Name: גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: חקור את יעילות טיפול אימונותרפיה בהעברה אדופטיבית של תאי CTL ספציפיים לגידול בעכברים. השיטה כוללת השתלת תאי גידול ליצירת גרורות ריאה והדמיית גרורות בדיו הודי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (CA133085 כדי KL) לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (RSG-09-209-01-TBG כדי KL).

1. גרורה ניסויית עכבר דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לפני זריקות תאים סרטניים, זרע אחד T75 עם בקבוק עד 1 x 10 7 CMS4-Met תאים 10 מ"ל של מדיום RPMI המכילה 10% נסיוב להשיג בצמיחה מהירה תאים סרטניים. דגירה לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים פעם עם PBS, אז הקציר תאים סרטניים עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. עצור את התגובה עם 10 מ"ל של מדיום RPMI סרום המכיל 10%. העברת התאים צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 1300 סל"ד ב צנטריפוגה מקרא RT Sorvall 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant. Resuspend התאים טרי 10 מ"ל 1X HBSS לשטוף, אז ספין למטה שוב resuspend באותו אופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים סרטניים על hemocytometer. לדלל את התאים HBSS, כך התאים הדרושים כל הזרקה הם resuspended בנפח כולל של 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם 6-8 בן שבוע BALB / c עכברים בכוס שקוע במים חמים כדי להרחיב את הווריד הזנב. הנח את העכבר על עוצר זנב וריד על הספסל. השתמש microsyringe להזריק 100 μL של תאים סרטניים לווריד הזנב לרוחב. השתמש בטכניקה aseptic כדי למנוע זיהום. לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ קל על הזריקה עד הדימום הפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר הגידול לגדול לשלב הרצוי. </li></ol> 2. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (CTL) העברת המאמצת חיסוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההעברה, פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend ציטוטוקסיות מטוהרים לימפוציטים מסוג T, או ההרג, מוכן כמתואר בטקסט. העברת כל התאים מהצלחת אחד צינור חרוטי 15 מ"ל, לא נותנים נפח יעלה יותר מ 2 / 3 של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סטרילי פסטר פיפטה לתוך הצינור חרוטי ולהניח בינוני ההפרדה לימפוציטים, או LSM, תחת התאים עד הנפח הכולל מתקרב 14 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא להפריע את השכבות. צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור אחרי ספינינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההרג על צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. הוסף HBSS לנפח של כ -10 מ"ל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. ספין למטה בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend ב HBSS לצפיפות תא נדרש זריקות, תוך שמירה על הנפח הכולל לכל זריקה בבית μL 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה טכניקה הזרקת הזנב כפי שנראה קודם לכן סרטון זה להזריק את ההרג לתוך הגידול נושאות עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר ההרג לקיים אינטראקציה עם הגידול. עכברים הם הקריבו בדרך כלל לניתוח 14-21 ימים לאחר הטיפול CTL. </li></ol> 3. ויזואליזציה של גרורות ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש גרורות ריאות, במקום עכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה לקנה הנשימה. תרסיס הצד הגחוני עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ הבטן באמצע, להשתמש במספריים לחתוך לאורך קו האמצע, דרך בית החזה, ואת לכיוון בלוטות הרוק. לחשוף את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר הרקמות הסובבות את הקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא טיפ 200 פיפטה μL מתחת לקנה הנשימה. מחזיק את קצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את פלטפורמת 180 °. השתמש מזרק 50 מ"ל להזריק דיו הודו לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם דיו עד שאתה מרגיש התנגדות חזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. Slide זוג מלקחיים תחת הריאות ולהרים אותם העכבר. שוטפים את הריאות בקצרה בכוס 1 ליטר של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף כימי קטר, להעביר את הריאות בקבוקון זכוכית scintillation המכיל 5 מ"ל של הפתרון של Fekete. רקמת הגידול תצא כמו גושים לבנים על הריאות שחור אחרי כמה דקות. גידולים יכולים כעת לסמוך ומאוחסנים הפתרון של Fekete ללא הגבלת זמן. </li></ol> 4. נציג גרורות בריאות דמיינו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, הריאות מעכברים כי הוזרקו תאים החלב 4T1 קרצינומה קו להראות כתמים לבנים המעידים גידולים. עכברים הוזרקו תאים 4T1 transfected עם K79E דומיננטי שלילי IRF8 מוטציה להראות את הפוטנציאל גרורתי מוגברת של תאים סרטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות אלו מראות ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. גידול נושאות עכברים שהוזרק עם מלוחים הראו גידולים מרובים 6 ימים לאחר מכן, שמסומן על ידי חיצים צהובים (A). עכברים שהוזרק עם גידול ספציפי בתאי T, לעומת זאת, הראה ירידה של גידולים (B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי דומה, טיפול הודו דיו נותן דרך פשוטה למדוד את היעילות של העברת המאמצת CTL. כאן, גושים סרטניים לבן על נושאות גידולים הריאות הבחנה ברורה להם מהריאות שעברו בהצלחה העברת המאמצת CTL, וספירת גושים מאפשר לתוארשל quantitation לא אפשרי עם היסטולוגיה. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תכנית ניסיונית עבור גרורות הגידול ניסיוניים CTL חיסוני אדפטיבית העברת במודל עכבר. נקודות אדומות מצביעות תאים סרטניים נקודות ירוק עולה ההרג. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. שיבוש של תפקוד משופר IRF8 פוטנציאל גרורתי של תאים סרטניים. עכבר החלב קרצינומה 4T1 הקו היה transfected ביציבות עם וקטור (4T1.Vector) או וקטור הבעת IRF8 דומיננטי שלילי מוטציה K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). תאים סרטניים הוזרקו לתוך ורידים iv העכבר הזנב לרוחב. גידול נושאות הריאות היו מנופחים עם דיו הודו לדמיין גושים סרטניים. גושים גידול נתפסים בקלות כמו כתמים לבנים על רקע שחור רקמת הריאות. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (א) או גידולים מסוימים בתאי T (B) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו שישה ימים לאחר הטיפול על ידי CTL מכתים H &amp; E המקובלת היסטולוגית. גושים גידול מסומנים על ידי חצים. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. ויזואליזציה של גושים הגידול באינפלציה דיו בהודו. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (Control) או גידולים מסוימים בתאי T (+ CTL) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו ארבעה עשר ימים לאחר הטיפול CTL. כתמים לבנים, אשר הם גושים סרטניים, לאפשר כימות קל של יעילות הטיפול CTL.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
<li>Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Adoptive+Immunotherapy+Concurrently+Mediates+Tumor+Regression+and+Tumor+Escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape.</a> J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).</li>
<li>Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+IFN-gammaR+in+association+with+loss+of+Fas+function+is+linked+to+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression.</a> International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).</li>
<li>Pages, F., Berger, A., Camus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells%2C+early+metastasis%2C+and+survival+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).</li>
<li>Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type%2C+density%2C+and+location+of+immune+cells+within+human+colorectal+tumors+predict+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.</a> Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).</li>
<li>Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD95+expression+predisposes+for+recurrence+in+curatively+resected+colon+carcinoma%3A+clinical+evidence+for+immunoselection+and+CD95L+mediated+control+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease.</a> Gut. 54 (5), 661-665 (2005).</li>
<li>Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intratumoral+immune+reaction+and+human+colorectal+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence.</a> Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+therapy+following+non-myeloablative+but+lymphodepleting+chemotherapy+for+the+treatment+of+patients+with+refractory+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).</li>
<li>Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T-cell+activation+by+depleting+cystine+and+cysteine.+Cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research.</a> 70 (1), 68-77 (2010).</li>
<li>Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+escape+mechanism+governed+by+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+colorectal+cancer+and+liver+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+surgery%22%5BJournal%5D)">Mouse models of colorectal cancer and liver metastases.</a> Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lymphotoxin+beta+receptor+with+tumor-specific+T+lymphocytes+for+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression.</a> Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+Regulatory+Factor+8+Mediates+Apoptosis+in+Nonhemopoietic+Tumor+Cells+via+Regulation+of+Fas+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression.</a> J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+IFN+regulatory+factor+8+by+DNA+methylation+is+a+molecular+determinant+of+apoptotic+resistance+and+metastatic+phenotype+in+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells.</a> Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

עכברים נרכשו מן המכון הלאומי לסרטן (Friderick, MD) ו שוכנו הספר לרפואה של מתקן חיה ג&#39;ורג&#39;יה. ניסויים וטיפול / הרווחה היו בהסכם עם תקנות פדרליות ואת פרוטוקול שאושר על ידי בית הספר לרפואה של ג&#39;ורג&#39;יה IACUC הוועדה.

פתרונות: הודו פתרון דיו (17): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 150 מ&quot;ל מים מזוקקים לתוך בקבוק 250 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות אמוניום הידרוקסיד למים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ&quot;ל הודו דיו המניה (כלומר סנפורד דיו שחור Magic Waterproof ציור 4465 פריט 44011) לתערובת אמוניה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה מן במים מזוקקים לנפח של 200 מ&quot;ל. הפתרון הוא מוכן להזרקה. </li></ol> Fekete של פתרון (17): הפתרון של Fekete משמש אקונומיקה הודו דיו מנופח נושאות גידולים הריאות להבחין גושים סרטניים לבן רקע שחור של רקמות נורמליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350ml EtOH 95% עד בקבוק זכוכית 1 ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 150 מ&quot;ל מים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל פורמאלדהיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25ml חומצה חומציים קרחונים </li></ol>

גרורה ניסויית חיסוני ctl המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

מודל ניסיוני עכבר גרורות גרורות הוא מודל פשוט עדיין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאים סרטניים מוזרקים לווריד (iv) לתוך הוורידים זנב עכבר ליישב הריאות, ובכך, שמזכיר את הצעדים האחרונים של גרורות תאים סרטניים ספונטנית: הישרדות extravasation ההשאלה, והקולוניזציה באיברים דיסטלי. מבחינה טיפולית של נוף, מודל ניסיוני גרורות הוא הדגם הפשוט האידיאלי מאז היעד של טיפולים היא לעתים קרובות את נקודת הסיום של גרורות: גידול גרורתי הוקמה בשנת האיבר הדיסטלי. במודל זה, תאים סרטניים מוזרקים לתוך הוורידים iv העכבר הזנב מותר ליישב ולפתח את הריאות. גידול ספציפי ההרג מוזרקים אז iv לעכבר גרורות נושאות. המספר והגודל של גרורות הריאה ניתן לשלוט במספר תאים סרטניים להיות מוזרק והזמן של הגידול. לכן, בשלבים שונים של גרורות, גרורות מן מינימלית גרורות נרחב, יכול להיות המודל. גרורות הריאה מנותחים על ידי האינפלציה בדיו, ובכך מאפשר תצפית ויזואלית יותר קל וכימות.

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים תא-T<em&gt; In vivo</em&gt;.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

מודל עכברי למטסטזה ניסיונית הוא מודל גרורתי פשוט ועם זאת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאי הגידול מוזרקים באופן תוורידי (i.v) לתוך...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את היעילות של אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לגידול in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת תאי גידול באמצעות הזרקה לווריד הזנב הצדי בעכברים, במטרה להקים גרורות בריאות. השלב השני של הפרוצדורה הוא טיפול בעכברים הנושאים את הגידול באמצעות לימפוציטים T ציטוטוקסיים CTLs ספציפיים לגידול.השלב הסופי הוא שימוש בדיו הודו (India ink) כאמצעי לוויזואליזציה וככימות של קשרי גידול. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את ה-CIE של טיפולים שונים באמצעות מדידת גודל הגידול וכימות מספר קשרי הגידול. שלום, שמי מרי צימרמן ואני חברה במעבדתו של ד"ר קווין לו (Dr. Kevin Lu) במכללה לרפואה של ג'ורג'יה (Medical College of Georgia).שלום, שמי Shelene Hu. אני סטודנטית בשנה השנייה ואני עובדת גם במעבדה של Dr. Lou. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מסורתיות, כגון עקומות הישרדות, הוא שההליך הנוכחי הוא איכותני וכמותי כאחד. להשלכות של הטכניקות הללו עשוי להיות השפעה על טיפולים בסרטן, כיוון שהן מדמות אימונותרפיה אדופטיבית של תאי T בחולי סרטן בבני אדם.נתחיל בתהליך. ביום שלפני הזרקת תאי הגומלה, זרעו בבליל T75 אחד עד 1×10⁷ תאי CMS-4met ב-10 מיליליטר של מצע RPMI המכיל 10% סרום. כדי לקבל תאי גומלה הצומחים במהירות, דגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ביום ההזרקה.הסיר את המצע ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS, לאחר מכן קצור את תאי הגידול באמצעות 0.05%trypsin EDTA בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות. עצור את התגובה עם 10 milliliters של מצע RPMI המכיל 10%serum. העבר את התאים למבחנה קונית.סובב את התאים במהירות של 1300 RPM בצנטריפוגה מסוג val legend RT למשך שלוש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את העלייה (snat), השהה מחדש את התאים ב-10 milliliters של one XHB Ss טרי לשטיפה. לאחר מכן, סובב שוב והשהה מחדש באותו אופן.ספרו את תאי הגידול באמצעות hemo.Cytometer. דללו את התאים ב-HBSS כך שניתן יהיה להשעות את כמות התאים הדרושה לכל הזרקה. בנפח כולל של 100 microliters, חממו את עכברי ה-B SEA בני שש עד שמונה שבועות בתוך כלי זכוכית טבול במים חמים.כדי להרחיב את וריד הזנב, מקמו את העכבר במכשיר קיבוע לווריד הזנב על המדף. השתמשו במזרק מיקרו כדי להזריק 100 µL של תאי גידול לווריד הזנב הלטרלי. השתמשו בטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום לאחר ההזרקה.הפעילו לחץ קל על אתר ההזרקה עד להפסקת הדימום. החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו לגידול לגדול לשלב הרצוי. ביום ההעברה, בצעו פיפטור מעלה ומטה כדי להשעות מחדש לימפוציטים T ציטוטוקסיים מוצמדים (purified cytotoxic T lymphocytes או CTLs) שהוכנו.כפי שמתואר בטקסט, העבירו את כל התאים מתוך צלחת אחת לשפופרת קונית בנפח 15 מיליליטר, תוך הקפדה שהנפח לא יעלה על שני שלישים מהשפופרת. הכניסו פסטור פפיפט סטרילית לשפופרת הקונית והוסיפו בשכבה מתווך להפרדת לימפוציטים או LSM מתחת לתאים, עד שהנפח הכולל יתקרב ל-14 מיליליטר.הקפידו לא להפריע לשכבות. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור לאחר הסבב, העבירו את ה-CTLs לפרוקת קונית חדשה של 15 מיליליטר.הוסיפו HBSS לנפח של כ-10 מיליליטר. לשטיפה. ספרו את התאים, סובבו במערך צנטריפוגה במהירות של 1300 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, וסספנדו מחדש ב-HBSS לצפיפות התאים הנדרשת להזרקות.שמרו על נפח כולל של 100 microliters לכל הזרקה. השתמשו בטכניקת ההזרקה לזנב כפי שהודגמה קודם לכן בסרטון זה. כדי להזריק את ה-CTLs לעכברים עם גידולים, החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו ל-CTLs להקיף את הגידול ולפעול עליו.עכברים נשחטים בדרך כלל לצורך אנליזה 14 עד 21 ימים לאחר הטיפול ב-CTL. כדי להדמיץ גרורות בריאות, הנח עכבר נשחט על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים בעזרת סיכות כדי להבטיח גישה ללא הפרעה לקנה הנשימה.רססו את הצד הגחוני ב-70% ethanol, החל מאמצע הבטן. השתמשו במספריים כדי לגזור לאורך קו האמצע דרך כלוב הצלעות וכלפי מעלה לכיוון בלוטות הרוק. חשפו את הקנה (trachea).השתמשו בפינצטה כדי להסיר רקמות הסובבות את הקנה. השחילו קצה של פפפיה של 200 microliter מתחת לקנה תוך כדי החזקת הקצה ביד אחת. הרימו בעדינות את הקנה למעלה והרחיקו אותו מהגוף.סובב את הפלטפורמה ב-180 מעלות. השתמש במזרק של 50 milliliter כדי להזריק דיו הודים לתוך הריאות דרך הקנה. נפח את הריאות לחלוטין בעזרת הדיו עד שתרגיש התנגדות חזקה.השתמשו במספריים כדי לחתוך את הקנה. החליקו פינצטה מתחת לריאות והרימו אותן מתוך העכבר. שטפו את הריאות קצרה בביקר של ליטר מים בתוך מנדף כימי.העבירו את הריאות למכל זכוכית המכיל חמישה מיליליטרים של תמיסת FTI. רקמת הגידול תופיע כקשריות לבנות על הריאות השחורות. לאחר מספר דקות, ניתן לספור את הגידולים ולהשאים בתמיסת FTI ללא הגבלת זמן.ריאות של עכברים שהוחדרו בתאי קרצינומה של הגומלה. שורת תאים 4T1 מראה נקודות לבנות המעידות על גידולים. עכברים שהוחדרו ב-IRF8 בעל השפעה דומיננטית שלילית K79E מראים פוטנציאל מטאסטטי מוגבר של תאי הגידול.תמונות אלו מציגות אנליזה היסטולוגית של יעילות אימונותרפיה באמצעות העברה אדופטיבית של CTL. בעכברים עם גידולים שהוזרק להם תמיס סלין, נראו מספר גידולים שישה ימים מאוחר יותר, כפי שמסומן בחצים. לעומת זאת, בעכברים שהוזרקו להם תאי T ספציפיים לגידול, נראתה הפחתה במספר הגידולים באותו ניסוי.טיפול בדיו סין (India ink) מספק דרך פשוטה יותר למדידת היעילות של העברה מאמצת של תאי CTL. כאן, הפקעות הגידול הלבנות בריאות הנושאות גידולים מבדילות אותן בבירור מריאות שעברו בהצלחה העברה מאמצת של תאי CTL, וספירת הפקעות מאפשרת רמה של כימות שאינה אפשרית בבדיקה היסטולוגית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם את העכברים כדי להקל ולהבטיח הזרקות מדויקות יותר לווריד הזנב.לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את יעילות הטיפול באמצעות הליך פשוט זה לכימות גודל ומספר הגוממאים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

experimental-metastasis-ctl-adoptive-transfer-immunotherapy-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

ההתפשטות הגרורה של הסרטן היא הסיבה העיקרית למוות הקשורים לסרטן. אנו מספקים תיאור מעמיק של מתודולוגיה ניתוח ההישרדות שלנו להקמת מערכת "חולה-כמו" orthotopic מודל עכבר syngeneic לחקר המנגנונים של גרורות בגידולים מוצקים איבר.

&quot;מטופל כמו&quot; Orthotopic syngeneic עכבר הדגם של Hepatocellular Carcinoma גרורה

מודל גידול ראשוני orthotopic סרטן השד סר כירורגית של גידול ראשוני כדי להאריך את חיי עכבר כדי ליצור גרורות ספונטניות מתוארים. גידול הגידול ולהתפתחותו מנוטר לכמת ידי דימות פלואורסצנטי בלוציפראז.

במודל עכבר orthotopic של שד ספונטני סרטן גרור

היכולת של שיבוטים גרורתיים ליישב אתרים מרוחקים תלויה ביכולת ההתפשטות שלהם ו/או ביכולתם לשרוד במיקרו-סביבה המארחת ללא התפשטות משמעותית. כאן, אנו מציגים מודל של בעלי חיים המאפשר הדמיה כמותית של שני סוגי ההתיישבות בכבד על ידי שיבוטים גרורתיים.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

כאן, אנו מתארים מודל קסנוגרפט מורין הדומה מבחינה תפקודית למאגר Ommaya בחולים. פיתחנו את מורין אומאיה כדי לחקור טיפולים חדשניים למחלת לפטומינגיאל הקטלנית באופן אוניברסלי.

מודל קסנוגרפט של מורין אומאיה לחקר טיפול ישיר ממוקד במחלת לפטומינגיאל

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת גידול לאפיון לימפוציטים חודרים לגידולים שמקורם בגידול ובפריפריה במודל גידול בעכבר. מעקב ספציפי אחר זרם תאי מערכת החיסון שמקורם במקבל עם ציטומטריה של זרימה חושף את הדינמיקה של השינויים הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במהלך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות.

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.

מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי

פרוטוקול זה מתאר השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון. המודל משחזר מחלה גרורתית מתקדמת של סרטן המעי הגס והחלחולת ומאפשר הערכה של תרופות טיפוליות חדשות בתרחיש רלוונטי קלינית של גרורות ריאה וכבד.

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.

ניקוז גרורות בלוטות הלימפה מודל להערכת הדינמיקה של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך הגידול

אנו מתארים שיטה לניצול לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה להעברת תאים מאמצים. פרוטוקול זה נועד לאמת את הציטוטוקסיות הספציפית של TIL כנגד גידולים במודל עכברי סרטן הלבלב סינגני, ולספק תובנות לגבי התפתחות טיפולים תאיים מאמצים לסרטן הלבלב.

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

חקור את יעילות טיפול אימונותרפיה בהעברה אדופטיבית של תאי CTL ספציפיים לגידול בעכברים. השיטה כוללת השתלת תאי גידול ליצירת גרורות ריאה והדמיית גרורות בדיו הודי.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

גלה סרטונים נוספים