מיצוי miRNA במחזור: שיטה לבידוד miRNA מדגימות פלזמה באמצעות מיצוי אורגני והעשרת RNA קטנה

- מיקרו-רנ"א או miRNA הם רנ"א קטן שאינו מקודד ומווסת ביטוי גנים על ידי פירוק mRNA או חסימת תרגומם לחלבונים פונקציונליים. miRNA במחזור הם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן וניתן לחלץ אותם מנוזלי גוף כמו פלזמה. כדי להתחיל, לערבב את הפלזמה עם פתרון denaturing כי בו זמנית הומוגניזציה הדגימה מעכב RNA פירוק ribonucleases.

טפלו עם חומצה פנול-כלורופורם וצנטריפוגה כדי להפריד את הדגימה לשני שלבים, שלב אורגני תחתון המכיל DNA וחלבונים, ושלב מימי עליון המכיל RNA. לשחזר את השלב המימי. הוסף אתנול מוחלט כדי לזרז RNA מן התמיסה.

הביאו את ריכוז האתנול הדגימה ל -25% כדי לקבוע מצב התחלתי התורם להפרדת RNA גדולה. מעבירים את התערובת למחסנית מסנן וצנטריפוגה שהורכבה מראש. רנ"א גדול משתק באופן סלקטיבי על המסנן, בעוד miRNA קטנים יותר נאספים בתסנין.

לאחר מכן, להגדיל את ריכוז אתנול ל 55% לטובת בידוד miRNA. העבירו את התסנין למחסנית מסנן וצנטריפוגה חדשה כדי ללכוד את ה-miRNA. הניחו את המחסנית על צינור איסוף והוסיפו חיץ אלוציה מתאים. צנטריפוגה כדי ללוט את miRNA לתוך הצינור. בפרוטוקול הבא נראה בידוד miRNA במחזור הדם מהפלזמה של חולי סרטן המעי הגס.

כדי להתחיל, להעביר 400 מיקרוליטר של דגימת פלזמה לתוך צינור 2 מיליליטר ללא RNase. לאחר מכן, להוסיף 400 מיקרוליטר של פתרון denaturing לצינור. הוסף 4 מיקרוליטר של 1 ספייק-אין