בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד RNA באיכות גבוהה מדגימות סרום, תוך שימוש בגרסה המותאמת שלנו לפרוטוקול RTLS הנפוץ של ריאגנט ה-MRC. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דילול הסרום ביחס של אחד לחמישה עם מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) כדי להפחית את זיהום החלבון.

השלב השני הוא להוסיף נבובות phase lock בנפח של 2 mL לשלב הצנטריפוגציה הראשון. פעולה זו לוכדת את מרבית המזהמים, כגון פנול וחלבונים, בפאזה האורגנית. לאחר מכן, שלב האופטימיזציה השלישי והסופי הוא סבב צנטריפוגציה מהיר (flash centrifugation) ב-12,000 g, המסיר כל שארית זיהום ממשקע ה-RNA לפני שטיפות האתנול.

השלב הסופי הוא איחוד של שתי הכנות RNA שעברו שינוי מאותו מטופל, במידה ונדרשת תנובת RNA כוללת גבוהה יותר. בסופו של דבר, באמצעות שיטה שונויה זו, הממיסה סרום במים נטולי נוקליאז, משתמשת בנבובת phase lock ללכידת מזהמים עיקריים ומבצעת סבב צנטריפוגה קצר (flash spin), אנו מראים כי ניתן למקסם את השחזור של RNA קצר שאינו מקודד מבידוד RNA מסרום.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פרוטוקול בידוד RNA סטנדרטי באמצעות triol, הוא שבאמצעות שינויים פשוטים ניתן למקסם את תפוקת ה-RNA מתוך סרום. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקשיים מכיוון ש-RNAs קטנים נמצאים בכמויות נמוכות בסרום. השיטה המותאמת וההדגמה הוויזואלית של שלבים אלו ישפרו את השחזור של RNAs אלו וינחו חוקרים מתחילים לביצוע בידוד מוצלח.

כדי להתחיל, הפשיר על קרח את דגימת הסרום הקפואה שהוכנה מראש, ולאחר מכן העבר 400 µL של הסרום שהופשר acabado למבחנה ממתמרכזת (micro centrifuge tube) מסומנת. לאחר מכן, דלל את הסרום עם 100 µL של מים נקיים מ-RNase והוסף 50 µL של proteinase K בריכוז של 1 mg/mL. לאחר מכן, דגור את הסרום המדולל בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות כדי לאפשר עיכול חלבונים מספיק להבטחת המסה מלאה ב-1.5 mL של tri reagent RTLS ו-100 µL של four promo anole.

הפוך קצרה את ההומוגנאט ובצע פיפטינג חוזר למשך חמש שניות. לאחר מכן, העבר את התערובת לפ menutupל Heavy Phase Lock בנפח שני מיליליטר עם סימון. סבב את ההומוגנאט ב-12,000 g למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, העבירו בזהירות באמצעות דקנטציה 1 mL מהתמיסה המימית שהתקבלה אל מבחנה חדשה בעלת קישור נמוך ל-DNA. השכבה האורגנית והממשק צריכים להישאר כלואים תחת הג'ל הלבן של מבחנת ה-phase lock. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של גליקוגן ו-500 µL של 100% isopropanol לתמיסה המימית.

ערבב את התמיסה על ידי היפוך והדגרה אותה למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר ההדגרה למשך לילה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-12,000 g בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השלך את העילוי הצלול ובצע סבב קצר (flash spin) למשך שתי דקות ב-16,000 g בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

באמצעות פיפטה, הסירו בזהירות את התמיסה השקופה המקיפה את המשקע. לאחר מכן, שטפו את המשקע עם 1 ml של 70% ethanol וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-10,000 GS למשך 10 דקות. כדי לראות את המשקע, הטו את המבחנה על רקע כהה ושפכו את תמיסת השטיפה.

חזור על השטיפה. שלב הבא. נשעה את המשקע ב-10 µL של מים נקיים מ-RNA.

יש לוודא שהמשקע מומס לחלוטין על ידי חימום הדגימה בטמפרטורה של 55 °C למשך חמש דקות. במהלך זמן זה, ערבב את הדגימה באמצעות פיפוט חוזר כדי להשיג תנובה גבוהה יותר של RNA כולל, משתי הכנות RNA מאותו מטופל. כמת את ה-RNA שהושעה באמצעות UV vs.

ספקטרופוטומטר והערכת איכות ה-RNA באמצעות 2100 bioanalyzer. לאחר מכן, יש לאחסן את דגימות ה-RNA המאוחדות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים עתידיים. פרופילים ספקטרופוטומטריים של RNA מסרום אנושי מדגימים את התבואה המשופרת של RNA הודות להוספת מספר שלבים לגישה המסורתית של Chomsky.

פרופיל UV טיפוסי של RNA שבודד מסרום אנושי עומד בניגוד לאלו המשתמשים בשלבי אופטימיזציה, הכוללים הוספה של גליקוגן וספין נוסף, כאשר שילוב של כלים אלו מוביל להפחתה במזהמים ולעלייה בתנובת ה-RNA הכוללת. טהרת דגימת ה-RNA הוגברה עוד יותר באמצעות שימוש בג'ל לנעילת פאזה (phase lock gel), הלוכד פנול וחלבונים. בנוסף, להגדלת נפח הסרום יש השפעה ניכרת על תנובת ה-RNA.

בוצע ניתוח באמצעות ביו-אנלייזר (bioanalyzer trace) כדי לבחון לעומק את איכות הדגימה. שיא בודד בערך של 21 נוקלאוטידים מייצג את פראקציית ה-micro RNA. לאחר מכן בוצעו מיפוי מערך (array profiling) ו-QPCR לפי הפרוטוקול. פרופיל מערך זה של שלושה מקרים של סרטן ראש צוואר ומקרה אחד נורמלי מראה ביטוי של microRNAs, אשר נותחו באמצעות צבירה היררכית (hierarchical clustering) והוצגו כמפת חום (heat map) שבה ניתן לראות ויסות חיובי (upregulation) וויסות שלילי (downregulation) של ה-microRNAs.

עקומות הגברה של QPCR הופקו עבור microRNAs ספציפיים. נתונים אלו שימשו לאחר מכן לשרטוט ערכי CT גולמיים עבור הסרום הנורמלי. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו עבור מספר רב של חולים ולהפיק RNA באיכות גבוהה במידה היא מבוצעת כראוי בהתאם ללפרוצדורה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון PCR כמותי או ריצוף דור הבא (next generation sequencing), כדי לענות על שאלות נוספות כגון גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים (biomarkers).