מיצוי miRNA במחזור: שיטה לבידוד miRNA מדגימות פלזמה באמצעות מיצוי אורגני והעשרת RNA קטנה

- מיקרו-רנ"א או miRNA הם רנ"א קטן שאינו מקודד ומווסת ביטוי גנים על ידי פירוק mRNA או חסימת תרגומם לחלבונים פונקציונליים. miRNA במחזור הם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן וניתן לחלץ אותם מנוזלי גוף כמו פלזמה. כדי להתחיל, לערבב את הפלזמה עם פתרון denaturing כי בו זמנית הומוגניזציה הדגימה מעכב RNA פירוק ribonucleases.

טפלו עם חומצה פנול-כלורופורם וצנטריפוגה כדי להפריד את הדגימה לשני שלבים, שלב אורגני תחתון המכיל DNA וחלבונים, ושלב מימי עליון המכיל RNA. לשחזר את השלב המימי. הוסף אתנול מוחלט כדי לזרז RNA מן התמיסה.

הביאו את ריכוז האתנול הדגימה ל -25% כדי לקבוע מצב התחלתי התורם להפרדת RNA גדולה. מעבירים את התערובת למחסנית מסנן וצנטריפוגה שהורכבה מראש. רנ"א גדול משתק באופן סלקטיבי על המסנן, בעוד miRNA קטנים יותר נאספים בתסנין.

לאחר מכן, להגדיל את ריכוז אתנול ל 55% לטובת בידוד miRNA. העבירו את התסנין למחסנית מסנן וצנטריפוגה חדשה כדי ללכוד את ה-miRNA. הניחו את המחסנית על צינור איסוף והוסיפו חיץ אלוציה מתאים. צנטריפוגה כדי ללוט את miRNA לתוך הצינור. בפרוטוקול הבא נראה בידוד miRNA במחזור הדם מהפלזמה של חולי סרטן המעי הגס.

כדי להתחיל, להעביר 400 מיקרוליטר של דגימת פלזמה לתוך צינור 2 מיליליטר ללא RNase. לאחר מכן, להוסיף 400 מיקרוליטר של פתרון denaturing לצינור. הוסף 4 מיקרוליטר של 1 ספייק-אין ננו-מולרי.

לאחר ערבוב התמיסה, מוסיפים 800 מיקרוליטר של חומצה פנול-כלורופורם. מערבלים את הפתרון למשך 60 שניות וצנטריפוגה במהירות מרבית למשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר עבור lysate הכלול בשלב מימי העליון צינור נקי, בזהירות לא להפריע interphase.

למדוד את נפח הפאזה המימית התאושש ולהוסיף 1/3 נפח של אתנול לליזט. לאחר מכן, הכנס מחסנית מסנן לשפופרת איסוף חדשה. העבר עד 700 מיקרוליטר של תערובת אתנול ליזט למחסנית המסנן. צנטריפוגור של מחסנית המסנן למשך 30 שניות במהירות של 10,000 x גרם.

לאחר מכן, למדוד את הנפח הכולל של הזרימה דרך. לאחר מכן, מוסיפים 2/3 מנפח האתנול לתסנין ומערבבים היטב. הכנס מחסנית מסנן שנייה לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, העבר עד 700 מיקרוליטר של הדגימה למחסנית ולצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות לפני השלכת הזרימה.

הוסף 700 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת מיקרו-רנ"א למחסנית המסנן וצנטריפוגה אותה באמצעות צינור איסוף במהירות של 10,000 x גרם למשך 15 שניות. מחק את הזרימה והחזיר את מחסנית המסנן לאותו צינור.

לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של פתרון elution שחומם מראש למחסנית. צנטריפוגו את מחסנית המסנן במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות כדי לשחזר את המיקרו-רנ"א.