Name: בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: למד שיטה מותאמת לבידוד RNA איכותי מסרום אנושי באמצעות צנטריפוגה פלאש וצינורות phase lock. הפרוטוקול ממזער זיהום חלבונים ומייעל תפוקת microRNA למחקר סרטן ויישומים מולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סמנתה חורי ופמלה Ajuyah נתמכים לאחר התואר הראשון בפרס האוסטרלי על ידי. אנחנו רוצים גם להכיר ברשת Translational חקר הסרטן, לואי מרכז לחקר הסרטן, אוניברסיטת ניו סאות&#39; ויילס והצפון Translational היחידה לחקר הסרטן לקבלת תמיכה הנוספת של סמנתה חורי.

שים לב: דגימות סרום אדם מחולים או חולים עם הסרטן בריאים התקבלו עם הסכמה מדעת לפי פרוטוקולים אתיים אדם שאושרו מהנסיך המלכותי אלפרד החולים סידני (מספר פרוטוקול X10-0016 וHREC/10/RPAH/24) והאוניברסיטה טכנולוגי, סידני. דגימות סרום שנאספו ממטופלים לפני הניתוח מבתי חולים שונים בסידני והניחו באחסון ב -80 ° C. 1. בידוד RNA קטן מסרום רנ&quot;א הכל הוכן מסרום אדם משתמש בגרסה שונה של פרוטוקול LS Tri-מגיב RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו מדגם סרום קפוא על קרח ולאחר מכן להעביר 400 μl של הסרום מופשר הטרי לתוך צינור microcentrifuge שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הסרום עם של H 2 O RNase ללא 100 μl ולהוסיף K proteinase בריכוז של 1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על C ° 37 עבור 20 דקות כדי לאפשר את עיכול חלבון על ידי proteinase ק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> To להבטיח solubilization מלא, להוסיף 1.5 פעמיה נפח של Tri-מגיב RT LS ושל 4 bromoanisole-100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להפוך את homogenate, לבצע pipetting חוזר על עצמו במשך 5 שניות ולהעביר לתוך צינור 2 מיליליטר כבד שלב נעילה שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין homogenate ב12,000 × גרם ל20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג בזהירות לפחות 1 מיליליטר של התמיסה המימית שנוצרה לתוך צינור ה-DNA LoBind טרי. ביניים האורגניים ויש לכודים מתחת לג&#39;ל הלבן של צינור שלב הנעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 5.0 μl של גליקוגן (5 מ&quot;ג / מיליליטר) ו500 μl של isopropanol 100% לתמיסה המימית, מערבב על ידי היפוך, ודגירת O / N ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O הבא / N, צנטריפוגות המדגם עבור 20 דקות ב 12,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ברור ולבצע ספין &quot;הבזק&quot; במשך 2 דקות ב 16,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את סול ברור בזהירותution המקיף את הכדור בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב 10,000 × גרם ל10 דקות. למזוג את הפתרון לשטוף ולחזור על פעולת שטיפה. </li></ol> 2. RNA resuspension לפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב10 μl של H 2 O RNase ללא, על מנת להבטיח את גלולה הוא נמסה לגמרי. כדי להבטיח כי RNA הוא solubilized לחלוטין המדגם יכול להיות מחומם ל55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. במהלך הזמן הזה, לערבב את המדגם עם pipetting חוזר ונשנה. עבור סכום כולל תשואת RNA גבוהה, בריכת שתי הכנות RNA מאותו החולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת RNA resuspended באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis ולהעריך את איכות RNA באמצעות 2100 Bioanalyzer. לאחסן דגימות RNA נקוו ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים במורד הזרם. </li></ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
<li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li>
<li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li>
<li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li>
<li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum%2FPlasma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li>
<li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
<li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

האוכלוסייה של מיקרו RNA מהווה כ 0.4-0.5% מרנ&quot;א הכל נמצא בסרום. בהמשך יש גם תכולת חלבון גבוהה שנמצאה בסרום אדם. כדי לשפר את RNA ולהפחית חלבון וגם פנול מזהם יש לנו שונה בגישה המסורתית Chomczynski 9 עם התוספת של כמה צעדים. RNA סה&quot;כ היה מבודד מסרום באמצעות Tri-מגיב RT-LS הסטנדרטי (Molecular Research Centre) לעומת זאת כאשר היא מבוצעת במעבדה שלנו, שיטה זו הניבה RNA בכמויות נמוכות עם מזהמים שונים. <...

בשנים האחרונות, חלה דחיפה גוברת לגלות סמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי המוקדם של מחלות בבני אדם. תשומת לב רבה התמקדה באמצעות RNA קטן כגון מיקרו RNA 2 (miRNAs או מירס) כסמנים פוטנציאליים. RNAs הקטן אלה נמצאים בנוזלי גוף כגון סרום ומחקרים הראו שהם עמידים לפירוק ויציבים על פני טווח של תנאים סביבתיים משתנים 3. בהתחשב miRNAs תכונות, הסרום או במחזור אלה הם הסמן הביולוגי האידיאלי 4, 5. נכון לעכשיו יש שתי גישות עיקריות לבידוד של RNA הקטן מנוזלים ביולוגיים. הגישה הראשונה משתמשת בטכנולוגיה מבוססת עמודה להיקשר וelute RNA הקטן 6, ואילו הגישה השנייה משתמשת בפרוטוקול ארוכת השנים עם חומרים כימיים פנול וthiocyanate guanidinium 7. פיתחנו פרוטוקול פשוט, יעיל, ללא עמודה כדי לבודד RNAs הקטן מסרום אדם. RNA הבודד הוא היא מידately שמיש ביישומים במורד הזרם, כוללים מערכי oligonucleotide DNA ורצף RNA. פרוטוקול זה פותח בגלל שאנחנו מתמודדים עם כמה בעיות בעת השימוש בשיטות המבוסס על פנול לבודד RNA מסרום. גישת Chomczynski המסורתית משמשת לעתים קרובות ברוב המעבדות עם מגוון של חומרים כימיים זמינים מרוב הספקים מסחריים. עם זאת שוקל השימוש הנרחב שלהם, הנחיות מחמירות שלא פותחו באופן עקבי לייצר RNA איכות גבוהה מנוזלי גוף, בדם או בסרום מסוים. בעיות נפוצות הקשורות לבידוד RNA מן הסרום כוללות תשואות RNA נמוכות וזיהום עם חומרים כימיים המשמשים בבידוד, במיוחד פנול. הגישה שלנו מבטלת מזהמים פנול אלה כדי לספק RNA באיכות גבוהה לניתוח במורד כגון PCR כמוני (qPCR) ורצף RNA. בדקנו עוד RNA זה על מערכי מירנה.

<table><tbody><tr><td>מרכז המחקר המולקולרי</td> <td>Tri-Reagent RT LS</td>, ארה"ב <td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>RNase ללא H2O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Finnzymes, פינלנד</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>צינור נעילת פאזה כבד</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>קיבולת 2 מ"ל</td></tr><tr><td>צינור DNA Lobind</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1.5 מ"ל קיבולת</td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>10814-010</td><td>5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>איזופרופנול בדרגת RNA</td><td>סיגמא אולדריץ', ארה"ב</td><td>I9516</td><td>100%</td></tr> <tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>ג'ון מוריס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ספקטרופוטומטר UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול בדרגת RNA</td><td>סיגמא אולדריץ', ארה"ב</td><td>E7023</td><td>70%</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של קטן noncoding rnas מסרום האדם

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

הניתוח של RNA והביטוי שלה הוא תכונה נפוצה במעבדות רבות. משמעות היא הופעתה של RNA קטן כמו מיקרו RNA, אשר נמצאים בתאי יונקים. RNAs הקטן אלה הם רגולטורים גן עוצמה שליטה מסלולים חיוניים כגון צמיחה, פיתוח ומוות ועניין רב כבר מופנים כלפי הביטוי שלהם בנוזלי גוף. זאת בשל חוסר הוויסות שלהם במחלות בבני אדם כגון סרטן ויישום הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים בסרום. עם זאת, הניתוח של ביטוי מירנה בסרום עשוי להיות בעייתי. ברוב המקרים הסכום של סרום הוא להגביל וסרום מכיל כמויות נמוכות של רנ&quot;א הכל, מתוכם RNAs הקטן מהווים 0.4-0.5 1% בלבד. לכן הבידוד של כמויות מספיקות של RNA האיכותי מסרום הוא אתגר גדול לחוקרים כיום. במאמר זה טכני, אנחנו מדגימים שיטה שבה משתמשת רק 400 μl של סרום אנושי להשיג RNA מספיק לאף אחד ממערכי ה-DNA או ניתוח qPCR.dvantages של שיטה זו הוא הפשטות והיכולת להניב RNA באיכות הגבוהה שלה. זה לא דורש עמודות מיוחדות עבור טיהור של RNA הקטן ומנצל חומרים כימיים בכלל וחומרה שנמצאו במעבדות משותפות. השיטה שלנו מנצלת שלב נעילת ג&#39;ל כדי למנוע זיהום פנול ואילו באותו הזמן מניב RNA באיכות גבוהה. גם אנחנו מציגים את צעד נוסף כדי להסיר את כל המזהמים נוספים במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה הוא יעיל מאוד בבידוד תשואות של RNA הכולל של עד 100 ng / μl מסרום, אבל יכול גם להיות מותאם לרקמות ביולוגיות אחרות.

איור 1 מייצג ספקטרום UV / Vis טיפוסי של רנ&quot;א מבודד מסרום. מפרופיל זה שציינו זיהום חלבון בננומטר 280 עם פנול ומזהמים אורגניים הן ב270 ננומטר ו230 ננומטר, בהתאמה. thiocyanate guanidinium שאריות היה גם ציין ב260 ננומטר. כדי להפחית את המזהמים, בשורה של צעדי אופטימיזציה נעשו הליך RT-LS הסטנדרטי Tri-מגיב. הוספנו 5 מ&quot;ג / מיליליטר של גליקוגן כדי להגדיל את שניהם בסך הכל תשואת RNA ולהפחית את הזיהום (קו שחור, איור 1 א). <p class="jove_content" ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד RNA באיכות גבוהה מדגימות סרום, תוך שימוש בגרסה המותאמת שלנו לפרוטוקול RTLS הנפוץ של ריאגנט ה-MRC. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דילול הסרום ביחס של אחד לחמישה עם מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) כדי להפחית את זיהום החלבון.השלב השני הוא להוסיף נבובות phase lock בנפח של 2 mL לשלב הצנטריפוגציה הראשון. פעולה זו לוכדת את מרבית המזהמים, כגון פנול וחלבונים, בפאזה האורגנית. לאחר מכן, שלב האופטימיזציה השלישי והסופי הוא סבב צנטריפוגציה מהיר (flash centrifugation) ב-12,000 g, המסיר כל שארית זיהום ממשקע ה-RNA לפני שטיפות האתנול.השלב הסופי הוא איחוד של שתי הכנות RNA שעברו שינוי מאותו מטופל, במידה ונדרשת תנובת RNA כוללת גבוהה יותר. בסופו של דבר, באמצעות שיטה שונויה זו, הממיסה סרום במים נטולי נוקליאז, משתמשת בנבובת phase lock ללכידת מזהמים עיקריים ומבצעת סבב צנטריפוגה קצר (flash spin), אנו מראים כי ניתן למקסם את השחזור של RNA קצר שאינו מקודד מבידוד RNA מסרום.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פרוטוקול בידוד RNA סטנדרטי באמצעות triol, הוא שבאמצעות שינויים פשוטים ניתן למקסם את תפוקת ה-RNA מתוך סרום. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקשיים מכיוון ש-RNAs קטנים נמצאים בכמויות נמוכות בסרום. השיטה המותאמת וההדגמה הוויזואלית של שלבים אלו ישפרו את השחזור של RNAs אלו וינחו חוקרים מתחילים לביצוע בידוד מוצלח.כדי להתחיל, הפשיר על קרח את דגימת הסרום הקפואה שהוכנה מראש, ולאחר מכן העבר 400 µL של הסרום שהופשר acabado למבחנה ממתמרכזת (micro centrifuge tube) מסומנת. לאחר מכן, דלל את הסרום עם 100 µL של מים נקיים מ-RNase והוסף 50 µL של proteinase K בריכוז של 1 mg/mL. לאחר מכן, דגור את הסרום המדולל בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות כדי לאפשר עיכול חלבונים מספיק להבטחת המסה מלאה ב-1.5 mL של tri reagent RTLS ו-100 µL של four promo anole.הפוך קצרה את ההומוגנאט ובצע פיפטינג חוזר למשך חמש שניות. לאחר מכן, העבר את התערובת לפ menutupל Heavy Phase Lock בנפח שני מיליליטר עם סימון. סבב את ההומוגנאט ב-12,000 g למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בשלב הבא, העבירו בזהירות באמצעות דקנטציה 1 mL מהתמיסה המימית שהתקבלה אל מבחנה חדשה בעלת קישור נמוך ל-DNA. השכבה האורגנית והממשק צריכים להישאר כלואים תחת הג'ל הלבן של מבחנת ה-phase lock. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של גליקוגן ו-500 µL של 100% isopropanol לתמיסה המימית.ערבב את התמיסה על ידי היפוך והדגרה אותה למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר ההדגרה למשך לילה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-12,000 g בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השלך את העילוי הצלול ובצע סבב קצר (flash spin) למשך שתי דקות ב-16,000 g בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.באמצעות פיפטה, הסירו בזהירות את התמיסה השקופה המקיפה את המשקע. לאחר מכן, שטפו את המשקע עם 1 ml של 70% ethanol וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-10,000 GS למשך 10 דקות. כדי לראות את המשקע, הטו את המבחנה על רקע כהה ושפכו את תמיסת השטיפה.חזור על השטיפה. שלב הבא. נשעה את המשקע ב-10 µL של מים נקיים מ-RNA.יש לוודא שהמשקע מומס לחלוטין על ידי חימום הדגימה בטמפרטורה של 55 °C למשך חמש דקות. במהלך זמן זה, ערבב את הדגימה באמצעות פיפוט חוזר כדי להשיג תנובה גבוהה יותר של RNA כולל, משתי הכנות RNA מאותו מטופל. כמת את ה-RNA שהושעה באמצעות UV vs.ספקטרופוטומטר והערכת איכות ה-RNA באמצעות 2100 bioanalyzer. לאחר מכן, יש לאחסן את דגימות ה-RNA המאוחדות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים עתידיים. פרופילים ספקטרופוטומטריים של RNA מסרום אנושי מדגימים את התבואה המשופרת של RNA הודות להוספת מספר שלבים לגישה המסורתית של Chomsky.פרופיל UV טיפוסי של RNA שבודד מסרום אנושי עומד בניגוד לאלו המשתמשים בשלבי אופטימיזציה, הכוללים הוספה של גליקוגן וספין נוסף, כאשר שילוב של כלים אלו מוביל להפחתה במזהמים ולעלייה בתנובת ה-RNA הכוללת. טהרת דגימת ה-RNA הוגברה עוד יותר באמצעות שימוש בג'ל לנעילת פאזה (phase lock gel), הלוכד פנול וחלבונים. בנוסף, להגדלת נפח הסרום יש השפעה ניכרת על תנובת ה-RNA.בוצע ניתוח באמצעות ביו-אנלייזר (bioanalyzer trace) כדי לבחון לעומק את איכות הדגימה. שיא בודד בערך של 21 נוקלאוטידים מייצג את פראקציית ה-micro RNA. לאחר מכן בוצעו מיפוי מערך (array profiling) ו-QPCR לפי הפרוטוקול. פרופיל מערך זה של שלושה מקרים של סרטן ראש צוואר ומקרה אחד נורמלי מראה ביטוי של microRNAs, אשר נותחו באמצעות צבירה היררכית (hierarchical clustering) והוצגו כמפת חום (heat map) שבה ניתן לראות ויסות חיובי (upregulation) וויסות שלילי (downregulation) של ה-microRNAs.עקומות הגברה של QPCR הופקו עבור microRNAs ספציפיים. נתונים אלו שימשו לאחר מכן לשרטוט ערכי CT גולמיים עבור הסרום הנורמלי. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו עבור מספר רב של חולים ולהפיק RNA באיכות גבוהה במידה היא מבוצעת כראוי בהתאם ללפרוצדורה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון PCR כמותי או ריצוף דור הבא (next generation sequencing), כדי לענות על שאלות נוספות כגון גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים (biomarkers).

isolation-of-small-noncoding-rnas-from-human-serum

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והכימות של רנ"א קטן של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

צואה (מיקרו) בידוד RNA

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

למד שיטה מותאמת לבידוד RNA איכותי מסרום אנושי באמצעות צנטריפוגה פלאש וצינורות phase lock. הפרוטוקול ממזער זיהום חלבונים ומייעל תפוקת microRNA למחקר סרטן ויישומים מולקולריים.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

גלה סרטונים נוספים