. מספר פקדים משמשים בהליך אלקטרופורזה כדי להבטיח שהדנ"א מופק בהצלחה ממזונות בדיקה (פריימר צמחי), ולספק דוגמאות ידועות הן לדנ"א מהונדס גנטית (שנרכש בדנ"א מהונדס גנטית) והן לדנ"א שאינו מהונדס גנטית (בקרת מזון מאושרת שאינה מהונדסת גנטית).
1. הפקת דנ"א מדגימות מזון
- הוסף 500 μL של מטריצת תערובת PCR שנרכשה לכל אחד מ-2 צינורות מכסה הברגים באמצעות צינור העברה או 200-1,000 מיקרופיפט בנפח מתכוונן של 200-1,000 μL. פיפטה למעלה ולמטה עם הצינור בין כל aliquot לערבב באופן שווה את מטריצת PCR.
- תייג צינור בורג אחד "ללא רכיבים מהונדסים גנטית" והשני "בדיקה".
- יש לשקול 0.5 גרם של מזון מוסמך ללא רכיבים מהונדסים גנטית ולשים אותו במרגמה.
- מוסיפים 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וטוחנים עם עלה במשך 2 דקות כדי ליצור רפש.
- מוסיפים עוד 2.5 מ"ל של מים מזוקקים וממשיכים לטחון עם עלה עד שההתרפסות הופכת לחלקה מספיק כדי להזרים.
- Pipet 50 μL של תרחיף הקרקע לצינור בורג-cap המכיל 500 μL של PREMIX PCR שכותרתו "ללא מהונדס גנטית" באמצעות סימן 50-μL על צינור מדורג. צינור סיכום.
- חזור על שלבים 1.3-1.6 כדי להכין את דגימת המזון לבדיקה.
- Pipet 50 μL של מזון מבחן הקרקע slurry לצינור בורג-cap שכותרתו "מבחן". צינור סיכום.
- מערבולת מזון ללא GMO וצינורות PCR מזון מבחן במשך 1 דקות ומניחים צינורות באמבט מים 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אם אין מערבולת זמינה, להקפל את הצינור מספר פעמים לערבב לפני הצבה באמבט מים.
- מניחים צינורות בצנטריפוגה למשך 5 דקות. גלולה מוצקה צריכה להיווצר בתחתית הצינור. אם הכדור אינו נוצר לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב במשך 2 דקות מרווחים עד שנוצר גלולה.
- צינורות יכולים לשמש באופן מיידי עבור PCR או מאוחסנים במקרר עד שבוע אחד.
2. הגדרת תגובות PCR
- מספר צינורות PCR 1-6 וראשי תיבות אותם. המספרים אמורים להתאים לתוכן הצינור הבא המפורט בטבלה 1.
- מניחים כל צינור PCR מסומן במחזיק microTube עם כובעים פתוחים.
- באמצעות עצה חדשה עבור כל תוספת, להוסיף 20 μL של פריימר המצוין על טבלה 1 לכל צינור PCR. צינורות כובע.
- באמצעות קצה טרי עבור כל צינור, להוסיף 20 μL של דגימת ה- DNA המצוין על שולחן 1 לכל צינור PCR, להיות בטוח pipette רק מן supernatant והימנעות גלולה מוצק בתחתית הצינורות.
- לאחר כל דגימת DNA הוא pipetted לתוך צינור PCR המתאים, להשתמש pipette לערבב DNA פריימר על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה; סיכום צינורות.
- מקם צינורות PCR ב אופניים תרמי ולתכנת את רוכב האופניים עבור:
דנטורה ראשונית: מחזור אחד ב 94 °C (70 °F) במשך 2 דקות.
הגברה: 40 מחזורים ב 94 °C (74 °F) במשך 1 דקות (denature), 59 °C (חישול), ו 72 °C (72 °F) במשך 2 דקות (הארכה).
הארכה סופית: מחזור אחד ב 72 °C (72 °F) במשך 10 דקות.
החזקה: 4 °C ללא הגבלת זמן.
3. 3% הכנת ג'ל אגרוז
- באמצעות מעבדה או סרט מיסוך, יש להדביק בבטחה את הקצוות הפתוחים של מגש הג'ל. ודא שהקלטת אטומה בשולי המגש כדי למנוע אגרוז מותך לדלוף החוצה.
- לשקול 3 גרם של agarose לתוך בקבוקון 250 מ"ל או גדול יותר ארלנמאייר.
- הוסף 100 מ"ל של מאגר 1x TAE (נרכש או מוכן מהתרכיז).
- בעזרת צלחת חמה מגנטית עם מוט ערבוב, מחממים את הכוס עד שאגורז מומס לחלוטין במאגר והפתרון רותח ומתבהר. לחלופין, מיקרוגל יכול לשמש על ידי הצבת בתנור וחימום במשך 30 מרווחים, באמצעות מוט ערבוב לערבב כל 10 שניות, חוזר עד התערובת רותחת ומתבהר.
- הפוך בקבוק ארלנמאייר 50 מ"ל לתוך הפתיחה של בקבוקון 250 מ"ל לשמש ריפלוקס, מניעת פתרון אגרוז מתאדה.
- אפשר פתרון אגרוז להתקרר עד 60 °C (60 °F), ויוצקים 30-50 מ"ל לתוך כל מגש ג'ל מודבק.
- מניחים מסרק ג'ל לתוך זוג החיצנים הראשונים כדי ליצור בארות ג'ל.
- אפשר ג'ל להתקרר לחלוטין לפני הסרת סרט הדבקה ומסרק. הג'ל יתמצק ויהפוך בהיר לענן כאשר הוא מוכן, כ-10-20 דקות.
4. אלקטרופורזה של מוצרי PCR
- מניחים ג'ל אגרוז 3% עשוי מראש על מגש ג'ל או משתמשים במגש ג'ל ששימש ליציקת ג'ל אגרוז 3% שנשפך.
- החלק מגש ג'ל לתוך תא האלקטרופורזה עם בארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה (שחור).
- יוצקים 1x חיץ TAE לתוך התא, מספיק כדי לקבל 2 מ"מ של חוצץ מעל החלק העליון של מגש הג'ל.
- להשיג צינורות PCR מן רוכב האופניים התרמי ומניחים מחזיק microTube.
- באמצעות טיפ פיפטה טרי בכל פעם, להוסיף 10 μL של צבע טעינה תפוז G שנרכש (LD) לכל מדגם ומערבבים היטב.
- טען 20 μl של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל בסדר המצוין (טבלה 2).
- הפעל אלקטרופורזה ג'ל במשך 30 דקות ב 100 V.
- הסר מגש ג'ל מהתא וג'ל שקופית כדי להסיר מהמגש. מניחים ג'ל במגש כתמים.
- יש לטבול ג'ל בכתם ג'ל DNA שנרכש במשך 5 דקות, ולנער בזהירות את המגש כדי לעזור להפיץ את הכתם לאורך הג'ל.
- מעבירים את הג'ל למיכל כביסה ושוטפים במי ברז (40-55 מעלות צלזיוס) למשך כ-10 מעלות.
- יש להקנות על ידי שטיפת 3x במי ברז חמים למשך 6 דקות כל אחד עם רעידות עדינות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, יש להמשיך להתיר במים חמים עד להגעה לניגוד הרצוי.
| מספר צינור | תחל | דגימת דנ"א |
| 1 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 2 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול DNA בקרת מזון ללא מהונדס גנטית |
| 3 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 4 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 מיקרול בדיקת DNA מזון |
| 5 | 20 פריימר צמח μL (ירוק) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
| 6 | פריימר מהונדס גנטית 20 μL (אדום) | 20 μL GMO שליטה חיובית DNA |
טבלה 1. רשימה של מספרי הצינור המתאימים, פריימרים, ודגימות DNA.
| ובכן 1 | מדגם 1 בקרת מזון ללא רכיבים מהונדסים גנטית עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 2 | דגימה 2 בקרת מזון ללא מהונדס גנטית עם פריימרים מהונדסים גנטית 20 μL. |
| ובכן 3 | מדגם 3 מזון בדיקה עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 4 | מדגם 4 מזון בדיקה עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 5 | דגימת 5 GMO DNA חיובי עם פריימרים צמחיים 20 μL. |
| ובכן 6 | דגימת 6 GMO DNA חיובי עם פריימרים GMO 20 μL. |
| ובכן 7 | סרגל משקל מולקולרי PCR 20 μL. |
| ובכן 8 | תשאירו ריקים. |
טבלה 2. הסדר המתאים לטעון 20 μL של סרגל המשקל המולקולרי ו 20 μL של כל דגימה לתוך הג'ל.
מזונות מהונדסים גנטית הם מוצרים המכילים מרכיב או מרכיבים שה-DNA שלהם שונה באופן ספציפי. ניתן לזהות נוכחות של שינויים אלה באמצעות טכניקה הנקראת תגובת שרשרת פולימראז.
שינוי גנטי של מזון היה נושא שנוי במחלוקת בשל חששות שנויים במחלוקת לגבי בריאות ובטיחות סביבתית. היכולת לזהות DNA מהונדס גנטית בדגימות מזון מעניינות מאפשרת קבלת החלטות מושכלת לגבי הבטיחות והסכנות הפוטנציאליות של שימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית, או GMO's, באספקת מזון.
תגובת שרשרת הפולימראז, או PCR, משמשת להגברת ה-DNA של המזון כדי לקבוע נוכחות או היעדר רצפים מהונדסים גנטית. לאחר מכן, אלקטרופורזה של ג'ל מושכת את ה-DNA המוגבר דרך מטריצת ג'ל אגרוז ומפרידה בין רצועות DNA בגדלים שונים התואמים לסמנים ששונו או לא השתנו. לאחר מכן משווים אותם לרצועות ביקורת ממזונות הידועים כמכילים רכיבים מהונדסים גנטית, או ידועים כנטולי שינויים.
סרטון זה ימחיש את העקרונות מאחורי זיהוי DNA מהונדס גנטית מדגימות מזון, כיצד לחלץ DNA ולהגביר סמנים המשמשים בתהליך השינוי הגנטי, וכיצד ניתן לקבוע נוכחות או היעדר של GMO בדגימות מזון.
תגובת שרשרת פולימראז מזהה רצפים של DNA שהוכנסו למזון מהונדס גנטית. DNA הוא מולקולה יציבה יחסית, כך שניתן לבודד מקטעי DNA ברי קיימא המתאימים להגברה אפילו ממוצרים מעובדים מאוד, כמו צ'יפס תירס או המבורגרים ירקות. מספר קטן של רצפי DNA רגולטוריים משמשים לשליטה בביטוי של גנים שהוחדרו, כך שרצפים אלה קיימים ברוב הגידולים המהונדסים גנטית. הליך זה מזהה שניים מהנפוצים ביותר, הגן המקדם 35S והגן הסופי של סינתאז נופלין. רצף 35S הוא מקדם חזק, וכאשר הוא מחובר לגן מוכנס יניע רמות ביטוי קבועות וגבוהות. מסוף סינתאז נופלין כלול כדי לעצור את השעתוק של הגן המוחדר בנקודת הקצה הרצויה.
PCR כרוך במחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים במחזור תרמי, מכונה השולטת בחוזקה על הטמפרטורה של צינורות תגובת PCR. חימום הדגימה ל-94? C גורם לגדילי DNA להתפרק ולהיפרד. קירור מהיר בין 45 ל-65? C מאפשר פריימרים לחישול לגדילי ה-DNA המופרדים. לבסוף, חימום מחדש ל-72? C מאפשר לאנזים Taq polymerase להרחיב את הפריימרים ולהשלים שכפול של אזור המטרה.
פריימר צמחי שנרכש מתווסף לכל דגימה, ויגבר בדגימות המכילות DNA צמחי. תבניות חיוביות של GMO עבור 35S ו-NOS משמשות כדי לספק בקרה חיובית עבור GMOs. מאושר ללא רכיבים מהונדסים גנטית משמש כביקורת שלילית. אם אחת מתגובות הבקרה הללו מציגה רצועות בלתי צפויות, לא ניתן לסמוך על תוצאות דגימות הבדיקה.
DNA מוגבר מועבר דרך ג'ל אגרוז על ידי אלקטרופורזה. מוצרי PCR מעורבבים עם צבע ונטענים לבארות. ה-DNA טעון שלילית, וכאשר הוא נטען לתוך הג'ל בקצה הקתודה של החדר ינוע לכיוון קצה האנודה כאשר מופעל זרם. שברי DNA גדולים יותר אינם יכולים לנוע באותה קלות דרך מטריצת הג'ל ולכן יישארו קרובים יותר לקתודה, בעוד שרצפים קטנים יותר נעים לכיוון קצה האנודה, וכתוצאה מכך הפרדה של DNA בגודל שונה לרצועות נפרדות.
לאחר אלקטרופורזה, צביעת ג'ל עוזרת לדמיין רצועות DNA מופרדות.
כעת, לאחר שאנו מכירים את העקרונות מאחורי זיהוי GMO והשימוש ב-PCR ואלקטרופורזה לזיהוי GMO, בואו נסתכל כיצד ניתן לבצע זאת במעבדה.
לאחר זיהוי מוצרי המזון המעניינים, ניתן להתחיל בניתוח. כדי לחלץ את ה-DNA, קחו שני צינורות הברגה נקיים, ולתוך כל אחד מהם העבירו 500? L של מגיב בידוד DNA שנרכש, תוך הקפדה על פיפטה של התערובת למעלה ולמטה בין אליקוטים כדי לערבב את המגיב באופן שווה. סמן את אחת השפופרות "ללא GMO", ואת השנייה "בדיקה".
לאחר מכן, שקלו 0.5 גרם של מזון מאושר שאינו מהונדס גנטית, והניחו במכתש נקי. מוסיפים 2.5 מ"ל מים מזוקקים, וטוחנים עם העלי במשך 2 דקות ליצירת slurry. מוסיפים עוד 2.5 מ"ל מים מזוקקים וממשיכים לטחון את התרחיץ עד שהוא הופך חלק מספיק כדי לפפטה.
פיפטה 50 ? L של התרחיץ הידוע שאינו GMO לצינור הברגה המסומן "לא GMO" המכיל את מגיב בידוד ה-DNA. עכשיו תוסיף 50? L של תמיסת דגימת המזון לבדיקה לצינור ההברגה המסומן "בדיקה". מערבולת את שני הצינורות המכילים את דגימות המזון ומגיב ה- DNA למשך דקה אחת. לאחר מכן, הניחו את הצינורות באמבט מים ב 95 ? C למשך 5 דקות. לבסוף, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה למשך 5 דקות. לאחר הבדיקה, יש ליצור כדור מוצק בתחתית הצינור. אם לא נוצר כדור לאחר 5 דקות, צנטריפוגה שוב למרווחים של 2 דקות עד שנוצרת גלולה. כעת ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי ל-PCR, או לאחסן במקרר עד שבוע.
ראשית, מספר שש צינורות PCR. מספרים אלה יתאימו לתכולת הצינור המפורטת בטבלה. הנח כל אחד מצינורות ה-PCR המסומנים במחזיק מיקרו-צינור עם מכסים פתוחים.
בעזרת טיפ טרי לכל תוספת, הוסף 20 ? L פריימר המצוין בטבלה לכל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף 20? L של דגימות ה-DNA המצוינות בטבלה לכל צינור PCR. פיפטה למעלה ולמטה למיקס. עבור דגימות כדוריות, הקפד לזרוק פיפטה רק מהסופרנטנט, והימנע מהכדור המוצק בתחתית הצינורות. לבסוף, הנח את צינורות ה-PCR לתוך מחזור תרמי ותכנת אותו לעבור בין שלבי החימום והקירור המצוינים בטבלה.
הכניסו ג'ל אגרוז 3% לתא האלקטרופורזה כשהבארות הקרובות ביותר לקצה הקתודה. הוסף מאגר TAE לתא כדי לכסות 2 מ"מ מעל מגש הג'ל. אסוף את צינורות ה-PCR מהתרמו-סייקלר והנח אותם במחזיק מיקרו-צינור. בעזרת קצה פיפטה טרי בכל פעם, הוסף 10 ? L של DNA שנרכש טוען צבע לכל דגימה ומערבב היטב.
בעזרת קצה טרי בכל פעם, טען את בארות ג'ל האגרוז עם 20 ? L של סרגל משקל מולקולרי לבאר אחת, ו-20 ? L של כל דגימה לבארות הבאות, כפי שמצוין בטבלה זו. הגדר את תא האלקטרופורזה לפעול ב-100 וולט למשך 30 דקות.
לאחר שהג'ל סיים לפעול, נתק בזהירות את תא הג'ל, הסר את המגש והחלק את הג'ל לתוך מגש צביעה. טבלו את הג'ל בכתם ג'ל 100x שנרכש למשך 5 דקות, נערו את המגש בעדינות כדי להפיץ את הכתם. לאחר המוכתם, העבירו את הג'ל למיכל כביסה ושטפו במי ברז למשך כ-10 שניות. יש להימנע על ידי שטיפה שלוש פעמים במי ברז חמים למשך 3 דקות כל אחת, כל אחת עם ניעור עדין לקבלת התוצאות הטובות ביותר. במידת הצורך, המשיכו להרחיק במים חמים עד להשגת הניגודיות הרצויה.
נוכחות או היעדר פס של 200 bp בנתיב 4 מצביע על האם מזון הבדיקה מכיל GMO. פריימרים של הצמח קובעים אם ה-DNA הצמחי הופק בהצלחה מהדגימה. בקרת מזון ללא הנדסה גנטית היא אינדיקטור לתוצאות חיוביות כוזבות, אם הן מתרחשות. אם בקרת המזון ללא GMO יוצאת חיובית, זה אומר שה-PCR היה מזוהם בשלב מסוים. פקד התבנית החיובי ל-GMO הוא אינדיקטור לתוצאות שליליות מוטעות. אם בקרת התבנית החיובית ל-GMO אינה מוגברת, יש בעיה בתגובת ה-PCR ולא ניתן לסמוך על תוצאה שלילית של GMO ממזון הבדיקה.
ניתן להניח ג'לים על נייר לבן או צהוב כדי לספק רקע מנוגד להדגשת רצועות DNA, או להשיג ניגודיות מוגברת באמצעות קופסת אור UV.
היכולת לבדוק מוצרי מזון או מוצרים עבור מרכיבים מהונדסים גנטית רלוונטית למספר יישומים מדעיים או רגולטוריים.
ישנן עדויות לכך שדנ"א מהונדס גנטית מגידולים מהונדסים גנטית יכול להיות מוחדר לגנום של אוכלוסיות גידולי בר. לדוגמה, מאביקים עשויים להקל על העברה זו על ידי דישון צמחים מסוג בר באבקה ממקור מהונדס גנטית. זה מדאיג, מכיוון שההשפעות של התפשטות הגנים המוחדרים הללו על מערכות אקולוגיות בכללותה אינן מובנות היטב. בדיקת PCR של אוכלוסיות בר יכולה לספק נתונים על התפשטות פוטנציאלית, או בלימה מוצלחת, של הוספות גנטיות.
היעדר תיוג, או תיוג שגוי של מרכיבים מהונדסים גנטית יכול להוות דאגה צרכנית. זה יכול לנבוע מהעדפת הצרכן לצריכה, או החדרה פוטנציאלית של אלרגנים במהלך תהליך ה-GM, אם כי האחרון שנוי במחלוקת. במדינות מסוימות, מרכיבים מהונדסים גנטית נדרשים להיות רשומים על אריזות מזון. מועצות רגולטוריות במדינות כאלה עשויות להשתמש בבדיקות PCR כדי לבדוק את דיוק תיוג המזון.
כאשר השינוי הגנטי שהוכנס לגידול מעניק עמידות לחומרי הדברה, כמה מחקרים העלו חששות לגבי ייצור "עשבים-על". בעיקרו של דבר, אלה יכולים להיות כל צמח שלא היה מיועד בתחילה לשינוי שמשיג עמידות בפני חומרי הדברה באמצעות מנגנונים כמו החדרה או הכלאה. צמחים אלה עשויים להיות מסוגלים להתפשט בהצלחה רבה יותר, ויהיה קשה יותר לשלוט בהם מאשר אלה ללא התוספת. בדיקת PCR לשינוי גנטי יכולה לעזור להדגיש ולעקוב אחר אוכלוסיות פוטנציאליות כאלה כדי לקבוע אם התפשטות זו עלולה להיות בעייתית.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לבדיקת מזונות מהונדסים גנטית. כעת עליך להבין את העקרונות מאחורי זיהוי מזונות מהונדסים גנטית באמצעות PCR, כיצד לחלץ ולהגביר DNA ממזון, וכיצד לקבוע אם דגימת המזון שלך עברה שינוי גנטי. תודה שצפית!
לאחר destaining, ג'לים ניתן לנתח על ידי התבוננות בנתיבימזון בדיקה( טבלה 3 ) כדי לקבוע אם רצועות ה- DNA עבור גנים מקדם 35S ו- NOS שליחות קטלנית נמצאים במקומות הידועים על הג'ל. הנחת הג'ל על קופסת אור UV יכולה לעזור לספק ניגודיות מוגברת(איור 1). לחלופין, ניתן להניח ג'לים על נייר לבן או צהוב כדי לספק רקע מנוגד להדגשת רצועות DNA (איור 2).
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) משמשת להגברת ה- DNA, ומאפשרת מגוון רחב של בדיקות מעבדת DNA. תחום אחד של בדיקות אפשרי עכשיו עם PCR הוא לזהות הנדסה גנטית על ידי בדיקה לנוכחות או היעדר רצפי DNA המשמשים בשינוי הגנטי של גידולי מזון. בדרך כלל, יבול מהונדס גנטית כדי להעניק יתרון נגד הרתעה טבעית לתפוקות אידיאליות, למשל מזיקים (איור 3),מחלות, תנאי בצורת(איור 4)וכו '. מכיוון שהיתרון הוא על ידי החדרת חומר גנטי ממין אחר לדנ"א של צמח היבול עצמו, זוהו סיכונים פוטנציאליים לבריאות האדם ולסביבה עם הש...
Chapters in this video
0:00
Overview
1:41
Principles of Identifying Genetically Modified Foods using PCR
4:44
Extraction of DNA from Food Samples
6:35
Setting up PCR
7:30
Electrophoresis of PCR Products
9:07
Results
10:10
Applications
12:15
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved