בתחילת המאה ה-20, בקטריולוג בריטי בשם פרדריק גריפית' עבד עם החיידק הגורם לדלקת ריאות Streptococcus pneumoniae. הוא ביצע ניסוי פשוט באמצעות שני זנים שונים. זן אחד ידוע בשם זן S בגלל כמוסת מגן שגורמת למושבות או לגושים שהוא יוצר להיראות חלקים, וגם הופכת אותו לאלים או מזיק. השני היה זן R, גרסה של החיידק חסר את קפסולת המגן, נותן למושבות מראה מחוספס והופך אותו ללא אלים.
ראשית, גריפית' לקח חלק מהחיידקים מזן S וחימם אותם, ויצר גרסה מומתת חום של זן S. לאחר מכן, הוא אסף כמה עכברים וחילק אותם לארבע קבוצות. הוא הזריק לקבוצה הראשונה את זן ה-S האלים, ואת השנייה את זן ה-R הלא-אלים. הוא נתן לקבוצה השלישית את זן ה-S שנהרג בחום, ולבסוף שילב את זן ה-S שנהרג בחום ואת זן ה-R יחד, והזריק את התערובת הזו לקבוצה הרביעית. כצפוי, העכברים בקבוצה הראשונה מתו, ואלה בקבוצה השנייה והשלישית חיו. אבל להפתעתו של גריפית', גם העכברים בקבוצה האחרונה מתו.
כאשר הוא פרסם את המחקר שלו בשנת 1928, הוא כינה את התהליך הזה טרנספורמציה מסתורית, כפי שהוא שיער את נוכחותו של עיקרון טרנספורמציה בסיסי, אשר איפשר לזן שלא היה אלים בעבר להפוך קטלני. מאוחר יותר, בשנת 1943, אברט, מקלאוד ומקארתי דיווחו כי עיקרון טרנספורמציה זה היה ככל הנראה חומצה דסוקסיריבונוקלאית, או דנ"א, שאנו יודעים כיום שהוא חומר התורשה. למעשה, מה שקרה בניסוי של גריפית' היה שכאשר החיידקים התאחדו, חלק מהדנ"א דלף מזן S שהומת בחום לתוך תאי זן R, הפך את החיידקים הלא אלימים האלה והעביר את המידע כדי ליצור את קפסולת המגן, מה שהפך את זן R לאלים, שכעת מסוגל להרוג את החיות בקבוצה הרביעית.
מדענים פיתחו דרך פשוטה הרבה יותר לחקור טרנספורמציה חיידקית, באמצעות חיידקי E. coli ולולאות קטנות ועגולות של דנ"א שנקראות פלסמידים. בדרך כלל, הפלסמיד המשמש בניסויי טרנספורמציה כולל גן לתפקיד מיוחד, כמו עמידות לאנטיביוטיקה. E. coli הם נושא מצוין לשינוי כי הם יכולים להציג תכונה הנקראת יכולת, היכולת לקחת DNA מהסביבה. בעיקרו של דבר, משמעות הדבר היא שבתנאים סביבתיים מסוימים, כמו כימיקל או שוק חשמלי או חום, דופן התא של E. coli יכולה להיות חדירה באופן זמני ולאפשר ספיגה של DNA מהסביבה. ברגע שהפלסמיד נמצא בתוך האי-קולי, הוא יכול להסתובב בציטופלסמה של התא המארח החדש שלו ולשכפל ולהתבטא לאורך דורות לצד הגנום, או שהוא עשוי לשלב את עצמו במלואו בגנום של הפונדקאי. אם החיידק יאבד את הפלסמיד בשלב כלשהו, התא יאבד גם את עמידותו לאנטיביוטיקה, ולכן מדענים מגדלים את החיידקים במדיה המכילה את האנטיביוטיקה כדי להבטיח שהניצולים היחידים הם אלה המכילים את הפלסמיד המעניין.
במעבדה זו תלמדו כיצד להפוך תאי אי קולי עם פלסמיד המכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה, תוך תרגול טכניקות מיקרוביולוגיות סטריליות.
רקע
בתחילת המאהה-20, דלקת ריאות הייתה אחראית לחלק גדול ממקרי המוות ממחלות זיהומיות1. על מנת לפתח חיסון יעיל נגד דלקת ריאות, פרדריק גריפית יצא לחקור שני זנים שונים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס: זן לא אלים עם מראה מחוספס (זן R) וזן אלים עם מראה חלק (זן S) עקב קפסולת פוליסכריד חיצונית2. שכבה חיצונית זו של החיידקים מזן S אפשרה להם לעמוד בפני מערכת החיסון המארחת, מה שהוביל בסופו של דבר למחלה מסכנת חיים. כאשר גריפית' הזריק בנפרד לעכברים חיידקים מומתי חום משני הזנים, העכברים חיו. עם זאת, כאשר הוא הזריק לעכברים שילוב של זן S שנהרג בחום עם זן R חי, העכברים מתו2. כאשר הוא ניתח את הדגימות שהתקבלו מעכברים מתים שהוזרקו להם השילוב, הוא הבחין בנוכחות חיידקים חיים מזן S. בשנת 1928 ציין גריפית' כי חייב היה להתרחש תהליך "טרנספורמציה" כדי לשנות את החיידקים הלא אלימים לזן האלים. כתגלית הידועה הראשונה של טרנספורמציה חיידקית, תגליתו סללה את הדרך לפיתוח כלי חיוני בהנדסה גנטית - טרנספורמציה3.
טרנספורמציה היא השינוי הגנטי בתא עקב צריכת DNA מהסביבה. בניסוי של גריפית', הדנ"א המקודד את ציפוי הרב-סוכר המגן של החיידק מזן S לא התפרק מהלם החום והוכנס לזן R, מה שמאפשר לאחרון לעקוף את המערכת החיסונית של העכבר. בעוד תהליך זה מתרחש כל הזמן בטבע בין אורגניזמים ואפילו מינים שונים, מדענים משנים חיידקים בסביבות מעבדה למטרות מחקר4.
טרנספורמציה חיידקית באמצעות פלסמידים
חיידקים הם האורגניזמים האידיאליים לטרנספורמציה מכיוון שהם יכולים בקלות לקלוט חומר גנטי אקסוגני לתוך הגנום שלהם ולהגביר אותו במהירות3,5. יש להם כרומוזום מעגלי אחד ומספר חתיכות עגולות קטנות של דנ"א דו-גדילי הנקראות פלסמידים בתוך הציטופלסמה. פלסמידים אלה יכולים להשתכפל באופן עצמאי מה- DNA הכרומוזומלי ובדרך כלל מספקים יתרונות פונקציונליים מסוימים, כגון עמידות לאנטיביוטיקה6,7. בסביבתם הטבעית, חיידקים עוברים "טרנספורמציה חיידקית" על-ידי קליטת פלסמידים מחיידקים אחרים בתהליך שנקרא צימוד8. יתר על כן, כאשר הם מתרבים, כל אחד מצאצאיהם מקבל עותק של הפלסמיד החדש.
פלסמידים המשמשים למטרות ניסוי נקראים וקטורי פלסמיד. בתנאי מעבדה, מדענים יכולים ליצור באופן מלאכותי "פלסמידים רקומביננטיים" שאורכם כ-5,000-10,000 זוגות בסיסים על-ידי החדרת מקטעי דנ"א לווקטור פלסמיד. לפלסמידים רקומביננטיים אלה יש בדרך כלל מרכיבים מסוימים: מקור השכפול (ORI), גן עמידות לאנטיביוטיקה, אתר שיבוט מרובה, מקדם, סמן ברירה וגן המעניין. מקור השכפול הוא המקום שבו מתחיל השכפול. הגן לעמידות לאנטיביוטיקה מאפשר לחיידקים שקולטים את הפלסמיד לשרוד על צלחות בנוכחות תרופה אנטיביוטית מסוימת. אף על פי שפלסמידים הם פיסות דנ"א קטנות יחסית, מדענים צריכים לטפל בתאים המארחים כדי לאפשר את חדירת הפלסמיד דרך קרום התא. לפיכך, יעילות השינוי קשורה ישירות לנקבוביות של קרום המארח. גישה נפוצה אחת היא לחשמל בחום את החיידקים שטופלו בתמיסת סידן כלורי9. החיידקים שאינם משלבים את הפלסמיד לא ישתנו, ולכן אין להם התנגדות לשרוד על הצלחת ולהיות גלויים. אתרי השיבוט המרובים מסייעים בהחדרת DNA על ידי הכלת אתרים לאנזימי הגבלה לחיתוך הפלסמיד שבו ניתן להחדיר ולקשור את הגן המעניין. המקדם מניע שעתוק של הגן המעניין. הוא מתויג על ידי סמן, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), או יכול להיות גן נוסף עמידות לאנטיביוטיקה. גן העמידות לאנטיביוטיקה וסמני הבחירה האחרים עוזרים לנו לקבוע אם החיידקים שנאספו מכילים את הפלסמיד המעניין.
יישומים
שיטות טרנספורמציה יעילות אפשרו למדענים לבודד וליצור פרופיל של גנים ותוצרי גנים והובילו לפיתוחים רבים במדעי החיים וברפואה, כגון פיתוח תרופות יעילות, יצירת גידולים מהונדסים גנטית וכלי אבחון מתקדמים10. בנוסף, עם ההתקדמות הטכנולוגית, שיטות חדשות של טרנספורמציה התפתחו. לדוגמה, שיבוט שער מאפשר החדרה של מקטעי דנ"א מרובים לווקטורים שונים וכן העברת רצפי DNA בין פלסמידים11. יתר על כן, Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 היא טכניקת עריכת גנים המשנה ישירות נוקלאוטידים בגנום ואינה דורשת שימוש בפלסמידים12. לאחר הטרנספורמציה, חוקרים לעתים קרובות מבודדים ופרופיל את הגן המעניין ואת תוצריו. לאחר מכן, כל תהליך השיבוט הגנטי פתח תחום חדש של מניפולציה גנטית. הודות לשיבוט גנטי, חוקרים יכולים לתמרן חיידקים כדי לייצר כמויות גדולות של חלבונים אנושיים ספציפיים, כגון אינסולין לטיפול בחולי סוכרת10. לשיבוט יש חשיבות רבה גם בחקלאות המודרנית. אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO) הם תוצאה ישירה של שיבוט גנטי וטרנספורמציה חיידקית10. לדוגמה, מדענים פועלים ליצירת יבולים מהונדסים גנטית עם גנים מקבעי חנקן המשולבים בגנום שלהם כדי להגביר את ייצור המזון ולהפחית את השימוש בדשנים, ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית והסביבתית של דשנים13. לסיכום, טרנספורמציה חיידקית היא הצעד הראשון של הביוטכנולוגיה המודרנית והבסיס לתגליות מחקר עתידיות.
הפניות
- GL, ארמסטרונג, לוס אנג'לס, קון ו-RW, פינר. מגמות בתמותה ממחלות זיהומיות בארצות הברית במהלך המאה ה-20. ג'אמה. 1999, כרך 281, 1 (61-66).
- פ, גריפית. המשמעות של סוגי פנאומוקוק. J Hyg (לונד). . 1928 , 2 (113-59).
- לורנץ, MG ו Wackernagel, F. העברת גנים חיידקיים על ידי טרנספורמציה גנטית טבעית בסביבה. מיקרוביול Rev. . 1994 ספטמבר;, כרך 58, 3: (563-602).
- S, Domingues, et al. טרנספורמציה טבעית מאפשרת העברה של טרנספוזונים, אינטגרונים וקלטות גנים בין מיני חיידקים. PLOS פתוגנים. 2012, 8(8): E1002837.
- דובנאו, ד. ספיגת דנ"א בחיידקים. Annu Rev Microbiol. . 1999, 53: (217-44).
- Solar, G del, et al. שכפול ובקרה של פלסמידים חיידקיים מעגליים. Microbiol מול Biol Rev. . 1998 , כרך 62, 2: (434-64).
- בנט, רה"מ. עמידות לאנטיביוטיקה מקודדת פלסמיד: רכישה והעברה של גנים לעמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. בר ג'יי פארמקול. . 2008 , כרך 153, S1: (S347-S357).
- MLlosa, et al. צימוד חיידקים: מנגנון דו-שלבי להעברת DNA. מול מיקרוביול. 2002 יולי;, כרך 45, 1: (1-8).
- Roychoudhury, A, Basu, S ו Sengupta, DN. ניתוח יעילות השוואתית של שיטות טרנספורמציה שונות של E. coli באמצעות שני וקטורי פלסמיד נפוצים. הודי J Biochem Biophys. . 2009 , כרך 46, 5: (395-400).
- חאן, S, et al. תפקידה של טכנולוגיית DNA רקומביננטי לשיפור החיים. I. nt J Genomics. . . 2016, 2016:2405954.
- מרשישקי, ג ולבר, י. נתיבים רבים לשיבוטים רבים: מבט השוואתי על שיטות שיבוט בתפוקה גבוהה. גנום מיל' 2004, כרך 14, 2020-28.
- דאודנה, JA ו Charpentie, E. החזית החדשה של הנדסת גנום עם CRISPR-Cas9. מדע. 2014, כרך 346, 6213-1258096.
- טוב, א. לכיוון צמחים מקבעי חנקן. מדע. 2018, כרך 359, 6378: 869-70.
בתחילת המאה ה-20, בקטריולוג בריטי בשם פרדריק גריפית' עבד עם החיידק הגורם לדלקת ריאות Streptococcus pneumoniae. הוא ביצע ניסוי פשוט באמצעות שני זנים שונים. זן אחד ידוע בשם זן S בגלל כמוסת מגן שגורמת למושבות או לגושים שהוא יוצר להיראות חלקים, וגם הופכת אותו לאלים או מזיק. השני היה זן R, גרסה של החיידק חסר את קפסולת המגן, נותן למושבות מראה מחוספס והופך אותו ללא אלים.
ראשית, גריפית' לקח חלק מהחיידקים מזן S וחימם אותם, ויצר גרסה מומתת חום של זן S. לאחר מכן, הוא אסף כמה עכברים וחילק אותם לארבע קבוצות. הוא הזריק לקבוצה הראשונה את זן ה-S האלים, ואת השנייה את זן ה-R הלא-אלים. הוא נתן לקבוצה השלישית את זן ה-S שנהרג בחום, ולבסוף שילב את זן ה-S שנהרג בחום ואת זן ה-R יחד, והזריק את התערובת הזו לקבוצה הרביעית. כצפוי, העכברים בקבוצה הראשונה מתו, ואלה בקבוצה השנייה והשלישית חיו. אבל להפתעתו של גריפית', גם העכברים בקבוצה האחרונה מתו.
כאשר הוא פרסם את המחקר שלו בשנת 1928, הוא כינה את התהליך הזה טרנספורמציה מסתורית, כפי שהוא שיער את נוכחותו של עיקרון טרנספורמציה בסיסי, אשר איפשר לזן שלא היה אלים בעבר להפוך קטלני. מאוחר יותר, בשנת 1943, אברט, מקלאוד ומקארתי דיווחו כי עיקרון טרנספורמציה זה היה ככל הנראה חומצה דסוקסיריבונוקלאית, או דנ"א, שאנו יודעים כיום שהוא חומר התורשה. למעשה, מה שקרה בניסוי של גריפית' היה שכאשר החיידקים התאחדו, חלק מהדנ"א דלף מזן S שהומת בחום לתוך תאי זן R, הפך את החיידקים הלא אלימים האלה והעביר את המידע כדי ליצור את קפסולת המגן, מה שהפך את זן R לאלים, שכעת מסוגל להרוג את החיות בקבוצה הרביעית.
מדענים פיתחו דרך פשוטה הרבה יותר לחקור טרנספורמציה חיידקית, באמצעות חיידקי E. coli ולולאות קטנות ועגולות של דנ"א שנקראות פלסמידים. בדרך כלל, הפלסמיד המשמש בניסויי טרנספורמציה כולל גן לתפקיד מיוחד, כמו עמידות לאנטיביוטיקה. E. coli הם נושא מצוין לשינוי כי הם יכולים להציג תכונה הנקראת יכולת, היכולת לקחת DNA מהסביבה. בעיקרו של דבר, משמעות הדבר היא שבתנאים סביבתיים מסוימים, כמו כימיקל או שוק חשמלי או חום, דופן התא של E. coli יכולה להיות חדירה באופן זמני ולאפשר ספיגה של DNA מהסביבה. ברגע שהפלסמיד נמצא בתוך האי-קולי, הוא יכול להסתובב בציטופלסמה של התא המארח החדש שלו ולשכפל ולהתבטא לאורך דורות לצד הגנום, או שהוא עשוי לשלב את עצמו במלואו בגנום של הפונדקאי. אם החיידק יאבד את הפלסמיד בשלב כלשהו, התא יאבד גם את עמידותו לאנטיביוטיקה, ולכן מדענים מגדלים את החיידקים במדיה המכילה את האנטיביוטיקה כדי להבטיח שהניצולים היחידים הם אלה המכילים את הפלסמיד המעניין.
במעבדה זו תלמדו כיצד להפוך תאי אי קולי עם פלסמיד המכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה, תוך תרגול טכניקות מיקרוביולוגיות סטריליות.
בתחילת המאה ה-20, בקטריולוג בריטי בשם פרדריק גריפית' עבד עם החיידק הגורם לדלקת ריאות Streptococcus pneumoniae. הוא ביצע ניסוי פשוט באמצעות שני זנים שונים. זן אחד ידוע בשם זן S בגלל כמוסת מגן שגורמת למושבות או לגושים שהוא יוצר להיראות חלקים, וגם הופכת אותו לאלים או מזיק. השני היה זן R, גרסה של החיידק חסר את קפסולת המגן, נותן למושבות מראה מחוספס והופך אותו ללא אלים.
ראשית, גריפית' לקח חלק מהחיידקים מזן S וחימם אותם, ויצר גרסה מומתת חום של זן S. לאחר מכן, הוא אסף כמה עכברים וחילק אותם לארבע קבוצות. הוא הזריק לקבוצה הראשונה את זן ה-S האלים, ואת השנייה את זן ה-R הלא-אלים. הוא נתן לקבוצה השלישית את זן ה-S שנהרג בחום, ולבסוף שילב את זן ה-S שנהרג בחום ואת זן ה-R יחד, והזריק את התערובת הזו לקבוצה הרביעית. כצפוי, העכברים בקבוצה הראשונה מתו, ואלה בקבוצה השנייה והשלישית חיו. אבל להפתעתו של גריפית', גם העכברים בקבוצה האחרונה מתו.
כאשר הוא פרסם את המחקר שלו בשנת 1928, הוא כינה את התהליך הזה טרנספורמציה מסתורית, כפי שהוא שיער את נוכחותו של עיקרון טרנספורמציה בסיסי, אשר איפשר לזן שלא היה אלים בעבר להפוך קטלני. מאוחר יותר, בשנת 1943, אברט, מקלאוד ומקארתי דיווחו כי עיקרון טרנספורמציה זה היה ככל הנראה חומצה דסוקסיריבונוקלאית, או דנ"א, שאנו יודעים כיום שהוא חומר התורשה. למעשה, מה שקרה בניסוי של גריפית' היה שכאשר החיידקים התאחדו, חלק מהדנ"א דלף מזן S שהומת בחום לתוך תאי זן R, הפך את החיידקים הלא אלימים האלה והעביר את המידע כדי ליצור את קפסולת המגן, מה שהפך את זן R לאלים, שכעת מסוגל להרוג את החיות בקבוצה הרביעית.
מדענים פיתחו דרך פשוטה הרבה יותר לחקור טרנספורמציה חיידקית, באמצעות חיידקי E. coli ולולאות קטנות ועגולות של דנ"א שנקראות פלסמידים. בדרך כלל, הפלסמיד המשמש בניסויי טרנספורמציה כולל גן לתפקיד מיוחד, כמו עמידות לאנטיביוטיקה. E. coli הם נושא מצוין לשינוי כי הם יכולים להציג תכונה הנקראת יכולת, היכולת לקחת DNA מהסביבה. בעיקרו של דבר, משמעות הדבר היא שבתנאים סביבתיים מסוימים, כמו כימיקל או שוק חשמלי או חום, דופן התא של E. coli יכולה להיות חדירה באופן זמני ולאפשר ספיגה של DNA מהסביבה. ברגע שהפלסמיד נמצא בתוך האי-קולי, הוא יכול להסתובב בציטופלסמה של התא המארח החדש שלו ולשכפל ולהתבטא לאורך דורות לצד הגנום, או שהוא עשוי לשלב את עצמו במלואו בגנום של הפונדקאי. אם החיידק יאבד את הפלסמיד בשלב כלשהו, התא יאבד גם את עמידותו לאנטיביוטיקה, ולכן מדענים מגדלים את החיידקים במדיה המכילה את האנטיביוטיקה כדי להבטיח שהניצולים היחידים הם אלה המכילים את הפלסמיד המעניין.
במעבדה זו תלמדו כיצד להפוך תאי אי קולי עם פלסמיד המכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה, תוך תרגול טכניקות מיקרוביולוגיות סטריליות.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved