גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים תא-T

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את היעילות של אימונותרפיה להעברה מאמצת של תאי T ספציפיים לגידול in vivo. זה מושג תחילה על ידי השתלת תאי גידול באמצעות הזרקת וריד זנב רוחבי לעכברים על מנת ליצור גרורות ריאה. השלב השני של ההליך הוא טיפול בעכברים נושאי הגידול עם לימפוציטים ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול.

השלב האחרון הוא להשתמש בדיו ההודי כאמצעי להמחשה וכימות של גושי גידול. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את ה-CIE של טיפולים שונים באמצעות מדידת גודל הגידול וכימות מספר גושי הגידול. היי, שמי מרי צימרמן ואני חברה במעבדה של ד"ר קווין לו בקולג' הרפואי של ג'ורג'יה.

שלום, שמי Shelene Hu.אני סטודנטית שנה ב' ואני גם עובדת במעבדה של ד"ר לו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מסורתיות כמו עקומות הישרדות הוא שהליך זה הוא איכותי וכמותי כאחד. ההשלכה של הטכניקות יכולה להתרחב לטיפול בסרטן מכיוון שהיא מחקה אימונותרפיה מאמצת של תאי T בחולי סרטן אנושיים.

אז בואו נתחיל יום לפני זריקות תאי הגידול זרע בקבוק T 75 אחד עם עד אחד כפול 10 עד השביעי. CMS ארבעה תאים נפגשו ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI המכיל סרום של 10%. כדי להשיג תאי גידול הגדלים במהירות דוגרים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס ביום ההזרקה.

הסר את המדיום ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS, ואז קצור את תאי הגידול עם 0.05% טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. עצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI המכיל סרום של 10%. העבירו את התאים לצינור חרוטי.

סובב את התאים ב-1300 סל"ד בצנטריפוגת RT מאגדת Val למשך שלוש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את החטף, השהה מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של XHB Ss טרי לשטיפה. ואז סובב שוב והשהה באותו אופן.

ספרו את תאי הגידול על המו. ציטומטר. לדלל את התאים ב-HBSS כך שהתאים הנדרשים לכל הזרקה יושעו מחדש. בנפח כולל של 100 מיקרוליטר מחממים את עכברי B SEA בני שישה עד שמונה שבועות בכוס, טובלים במים חמים.

כדי להרחיב את וריד הזנב, הנח את העכבר במסנן וריד זנב על הספסל. השתמש במזרק מיקרוס כדי להזריק 100 מיקרוליטר של תאי גידול לווריד הזנב הרוחבי. השתמש בטכניקת ספיגה כדי למנוע זיהום לאחר ההזרקה.

השתמש בלחץ קל על מקום ההזרקה עד להפסקת הדימום. החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו לגידול לצמוח לשלב הרצוי. ביום ההעברה, פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש לימפוציטים ציטוטוקסיים מטוהרים או CTLs שהוכנו.

כמתואר בטקסט, העבירו את כל התאים מצלחת אחת לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואל תתנו לנפח לעלות על יותר משני שליש מהצינור. הכנס פיפטה פסטר סטרילית לצינור החרוטי ושכב הפרדת לימפוציטים. בינוני או LSM מתחת לתאים עד שהנפח הכולל מתקרב ל -14 מיליליטר.

היזהר לא להפריע לשכבות. צנטריפוגה 2000 סל"ד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אל תשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור לאחר הסיבוב, העבר את ה-CTL לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

הוסף HBSS לנפח של כ-10 מיליליטר. לשטוף. ספור את התאים מסתובבים ב-1300 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר השעו HBSS לצפיפות התאים הנדרשת להזרקות.

שמירה על הנפח הכולל להזרקה על 100 מיקרוליטר. השתמש באותה טכניקת הזרקת זנב כפי שנראה קודם לכן בסרטון זה. כדי להזריק את ה-CTL לעכברים נושאי גידול, החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו ל-CTLs לקיים אינטראקציה עם הגידול.

עכברים מוקרבים בדרך כלל לניתוח 14 עד 21 יום לאחר הטיפול ב-CTL. כדי לדמיין גרורות ריאה, הניחו עכבר שהוקרב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה ללא הפרעה לקנה הנשימה.

רססו את הצד הגחוני באתנול 70% החל מאמצע הבטן. השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך קו האמצע דרך כלוב הצלעות ולמעלה לכיוון בלוטות הרוק. חשוף את קנה הנשימה.

השתמש במלקחיים כדי להסיר רקמות המקיפות את קנה הנשימה. השחילו קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מתחת לקנה הנשימה המחזיק את הקצה ביד אחת. הרם בעדינות את קנה הנשימה כלפי מעלה והרחק מהגוף.

סובב את הרציף 180 מעלות. השתמש במזרק של 50 מיליליטר כדי להזריק דיו הודי לריאות דרך קנה הנשימה. נפחו לחלוטין את הריאות בדיו עד שתרגישו התנגדות חזקה.

השתמש במספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. החלק זוג מלקחיים מתחת לריאות והרם אותם מהעכבר. שוטפים את הריאות לזמן קצר בכוס מים של ליטר אחד במכסה אדים כימי.

העבירו את הריאות למרה מזכוכית המכילה חמישה מיליליטר של תמיסת FTI. רקמת הגידול תופיע כגושים לבנים על הריאות השחורות. לאחר מספר דקות, כעת ניתן לספור את הגידולים ולהתחיל בתמיסת FTI ללא הגבלת זמן. הנה.

ריאות לעכברים שעברו טרנספטציה עם קרצינומה של החלב. קו תאים 4 T 1 מראה כתמים לבנים המעידים על גידולים. עכברים שהועברו עם IRF שמונה שלילי דומיננטי חסין ל-K 79 E מראים את הפוטנציאל הגרורתי המוגבר של תאי הגידול.

תמונות אלה מציגות ניתוח היסטולוגי של יעילות אימונותרפיה העברה מאמצת CTL. עכברים נושאי גידול שהוזרקו להם מי מלח, הראו גידולים מרובים שישה ימים לאחר מכן שצוינו על ידי חיצים. לעומת זאת, עכברים שהוזרקו עם תאי T ספציפיים לגידול הראו ירידה בגידולים באותו ניסוי.

טיפול בדיו בהודו נותן דרך פשוטה יותר למדוד את היעילות של העברת אימוץ CTL. כאן גושי הגידול הלבנים על הריאות נושאות הגידול מבדילים אותם בבירור מריאות שעברו בהצלחה העברה מאמצת CTL וספירת הגושים מאפשרת מידה של כימות שאינה אפשרית בהיסטולוגיה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחמם את העכברים להזרקות קלות ומדויקות יותר לווריד הזנב.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את יעילות הטיפול באמצעות הליך פשוט זה לכימות גודל הגידול ומספריו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.