Name: בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למדו לבודד תאי אנדותל לימפטיים אנושיים בטוהר גבוה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי רב-פרמטרי. שיטה זו מאפשרת חקר מחלות לימפטיות והרחבת התאים לניתוחים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר בקרן בייקר ו&#39;הנשים במדע המלגה &quot;קרן הילדים מלכותי תמיכה של Zerina Lokmic. אנדרו ג &#39;Elefanty ואדוארד ג&#39; סטנלי הם NHMRC עמיתי מחקר בכיר. עבודה במעבדותיהם נתמכה על ידי NHMRC ותאי גזע אוסטרליה.

הצהרת אתיקה: אישור אתי לאיסוף רקמות מום ועורלת הלימפה התקבלה מועדות האתיקה מחקר האדם בבית החולים מלכותי לילדים, מלבורן, אוסטרליה. הסכמה חתומה התקבלה מההורים של החולים לפני הניתוח. דגימות רקמה נאספו מחולים שאובחנו עם LMS עובר ניתוחים כחלק מהניהול הקליני שלהם וחולים שעבר ברית מילה בחירה. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של הבריאות הלאומית ומועצה למחקר רפואי, אוסטרליה. 1. הכנת תרחיף תא מהעורלה והלימפה מומים רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגרים ומדיה הכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תא האנדותל מלאה באמצעות ערכת Bullet זמינה מסחרי EGM-2 MV ידי התחממות EGM-2 תקשורת ועדינות הפשרת רכיבי הערכה 37 ° C אמבט מים. בכיתה השנייה קבינט בטיחות ביולוגית, סביבה נקיה מחיידקיםלהוסיף כל רכיב לEGM-2 התקשורת. לאחר שכל הרכיבים נוספים לתקשורת, מתייחס לזה כאמצעי תקשורת &quot;תקשורת תא האנדותל מלאה &#39;. השתמש פיפטה 50 מיליליטר סטרילי לערבב את התוכן לפני השימוש. הערה: כל הצעדים הנוגעים לתרבות תא מבוצעים בקבינט Biohazard בכיתה השני. כל הפתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות יצרנים והם חיממו לטמפרטורת חדר לפני השימוש. התקשורת המלאה אנדותל התא, מאגרי תרבית תאים ופתרונות אנזים הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים תקשורת תא אנדותל להשלים עם 50 VEGF-C ng / ml. Aliquot תקשורת תא האנדותל בתוספת לצינורות 50 מיליליטר וחנות סטרילי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. התקשורת היא יציבה לפחות 4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סידן ופוספט שנאגרו מלוח חופשי מגנזיום (PBS) על ידי המסת 8.752 גרם NaCl, 1.416 גרם Na 2 HPO 4 .2H 2 O ו.395 גרם KH 2 PO 4 ב1,000 מיליליטר של מים. התאם ל- pH 7.4. סנן לעקר PBS באמצעות 0.22 מיקרומטר לסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש להוסיף פתרון אנטיביוטי / antimycotic (ששמש בשעה 1: 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פיברונקטין אדם, לפזר 1 מ&quot;ג של פיברונקטין ב 10 מיליליטר של מים סטריליים. חנות מחדש פתרון ב100 aliquots μl ב -20 ° C. ביום שימוש להוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילי של aliquot פיברונקטין 100 μl (לתת ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקשורת האנזים, להכין תמיסה המכילה 0.04% Dispase השני, 0.25% Collagenase השני ו0.01% DNase אני בPBS סטרילי. ראשית, לשקול dispase וcollagenase, מקום בצינור 50 מיליליטר סטרילי, להוסיף הנפח הנדרש של PBS ודגירה למשך 30 דקות עם רעד על 37 מעלות צלזיוס לפזר. ברגע שהתפרק, סנן לעקר (0.22 מיקרומטר מסנן) פתרון dispase / collagenase במכסת מנוע בטיחות ביולוגית. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף I. חנות DNase הפתרון האנזימטית על 37 מעלות צלזיוס עדלהשתמש. הערה: אני DNase הוא מגיב כיתה מסחרית תרבית תאים זמינה כאבקת lyophilized סטרילי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת תרחיף תא ממומי עורלה והלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל שפופרת 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של / 2% פתרון antimycotic אנטיביוטיקה DMEM. צינור זה ישמש לאיסוף רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרה כירורגית של מום הלימפה ורקמות עורלה, סביבה נקיה מחיידקים להוסיף דגימת רקמה לצינור וההעברה על קרח למעבדה תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינור המכיל את הרקמה ולחשב את משקל רקמה. השתמש במשקל זה כדי לחשב את הנפח של הפתרון האנזימטית הדרוש כדי לעכל את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית Class II, להשתמש במלקחיים סטרילי להעביר את הרקמה ותקשורת לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ&quot;מ. השתמש במספרי סטרילי כדי לרכך את הרקמה ל~ 1 מ&quot;מ 3 חתיכות דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה טחונות העברה מעורבבת עם i תקשורתn כדי שפופרת 50 מיליליטר המכילה תוספת של 10 מיליליטר של תמיסה סטרילית DMEM / 2% לאנטיביוטיקה antimycotic. מערבבים על ידי היפוך מחדש להשעות את הרקמה. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. בהתבסס על משקל רקמה, להוסיף 1 מיליליטר של collagenase המחומם מראש (37 ° C) II / פתרון עיכול DNase I / II Dispase לרקמה טחון 100 מ&quot;ג. בדרך כלל, להשתמש 10 מיליליטר של תמיסת אנזים לכ 1 גרם של רקמה טחונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות בחממה 37 ° C דקות 20-90 עם קבועים רועד ב 200 סל&quot;ד. בתום תקופה זו, להבטיח כי כמעט כל הרקמה מתעכלת לרסיסים בסדר. הערה: חשיפה של התאים לcollagenase וdispase בעת הבידוד מהישרדות תא השפעות רקמות העיקריות. מצאנו באופן אמפירי שרוב דגימות עורלה בילוד בצורה אופטימלית דורשות 20-30 דקות של עיכול, ואילו דגימות מום הלימפה fibrotic עשויות לדרוש 60-90 דקות של עיכול. תשואת הבקר LMשל מושפעים מכמות סיסטיק הנוכחי, רקמה סיבית יותר מניב פחות תאים, אולי בשל השפעות מזיקות של חשיפה ממושכת לcollagenase השני וdispase השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עיכול, להעביר את הצינור לארון הבטיחות הביולוגית ולהעביר את פתרון הרקמה מתעכל דרך מסננת 70 מיקרומטר להציב לתוך שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. שימוש בבוכנת מזרק 3 מיליליטר עם בוכנת גומי, לטחון את הרקמה שנותרה עד שרק עקבות קטנות של מטריקס הם נצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מסננת התא עם נפח שווה ערך בינוני תא האנדותל להיקף מתנער בינוני אנזים להתאושש תאים נדבקו למסננת וכדי להשבית את האנזימים. לדוגמא, עבור 2 מיליליטר של חוצן בינוני אנזים לעכל את הרקמה הטחון, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום תא האנדותל כדי להשבית את האנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון התא XG ב 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. &gt; R דואר להשעות את התאים ב 10 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 3005 דקות, להסיר את supernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא פעמיים. &gt; Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. ספירת תאים באמצעות כחול אז זרע trypan 2 x 10&gt; 6 תאים ב150 סנטימטר&gt; 2 בקבוק מראש מצופה פיברונקטין בנפח סופי של 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. תרבות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO&gt; 2 בחממת אוויר humidified.&gt; הערה: צפוי כי 75% -90% מתאי בעלי הגרעין לשרוד עיכול רקמה כפי שהוערכו על ידי הרחקת trypan הכחולה. ספירת התאים הראשונית משקפת תאים כל גרעין בהשעית התא (כלומר קרטינוציטים, לויקוציטים, מקרופאגים, תאי רקמת חיבור ותאי כלי דם). ספירת התאים ב5-7 ימים משקפת תאים שצורפו, שרדו והתרבו במהלך תרבית תאים. ציפוי צלוחיות תרבית רקמה עם פיברונקטין גם משפר את הבקר הבא והישרדות LM הבקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, לשטוף תאים משם מאוגד בשלושה שוטף עם P/ 1% פתרון BS אנטיביוטיקה antimycotic ולהוסיף בינוני תא האנדותל טרי. לבצע שלושה שוטף כדי להסיר ביעילות תאים מאוגד ותאי דם אדומים הנמצאים בבקבוק. שינוי תקשורת בכל יום שני. תאים יהיו ~ 80% ומחוברות לאחר 5-7 ימים. </li></ol> 3. נוגדן צביעת תאים למשטח סמני תא האנדותל הלימפה לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתאים הגיעו מפגש 80%, בינוני לשאוב ותאי שטיפה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים חסיד ידי דוגרים תאים עם 7 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא כגון Accutase לבקבוק 150 סנטימטר 2 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים מנותקים, להשבית את פתרון ניתוק תא על ידי הוספת 3 כרכים של מדיום תא האנדותל ולהעביר את ההשעיה תא צינור סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר את יםupernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא. מחדש להשעות את התאים ב 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר תאי קיימא. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 90 μl של 0.4% trypan כחולים. ההעברה 10 μl של השעיה זו לhemocytometer לספירה. הערה: תשואת התא הסופית תהיה תלויה בגודל מדגם מעובד. התשואה הרגילה התא לטווחים של 150 סנטימטר 2 בקבוק מ7 x 10 5-1.2 x 10 6 תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות נוגדן למכתים תא. הערה: דילולים הבאים טיטרציה למכתימים 1 x 10 6 בצביעת נפח של 100 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר לדלל PE מצומדות VEGFR-3 אדם אנטי (01:50); CD34 PE-Cy7 העכבר מצומדות אנטי האנושי מצומדות (1: 200); CD31 APC-מצומדות עכבר אנטי אנושי (1: 100) וAlexa אדם אנטי עכברוש 488 מצומדות- PODOPLANIN (1: 200) בהיקף כולל של 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה רקמה. בעקבות הכנתפתרון נוגדן, לשמור על קרח עד לשימוש. כמו כן להכין תערובת נוגדני שליטת אלוטיפ מדוללת כדי להקל על הגדרה של זרימת cytometry שערים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית ספציפי מחייב של הנוגדנים, תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות, להסיר supernatant אז להשעות את התאים 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה להיות מוכתם. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר supernatant אז מחדש להשעות תאים בקוקטייל הנוגדנים מצומדות. גם להכתים aliquot קטן יותר של תאים (1 x 10 5) בתערובת נוגדני שליטת אלוטיפ 100 μl. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הנוגדן מאוגד, להוסיף 2 מיליליטר של 2% FBS / פתרון PBS ו צנטריפוגות התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וחזור לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה לשליטה אלוטיפ ומדגם הנוגדן מוכתם להיות מסודר ב300 μl של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר propidium iodide / 2% FBS פתרון / PBS. מניחים צינורות על קרח עד מיון. </li></ol> 4. מיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחומרים הבאים כדי להגדיר את המכשיר; חרוזים יישור כגון חלקיקים זמינים מסחרי ניאון, נוזל נדן מלוח מבוסס פוספט וחרוזים עיכוב ירידה, כגון חרוזי ניאון Accudrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את LECs האנושי המטוהר במכשיר סלולארי מיון הקרינה המופעל רב פרמטר. להגדיר את המכשיר וליישר לפי המלצות יצרן. בנוסף, להפעיל פקדי פיצוי כתם יחידים עם כל סוג כדי ליצור את מטריצת פיצויים ובכך לחסל את הדימום משמעותי בפליטה של ​​fluorochromes כגון PE לערוץ PE-סי. הערה: שיעור גבוה יותר של FACS מיון תאים לשרוד הבידוד אם נחיר 100 מיקרומטר משמש ותאים מסודרים לתוך מדיום תא האנדותל. </li></ol> 5. תא מיין תרבות ההודעה FACSING <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות, תאי צנטריפוגה מיון ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וresuspend התאים 5-10 מיליליטר של תקשורת (תלוי בבקבוק המשמש לזרע התא). אם פחות מ -50,000 תאים מסודרים, התאים בתרבית פיברונקטין מצופה 25 סנטימטר 2 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרת תרבות התאים בבקבוק 2 מצופה פיברונקטין 75 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified אוויר CO 2,. שינוי תקשורת לאחר 2 ימים. הערה: תקשורת נייד משתנה בכל יום שני כי הארכת הזמן בין שינויי תקשורת מופיעה להעדיף הישרדות של התאים הלא-אנדותל. אנו לאמת את הפנוטיפ תא האנדותל הלימפה באמצעות זיהוי immunohistochemical של סמנים: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 וCD31 כאשר התאים פיצול ראשון להרחבה נוספת 15. </li></ol>

<ol><li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+specialized+junctions+between+endothelial+cells+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels.</a> J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).</li>
<li>Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+button-like+junctions+in+the+endothelium+of+airway+lymphatics+in+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).</li>
<li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+physiology+of+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li>
<li>Witte, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function+relationships+in+the+lymphatic+system+and+implications+for+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology.</a> Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).</li>
<li>Andrade, M., Jacomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+human+lymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the human lymphatic system.</a> Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).</li>
<li>Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Cotran+Pathologic+Basis+of+Disease.+43-78%22">Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78</a>. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).</li>
<li>Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+cancer+metastasis%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps.</a> Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Mulliken+%26+Young%27s+Vascular+Anomalies+Hemangiomas+and%22">Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and</a>. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Mulliken+%26+Young%27s+Vascular+Anomalies+Hemangiomas%22">Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas</a>. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).</li>
<li>Bellini, C., Hennekam, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+disorders+of+primary+malfunctioning+of+the+lymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).</li>
<li>Schook, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+lymphedema%3A+clinical+features+and+management+in+138+pediatric+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).</li>
<li>Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+lymphatic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetics of lymphatic anomalies.</a> J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((for+the+Study+of+Vascular+Anomalies+%28ISSVA%29+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Available+from%3A+http%3A%2F%2Fwww.issva.org%2Fclassification.com%22%5BJournal%5D)">for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification.</a> Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).</li>
<li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposiform+lymphangiomatosis%3A+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+malformation+endothelial+cells%2C+their+in+vitro+characterization+and+in+vivo+survival+in+a+mouse+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model.</a> Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).</li>
<li>Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).</li>
<li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+histologic+features+and+immunohistochemical+staining+in+microcystic+and+macrocystic+lymphatic+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).</li>
<li>Norgall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+VEGFR-3+in+lymphatic+endothelial+cells+from+lymphangiomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas.</a> BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).</li>
<li>Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Part+I.+J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Vascular malformations.</a> Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).</li>
<li>Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).</li>
<li>Baluk, P., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+microscopic+imaging+of+lymphangiogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).</li>
<li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+microcirculation.+Tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering the microcirculation. Tissue engineering.</a> Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).</li>
<li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+and+stereological+assessment+of+blood+and+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels.</a> Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).</li>
<li>Hagerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).</li>
<li>Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+lymphatic+vessel+development%2C+growth%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
<li>Kaipainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+fms-like+tyrosine+kinase+4+gene+becomes+restricted+to+lymphatic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).</li>
<li>Schacht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T1alpha%2Fpodoplanin+deficiency+disrupts+normal+lymphatic+vasculature+formation+and+causes+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema.</a> EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).</li>
<li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).</li>
<li>Florez-Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+D2-40+and+LYVE-1+immunostaiing+in+lymphatic+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations.</a> Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).</li>
<li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).</li>
<li>Connell, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

LECs לשחק תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס נוזל, תגובה חיסונית לאנטיגנים זרים וקליטה והובלה של כמה חומרים מזינים. הומאוסטזיס הבקר יכול להיות מושפע מתהליכי מחלה כגון זיהומים חיידקיים וגרורות סרטניים, אך LECs יכול גם לפתח מוטציות סומטיות שתגרומנה להיווצרותם של כלי הלימפה לא מתפקדים ותחלואה משמעותית עבור חולים מושפעים. כדי להשיג יותר הבנה של אטיולוגיה מום הלימפה דרך השתלת in vivo וניסויים vivo לשעבר, ולגלות אפשרויות טיפול חדשות, שפותחנו לראשונה שיטת בידוד הבקר מבוסס ...

תפקידה העיקרי של מערכת הלימפה וכלי הדם הוא לקלוט הלימפה, נוזל ביניים עודף המכיל שומנים, חלבונים ומרכיבים תאיים, ולנהל אותו למערכת ורידי דם. רשת של נימי הלימפה מכוונת לימפה לבלוטות הלימפה שבו הוא הוקרן לנוכחות של אנטיגנים זרים, תהליך חשוב במעקב ופריסה של תאי דם לבנים לנטרל אנטיגנים זרים חיסוניים. מערכת הלימפה חד כיוונית מתחילה ברקמות עם נימי הלימפה הראשוניות, מבנה ייחודי עם שכבה אחת רציפה של תאי האנדותל שטוח מוקף חומה דקות עם צמתים תא מיוחדים המאפשרים כניסה לימפה 1,2. נימים אלה מחוברות מטריצת רקמת חיבור השכנה באמצעות עיגון חוטים כדי למנוע קריסת ספינה בנוכחות של לחץ מוגבר ביניים 3. נימי הלימפה הראשוניות הריקות לאיסוף נימי הלימפהשלהתגבש לגדולים יותר כלי או ורידי הלימפה. בהשוואה ראשוני כלי נימי הלימפה, איסוף יש כלי הלימפה דפנות כולים עבים, שסתומים הלימפה לזווג ונארזים על ידי קרום מרתף רציף שבו כמה תאי שריר חלק מוטבעים 4. פתיחה מתואמת וסגירת שסתומי הלימפה והתכווצות של תאי שריר חלק מאפשרים זרימת הלימפה 3. בבני אדם, ורידי הלימפה מאזורים שונים בגוף מצטרפים לגזעי הלימפה המתמזגים ליצירת שתי צינוריות הלימפה: צינור החזה וצינור הלימפה תקין. צינור החזה מרוקן הלימפה מהצד השמאלי של הגוף ומהצד הימני מתחת לחזה בזמן הלימפה מתנקזת צינור הלימפה תקין מהזרוע הימנית וצד ימין של הראש, צוואר, בית החזה ו. שני צינורות הלימפה לנהל לתוך ורידי subclavian בצוואר 5. הפרעות של מערכת הלימפה מקובצים באופן כללי לרכשND מולדת (טבלה 1). דוגמאות לתנאים נרכשים הנן דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד ובצקת לימפתית משנית. דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד היא דלקת של כלי הלימפה עקב זיהום חיידקים. Lymphatics המושפעת להתרחב ולמלא עם תאי polymorphonuclear exudate מכיל. בעור, lymphatics אלה נראית כפסים אדומים, כואבים תת עורי לעתים קרובות מלווים בהגדלה של קשורים צומת הניקוז לימפה (בְּלוּטַת לְשַׁד) 6. בצקת לימפתית משנית נובעת כתוצאה מניזק או שיבוש לחסימת כלי שיט או בלוטה לימפה הלימפה. זה מוביל לנפיחות מתקדמת כרונית עקב הצטברות של דיסטלי לימפה לנזק או שיבוש הליכי. במדינות מפותחות, בצקת לימפתית משנית קשורה לרוב עם ממאירות בי גידולי גרורות להכשיל כלי הלימפה או בלוטות הלימפה אזוריות, או כתוצאה מטיפול אנטי-סרטני לאחר ההסרה כירורגית של בלוטות לימפה, סיסטיק הודעה הקרנה-וthrom פוסט-דלקתיbosis וצלקות 7. בחלקים אחרים של העולם, בצקת לימפתית משנית עשויה להיות משנית לחסימת הלימפה הנגרמת על ידי תולעים טפילים כגון bancrofti Wuchereria 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> הפרעות של מערכת כלי דם הלימפה </td></tr><tr><td> רכש </td><td colspan="3"> מולדים </td></tr><tr><td rowspan="3"> בְּלוּטַת לְשַׁד בצקת לימפתית משנית </td><td> עיקרי בצקת לימפתית 10 </td><td> הלימפה מומים סדירים 13 </td><td> הלימפה מומים הקשורים תסמונות 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> למשל Milroy תסמונת Meige תסמונת </td><td> פשוט: מומים הלימפה </td><td rowspan="2"> למשל Klippel-Tranaunay תסמונת הפארקים וובר תסמונת סטרג&#39;-וובר תסמונת </td></tr><tr><td> בשילוב: מומים נימים-הלימפה מום נימים-הלימפה-ורידים מום נימים-הלימפה-arteriovenous מום ורידים-arteriovenous נימים-הלימפה </td></tr></tbody></table> 1. השולחן של ההפרעות של מערכת כלי דם הלימפה. הפרעות מולדות של מערכת הלימפה כוללות בצקת לימפתית ראשונית (אידיופטית) חשבה שנגרם על ידי מוטציות גנטיות, lymphangiectasia וחריגות של 8,9 מערכת הלימפה. בצקת לימפתית ראשונית יכולה להיות לא סדירה שנגרמה ככל הנראה על ידי מוטציות דה נובו, או בירושה. הפרעות הלימפה יכולות גם להיות מבודדות או מהוות חלק מתסמונת כללית יותר 10. באוכלוסיית הילדים, 97% מהלימפההבצקת היא לא סדירה עם ליקויים במבנה כלי הלימפה הפוגעים בניקוז הלימפה אזורית 11. המחלה Milroy היא דוגמא לבצקת לימפתית העיקרית הנגרמת על ידי מוטציה בגן ניכר בלידה או מייד לאחר 12 VEGFR-3. למרות מצב משפחתי בעיקר, המחלה Milroy יכולה גם להיות מזוהה בתינוקות ללא היסטוריה של מחלות Milroy 32 משפחה. החומרה של כל בצקת לימפתית תלויה בכמות הייצור לימפה והיכולת להעביר לימפה בחזרה למחזור ורידי 6. בהתבסס על מצגת קלינית ובהתפשטות תאי אנדותל באתר, מומים של מערכת הלימפה מסווגות כגידולי הלימפה או מומים הלימפה 13. Kaposiform lymphangiomatosis היא דוגמא לגידול הבקר 14. מומים הלימפה הם חשבו להתעורר במהלך התפתחות עוברית ולגדול באופן יחסי לילד 15,16. רק לעתים רחוקות הם לסגת אבל יכולים מאהלרn ללא תסמינים עד טראומה או זיהום משקעים צמיחה מהירה שמובילה לסיבוכים קליניים. המבנה המסודר של רשת והולכה של הלימפה הלימפה מרקמות למחזור ורידים שתואר לעיל הוא מוטרד במומי הלימפה אשר מורכב של אוספים מקומיים של מבני פיברוזיס חריגים מלאים בנוזל הלימפה. אמנם אין עדות קלינית או ניסויים שכלי פיברוזיס אלה מחוברים לזרימת הלימפה או שהם מכילים שסתומים הלימפה פונקציונליים, זהות הלימפה שלהם אושר על ידי ביטוי של מגוון רחב של סמני תא הלימפה כגון PODOPLANIN, CD31, כלי הלימפה האנדותל קולט 1 (LYVE-1), חלבון homeobox פרוספרו 1 (PROX-1) וVEGFR-3 15,17,18. מבני פיברוזיס אלה יכולים להיות קטנים (microcystic) או גדול (macrocystic), אבל רוב המומים הלימפה מכילים הן microcystic ורכיבי macrocystic (איור 1) 16. לאחר ניתוח, Injection sclerotherapy ו / או גלי רדיו אבלציה המומים הלימפה לעתים קרובות מתרחשת שוב. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. מורפולוגיה של כלי הלימפה אנושי ומומי הלימפה. הלימפה אנושית רגילה () וכלי הלימפה מום (B ו- C) שכותרתו עם נוגדן לPODOPLANIN (תווית בצבע חום, חץ). כלי מום הלימפה אנושיים מאופיינים בהתרחבות ניכרת והבדלים ניכרים בגודל לומן. מבני פיברוזיס החריגים המקומיים אלה יכולים להיות קטן (ב) או גדול (macrocystic, #) (ג) (microcystic, *). רוב המומים הלימפה מכילים את שני מרכיבי microcystic וmacrocystic. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> &lt;/ P&gt; חוקרים אחדים הציעו שמומי הלימפה מייצגים הפרעה התפתחותית של כלי דם הלימפה שבאין לי LECs פוטנציאל צמיחה נורמלי אבל במקום לא הצליח להתחבר לזרימה הרגילה 19. עם זאת, מצאנו כי LECs LM להתרבות מהר יותר ועמיד יותר לאפופטוזיס מאשר עורלת 15 LECs מצביע על כך שיש פגם עיקרי בLECs LM. כאשר LECs LM מושתל במודל xenograft עכבר, הם יוצרים מבנים דמויים מומים הלימפה 15. זה תומך בהשערה כי מומים הלימפה עלולים להיגרם על ידי אחד או יותר מוטציות סומטיות שהמקורה בLECs LM במהלך התפתחות עוברית. ואכן, הדיווחים אחרונים זיהו מוטציה אחת כזו במקטע קטליטי p110α של phosphoinositide-3-קינאז גן (PIK3CA) 20. בהתחשב בהתקדמות טכנולוגית רצפי DNA, מוטציות רלוונטיות גולד להיות מזוהה בקלות רבה יותר בLECs LM המבודד, המנחה את המחקרים עתידיים של תנאים אלה. הבידוד של LECs קיימא יאפשר השוואות בין LECs נורמלי והרגיל במבחנים כגון הגירה, שגשוג, יכולת להרכיב צינור והישרדות בתגובה לזמינות חומרי מזון מופחת או סוכנים פרו-אפופטוטיים 15. LECs המבודד יאפשר לנו לבצע עוד ביטוי גני תא ספציפי ומחקרי proteomic, להתוות אוכלוסיות הבקר חדשות ולגלות סוכנים תרופתיים רומן מתאים לניהול קליני של מומים הלימפה. יש לנו שפורסם בעבר בשיטת בידוד הבקר המבוססת על הפרדה חרוז מגנטית של LECs מעורלה בילוד ומומי הלימפה 15. דיווחנו אסטרטגיה של הפרדת LECs הבריא וחולה מתאי האנדותל של כלי דם המבוססים על היעדר ביטוי CD34, ואחרי חשיפת חלק תא CD34 נג לסלקציה חיובית לCD31.עם זאת, שיטה זו הקשתה על ידי הנוכחות של תאי האנדותל אינו שייר. זה לא היה תלוי בהסרת עור לפני עיכול רקמת חיבור שלאחר מכן. מזהמים אלה בדרך כלל התרבו במהירות רבה יותר ובכך בסופו overgrew תרביות תאי אנדותל למרות ניסיונות שלאחר מכן לחזור על בידוד הבקר. ואכן, זיהום ראשוני של תאי האנדותל אינו נמוכים כמו 2% עד 5% היה מספיק כדי להכניע את אוכלוסיית הבקר 15. זה גרם לנו לבחון שיטת מיון תא מופעלת fluorescently כאופציה לשיפור תשואת תא הבקר וטהרה. בנוסף, השתמשנו רב פרמטר מיון כדי לשפר את הספציפיות של אוכלוסיות הבקר, הוספת VEGFR-3 וPODOPLANIN לסמני הבחירה לזהות CD34 VEGFR-3 LECs נמוך CD31 ממוצע ממוצע ממוצע PODOPLANIN. הרציונל לבחירת סמנים אלה היה מבוסס על הדיווחים כי בעוד לסה&quot;נ LECs וכלי דם דם האנדותלLLS יש סמנים פני תא משותף רבים כגון CD31, LECs להראות וריאציה פנוטיפי בביטוים של CD34, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמן תא שטח בהשוואה לתאי האנדותל של כלי דם דם 21-23. CD31 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני 130 kDa הידוע גם במולקולת הידבקות טסיות דם תא האנדותל 1 (PECAM-1). זה נחשב סמן תא פאן-אנדותל שכן הוא בא לידי הביטוי בכל הסוגים של כלי דם והלימפה 21,24,25. CD34 הוא 110-kDa גליקופרוטאין הטרנסממברני נוכחי על אבות היווצרות הדם ביותר ותאי גזע, תאי האנדותל של כלי דם וכלי הלימפה כמה 26. VEGFR-3, קולט לצמיחה של אנדותל כלי דם גורמי C ו- D, הוא בתחילה קיימים בורידים המתפתחים בעובר העכבר, אך בעקבות מפרט הלימפה מוסדר על ידי שעתוק גורמי HMG-תיבה הקשורים ל- ¥ * $ (SOX) -18, hicken ג o valbumin u pstreaשחקן עמ &#39;מ&#39; ו ranscription לא romoter 2 (COUPTF-השני) וPROX-1, VEGFR-3 ביטוי ורידים הולך לאיבוד והוא הופך להיות מוגבל לLECs העוברי 25,27. PODOPLANIN, קרום kDa 38 mucoprotein, יצוין ראשון בכלי הלימפה בכ עוברי יום 11 (~ E11.0) של התפתחות העוברית של עכבר 28 ותוך שהוא מתבטא בחריפות על ידי כלי הלימפה כלי דם, PODOPLANIN ביטוי על ידי האנדותל הלימפה macrocystic במומי הלימפה משתנה יותר 15. Cytometry זרימת ניסויים מראים כי לפחות חלק מתאי אנדותל CD34 הגבוה CD31 ממוצע להביע את סמן הלימפה PODOPLANIN 29. למרות הערכה שיטתית של מכתים LYVE-1 וPODOPLANIN במומי הלימפה אדם הראתה כי הן יעילות במכתימים האנדותל מום הלימפה 30, ברקמות נורמליות, LYVE-1 נמסר להיות מאוד נוכח בהלימפה הראשוניתהאנדותל נימים אבל מופחת ואפילו נעדרו בהאנדותל הלימפה איסוף 31. כמו המטרה שלנו היא לבודד את שני תאי האנדותל הלימפה הראשוניים ואיסוף שבחרנו שלא להשתמש LYVE-1 כחלק מהאסטרטגיה שלנו בחירת תא. לבסוף, ההחלטה להעסיק סמנים אלה הייתה מבוססת גם על הזמינות של נוגדנים המשמשות diagnostically לתיוג כלי הלימפה להדמיה מיקרוסקופית, תכונה שתאפשר קשר בין cytometry זרימה ומחקרי immunofluorescent. מאמר זה יתאר את שיטת עיכול רקמה, מכתים תא והגדרות FACS נדרשת לבידוד מוצלח של CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 LECs ממוצע PODOPLANIN ממוצע, כמו גם תאי האנדותל CD34 גבוהים CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע מעורלה ומום הלימפה רקמה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>11965-092</td><td>משמש לאיסוף דגימות רקמה מחדר הניתוח.</td></tr><tr><td>ערכת כדורים EGM-2 MV</td> ערכת כדורים <td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>EGM-2 MV מכילה 500 מ"ל של מדיה EBM-2 ו-EGF אנושי, הידרוקורטיזון, גנטמיצין (GA-1000), סרום בקר עוברי (FBS), VEGF, FGF-b אנושי, R3-IGF-1 וחומצה אסקורבית.</td></tr><tr><td>VEGF-C</td><td>מו"פ D Systems</td><td>2179-VC-025</td><td>מדיה תאית-אנדותל מלאה מתווספת עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית של 50 ננוגרם/מ"ל VEGF-C</td></tr><tr><td>(100x)</td> <td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15240-062</td><td>תמיסה זו מכילה 10,000&nbsp; U/ml של פניצילין, 10,000&nbsp; מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין ו-25&nbsp; מ"ג/מ"ל של Fungizone antimycotic. יש להשתמש בדילול של 1:100.</td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמה אנושית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>בשימוש בריכוזים של 10 מ"ג/מ"ל. ניתן לעשות בו שימוש חוזר עד חודש אחד אם הוא נשמר על 4&nbsp; &#176; C ונשמר סטרילי. השתמש ב-7&nbsp; מ"ל לציפוי 150 ס"מ2 בקבוק.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של</td><td>תאים Life Technologies (Gibco)</td> <td>A11105-01</td><td>StemPro&reg; Accutase&reg; משמש ב-0.05 מ"ל לס"מ2 כדי לכסות את כל שטח הפנים של הבקבוק. שימוש בנפחים קטנים יותר עלול לגרום לניתוק תאים לא שלם.</td></tr><tr><td>0.4% טריפן כחול</td><td>צבע Life Technologies (Gibco)</td><td>15250-061</td><td>משמש ככתם חיות.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>4942078001</td><td>בשימוש ב-0.04%</td></tr> <tr><td>קולגנאז II</td><td>Worthington Lab</td><td>4176</td><td>בשימוש ב-0.25%</td></tr> <tr><td>DNase I</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>11284932001</td><td>בשימוש ב-0.01%</td></tr><tr><td>70 מ"מ מסנני תאי ניילון</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr> <tr><td>שיבוט VEGFR-3 מצומד PE 9D9F9, שיבוט WM59</td><td>BioLegend</td><td>356204</td><td>בשימוש בדילול 1:50</td></tr><tr><td>PE-Cy7-מצומד CD34, שיבוט 581</td><td>BioLegend</td><td>343516</td><td>בשימוש בדילול 1:200</td></tr><tr><td>עכבר מצומד APC אנטי אנושי CD31, שיבוט WM59</td><td>BioLegend</td><td>303116,</td> <td>בשימוש בדילול 1:100</td></tr><tr><td>Alexa 488-מצומד חולדה אנטי פודופלנין אנושי, שיבוט NC-80.</td><td>BioLegend</td><td>337006</td><td>בשימוש בדילול 1:200</td></tr><tr><td>עכבר מצומד PE IgG1, k איזוטיפ, שיבוט MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>בשימוש בדילול 1:50</td></tr><tr><td>עכבר מצומד PE-Cy7 IgG1, k איזוטיפ, שיבוט MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400126</td><td>בשימוש בדילול 1:200</td></tr><tr><td>עכבר מצומד APC IgG1, k איזוטיפ, שיבוט MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400120</td><td>בשימוש בדילול</td></tr> <tr><td>1:100עכבר מצומד Alexa 488 IgG2a, k isotype, שיבוט RATK2758</td><td>BioLegend</td><td>400525</td><td>בשימוש בדילול 1:200</td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל multi-פרמטר

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

הפרעות במערכת הלימפה כגון בצקת לימפתית העיקרית, מומים הלימפה וגידולי הלימפה הן תנאים נדירים הגורמים לתחלואה משמעותית אך מעט מאוד ידוע על הביולוגיה שלהם. בידוד תאים טהורים ביותר אדם הלימפה אנדותל (LECs) מהרקמה חולה ובריאה היה להקל על מחקרים של האנדותל הלימפה ברמות גנטיות, מולקולריות ותאיות. זה צפוי כי חקירות אלה עשויות לחשוף מטרות לטיפולים חדשים שעשויות לשנות את הניהול הקליני של תנאים אלה. פרוטוקול המתאר את בידודו של אדם עורלת LECs ותאי הלימפה מום הלימפה אנדותל (LM LECs) מוצג. כדי להשיג רקמת השעיה תא בודדת הייתה טחון וטופלה באמצעות אנזימי dispase השני וcollagenase השני. ההשעיה התא בודדת וכתוצאה מכך הייתה אז שכותרתו עם נוגדנים לאשכול של בידול סמנים (CD) CD34, CD31, כלי דם האנדותל Growth Factor-3 (VEGFR-3) וPODOPLANIN. Staiתאי קיימא נד מוינו על סדרן תא מופעל fluorescently (FACS) כדי להפריד את האוכלוסייה ממוצע PODOPLANIN ממוצע LM הבקר CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 מאנדותל האחר ותאי האנדותל אינו. LECs LM מסודרים היו בתרבית והרחיב על צלוחיות מצופים פיברונקטין לשימוש ניסיוני נוסף.

בעקבות עיכול רקמה ראשוני, לאחר 24 שעות בתרבות של דגימות unfractionated, ניתן לצפות מושבות תאי אנדותל שונות (איור 2 א) יחד עם תאים כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק. בעקבות מיון ולאחר 24 שעות בתרבית תאים, CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 התאים ממוצע Podoplanin ממוצע לצרף ולהראות מורפולוגיה טיפוסית מרוצפת (איור 2 ו- C). שימוש בשיטה שתוארה לעיל FACS, אנו מסוגלים לטהר תאים עד טוהר 99.8% ולהבדיל ביניהם לבין CD34 <sup...

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אנדותל לימפטיים ברמת טוהר גבוהה, המצפים את כלי הלימפה של מלפורמציות לימפטיות של בני אדם ושל עורות ערלה, באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting). דבר זה מושג תחילה על ידי עיכול אנזימטי של דגימת רקמה ממטופל. בשלב השני, תרחיף התאים הבודדים מודגדל בתרבית כדי להעשיר את מספר התאים האנדותליים הלימפטיים.בדגימה. לאחר מכן מסמנים את התאים באמצעות נוגדנים לסממנים של פני השטח של התא המבוקשים, ומבצעים מיון באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה רב-פרמטרי. בסופו של דבר, ניתן להרחיב תאי אנדותל לימפטיים ממומתים לימפטיים ומעורלה בתרבית תאים לצורך ניתוחים המשכיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שמיון תאים מפעיל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting) מניב תאים בטוהר של מעל 99%, ובכך נמנעות הבעיות הקשורות לאובדן של תאי אנדותל לימפטיים עקב גדילה יתר של תאים מזוהמים. התחל בשקילה של מבחנה בנפח 50 milliliter המכילה 10 milliliters של מצע, מועשר בתמיסת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטית. לאחר מכן, העבר את המלפורמציה הלימפטית או דגימת עור למבחנה ושקול את המבחנה שוב כדי לקבוע את משקל הרקמה.בשלב הבא, בתוך קבמינת בטיחות ביולוגית דרגה 2, העבירו באמצעות פינצטה סטרילית את הרקמה והתווך לצלוחית תרבית רקמות של 100 מילימטר באמצעות מספריים סטריליים. לבסוף, קצצו את הרקמה לחתיכות של קוב מילימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את החתיכות לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תווך אנטיביוטי-אנטימיקוטי טרי.סובב את המבחנה מספר פעמים כדי לערבב מחדש את הרקמה ולאחר מכן סבב את הדגימה בצנטריפוגה. לאחר הסרת הנוזל העליון, הוסף 1 mL של תמיסת עיכול שחוממה מראש לכל 100 mg של רקמה קצוצה, והדגר את הרקמה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור קבוע במהירות של 200 RPM. להעשרה מוצלחת של תאי אנדותל לימפטיים, קריטי לזהות את הנקודה שבה התאים נחשפו מספיק לקולגנאז ולתגובת ה-dys space כדי שישרדו את הבידוד.דבר זה מושג באמצעות ניטור קפדני של תהליך עיכול הרקמה ועצירת התגובה כאשר רוב הרקמות התועכלו למקטעים דקים. בתום הדגירה, יש לוודא שכמעט כל הרקמה התועכלה למקטעים קטנים ולסנן את תערובת הרקמה דרך נפה של 70 micron לתוך מבחנה סטרילית של 50 milliliter. כעת, השתמש בבוכנה של מזרק של three milliliter עם פקק גומי כדי לטחון את שאריות הרקמה עד שניתן להבחין רק בעקבות קטנות של matrix חוץ-תאי.לאחר מכן, שטפו את מסנן התאים בנפח של מצע תאי אנדותל השווה לנפח מצע אנזים הפירוק, וסובבו את התאים שוב במרכזפוגה. השעיו את המשקע בעד 20 milliliters של מצע תאי אנדותל, בהתאם לגודל הדגימה. לאחר הספירה, זרעו 2×10⁶ תאים בבקבוק של 150 square centimeter מצופה מראש בפיברונקטין, בנפח סופי של 20 milliliters של מצע תאי אנדותל לתרבית לילה.בבוקר למחרת, שטפו את התאים שאינם קשורים באמצעות שלושה שטיפות של PBS המועשר בתמיסת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטית. לאחר מכן, כדי להגדיל את מספר התאים האנדותליאליים הלימפטיים, הוסיפו לתאים מצע גידול טרי לתאי אנדותל, ודגרו את התרבית למשך חמישה עד שבעה ימים עד שהתרבית תגיע לכ-80% התמזגות (confluence). צבעו את התאים לצורך מיון באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה רב-פרמטרי (multi-parameter fluorescence activated cell sorting).ראשית, יש להסיר את מצע התרבית ולשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, יש להוסיף שבעה מיליליטר של תמיסת ניתוק לאחר דגירה של חמש עד שבע דקות ב-37 °C. יש לאסוף את התאים המופרדים, לבטל את פעילות האנזימים באמצעות שלושה נפחים של מצע תרבית לתאי אנדותל, ולהעביר את תרחיף התאים למבחנה סטרילית.סבב את התאים בצנטריפוגה שלוש פעמים, כאשר בשניות ובשלישית שוטפים את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, השהה את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS טרי וספור את מספר התאים החיים בשיטת הדחת trypan blue. לאחר ספירת התאים.העבר את התאים באופן אספטי למבחנות צביעה לציטומטריית זרימה, וסבב את התאים למטה כדי לחסום קישור לא ספציפי. השהה את התאים ב-5%F-B-S-P-B-S, והדגר על קרח למשך 20 דקות. לאחר סבב הצנטריפוגה של החסימה, הסר את העלייה ותלה אותם מחדש.שעלה את המשקע בתוך תערובת נוגדנים ל-CD 34, CD 31 potanin ו-VEGF receptor three. לאחר 20 דקות על קרח, שטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של F-B-S-P-B-S כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים ושעלה מחדש. שעלה את המשקע ב-300 microliters של propidium iodide בתמיסת F-B-S-P-B-S על קרח.לבסוף, בצעו מיון של תאי אנדותל לימפטיים אנושיים מנוקים באמצעות מכשיר מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) רב-פרמטרי. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים הממוינים ושעלקו את המשקעים במצע המתאים לזריעת תרבית תאים. כאן מוצגים כלי דם לימפטיים אנושיים נורמליים וכלי דם של מלפורמציה לימפטית המסומנים בנוגדן נגד podoplanin; שימו לב להרחבה הבולטת ולשונות המשמעותית בגודל הלומן בתוך כלי הדם של המלפורמציה הלימפטית האנושית.אכן, רוב המלפורמציות הלימפטיות מכילות מבנים ציסטיים לא תקינים, הן קטנים (מיקרוציסטיים) והן גדולים (מאקרוציסטיים), לאחר עיכול הרקמה הראשוני ו-24 שעות של תרבית בדגימות שאינן מופרדות. ניתן להבחין במושבות נפרדות של תאי אנדותל, בנוסף לתאים דמויי פיברובלסטים ותאי שריר חלק, לאחר מיון ו-24 שעות נוספות בתרבית תאים. עם זאת, התאים החיוביים ל-CD 34, עם רמה נמוכה של CD 31, החיוביים ל-VEGF receptor three והחיוביים ל-podo plane נצמדים למכל כלי התרבית ומציגים את מורפולוגיית ה-cobblestone הטיפית הנצפית בתמונות אלו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד בדרגת טוהר גבוהה תאי אנדותל לימפטיים המצפים מראות לימפטיות אנושיות וכלי לימפה בעור מלא, תוך שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). זכרו כי עבודה עם רקמה אנושית ראשונית עלולה להיות מסוכנת, שכן היא עשויה להכיל גורמים זיהומיים המזיקים לבריאות האדם. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות סטנדרטיים, כגון חבישת כפפות, הרכבת משקפי מגן ולבישת חלוק מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

בידוד של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ופירוק מכני להשגת תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי לימפה ותאי אנדותל בדם. בהליך המתואר, עיכול קצר משולב עם פירוק מכני אוטומטי כדי למזער את פירוק סמני פני השטח של תאי סטרומה של בלוטות לימפה קיימות.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.

Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

זוהי שיטה לבודד תאי לימפה הרחם מעכברים בהריון ולא בהריון. שיטה זו יכולה לשמש עבור יישומים במורד הזרם מרובים כגון פנוטיפינג FACS, מיון תאים, בדיקות פונקציונליות, RNA-seq, ופרוטומיקה. הפרוטוקול כאן מדגים כיצד פנוטיפ קבוצה 1 תאי לימפה מולדים הרחם על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

למדו לבודד תאי אנדותל לימפטיים אנושיים בטוהר גבוה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי רב-פרמטרי. שיטה זו מאפשרת חקר מחלות לימפטיות והרחבת התאים לניתוחים נוספים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

גלה סרטונים נוספים