בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל לימפה בטוהר גבוה המצפים את כלי הלימפה של מומים לימפתיים אנושיים ועורלות באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. זה מושג תחילה על ידי עיכול אנזימטי של דגימת רקמת מטופל. בשלב השני, תרחיף התא הבודד מתורבת כדי להעשיר את מספר תאי האנדותל הלימפתי.

במדגם. לאחר מכן התאים מסומנים בנוגדנים לסמני פני התא המעניינים וממוינים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי רב-פרמטרים. בסופו של דבר, ניתן להרחיב את העורלה ומום לימפטי, תאי אנדותל לימפה בתרבית תאים להמשך ניתוח במורד הזרם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמיון תאים מופעל פלואורסצנטי מניב תאים גדולים מ-99% טוהר, ונמנע מהבעיות הקשורות לאובדן תאי אנדותל לימפה עקב צמיחת יתר על ידי תאים מזהמים. התחל בשקילת שפופרת של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר מדיום, בתוספת תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתית. לאחר מכן העבירו את המום הלימפטי או ארבע דגימת עור לתוך הצינור ושקלו שוב את הצינור כדי לקבוע את משקל הרקמה.

לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית מדרגה שנייה, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הרקמה והמדיום לצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר באמצעות מספריים סטריליים. לבסוף, טוחנים את הרקמה לחתיכות מילימטר מעוקב אחד. לאחר מכן העבירו את החלקים לצינור של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר אנטיביוטיקה אנטי-פטריית טרייה. בינוני.

סובב את הצינור כמה פעמים כדי להשעות מחדש את הרקמה ולאחר מכן סובב את הדגימה. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת עיכול חמה מראש לכל 100 מיליגרם רקמה טחונה ודגר את הרקמה בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמיד ב -200 סל"ד להעשרה מוצלחת של תאי האנדותל הלימפתי. זה קריטי לזהות מתי התאים נחשפו מספיק לקולגנאז ודיס את תגובת החלל כדי שהם ישרדו את הבידוד.

זה מושג באמצעות ניטור קפדני של תהליך עיכול הרקמות ועצירת התגובה כאשר רוב הרקמות מתעכלות לשברים עדינים. בתום הדגירה, ודא שכמעט כל הרקמה התעכלה לשברים קטנים וסנן את תמיסת הרקמה דרך מסננת של 70 מיקרון לתוך צינור סטרילי של 50 מיליליטר. כעת השתמש בבוכנת מזרק של שלושה מיליליטר עם בוכנת גומי כדי לטחון את הרקמה שנותרה עד שנצפו רק עקבות קטנים של מטריצה חוץ-תאית.

לאחר מכן שטפו את מסננת התאים בנפח של מדיום תאי אנדותל השווה לנפח מדיום האנזים המפריד וסובבו את התאים מחדש. השעו את הגלולה בעד 20 מיליליטר של מדיום תאי אנדותל, תלוי בגודל הדגימה. לאחר ספירת הזרעים, פעמיים כפול 10 לששת התאים בבקבוק של 150 סנטימטר מרובע מקודד מראש עם פיברונקטין בנפח סופי של 20 מיליליטר של מדיום תאי אנדותל לתרבית לילה.

למחרת בבוקר, שטפו את התאים הלא קשורים בשלוש שטיפות של PBS בתוספת תמיסת אנטי-פטריית אנטיביוטית. לאחר מכן כדי להרחיב את מספר תאי האנדותל הלימפטיים, הוסף מדיום תאי אנדותל טרי לתאים, ודגר את התרבית למשך חמישה עד שבעה ימים עד שהתרבות תהיה כ -80% מתכנסת. לצבוע את התאים למיון על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי רב פרמטרים.

ראשית, הסר את המדיה התאית, שטוף את התאים שלוש פעמים ב- PBS. לאחר מכן הוסף שבעה מיליליטר של תמיסת ניתוק לאחר חמש עד שבע דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. קצרו את התאים המנותקים, השביתו את האנזימים עם שלושה נפחים של מדיום תאי אנדותל, והעבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי.

צנטריפוגה את התאים שלוש פעמים, שטיפת הגלולה בחמישה מיליליטר PBS לסיבוב השני והשלישי לאחר הכביסה האחרונה. השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של PBS טרי וספרו את מספר התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללה של טריאן כחול. בעקבות ספירת תאים.

מעבירים את התאים באופן אספטי לצינורות צביעה ציטומטריים זורמים, ומסובבים את התאים כדי לחסום קשירה לא ספציפית. השעו מחדש את התאים ב-5% F-B-S-P-B-S, ודגרו על קרח למשך 20 דקות. לאחר חסימת הצנטריפוגה, התאים מסירים את הסופרנטנט וההחייאה.

השעו את הגלולה בקוקטייל CD 34, CD 31 פוטנין וקולטן VEGF שלושה נוגדנים. לאחר 20 דקות על קרח, שטפו את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של F-B-S-P-B-S כדי להסיר כל נוגדן והחייאה לא קשורים. תלו את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום בתמיסת F-B-S-P-B-S על קרח.

לבסוף, מיין את תאי האנדותל הלימפטי האנושיים המטוהרים במכשיר מיון תאים המופעל פלואורסצנטי רב-פרמטרים. לאחר מכן סובב את התאים הממוינים והחזיר את הכדורים במדיום המתאים לזריעת תרבית תאים. כאן, כלי מום לימפטי ולימפטי אנושיים רגילים המסומנים בנוגדנים נגד סיר ב מוצגים שימו לב להתרחבות הניכרת ולשונות ניכרת בגודל הלומן בתוך כלי המום הלימפטי האנושי.

ואכן, רוב המומים הלימפתיים מכילים מבנים ציסטיים חריגים קטנים או מיקרוציסטיים וגדולים או מקרוציסטיים לאחר עיכול הרקמות הראשוני ו-24 שעות של תרבית בדגימות הלא מקוטעות. ניתן להבחין במושבות תאי אנדותל מובחנות בנוסף לתאים דמויי פיברובלסטים ותאי שריר חלק לאחר מיון ו-24 שעות נוספות בתרבית תאים. עם זאת, CD 34, קולטן VEGF חיובי CD 31 נמוך, שלושה מישורי פודו חיוביים ותאים חיוביים המחוברים למיכל התרבית ומציגים את המורפולוגיה המרוצפת האופיינית שנצפתה בתמונות אלה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד בטוהר גבוה את תא האנדותל הלימפטי המצפה מום לימפטי אנושי וכלי לימפה מלאים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי. אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית ראשונית עלולה להיות מסוכנת מכיוון שהיא עלולה להכיל גורמים זיהומיים המזיקים לבריאות האדם. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות סטנדרטיים כגון לבישת כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.