Name: Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד אקסופלזמה מעצב השת של חולדה בוגרת באמצעות חיתוך פאסיקולים וחשיפה למדיום היפוטוני. שיטה זו מאפשרת עשירת רכיבים אקסונליים לניתוח ביוכימי של תפקוד עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה מאפשר בידוד axoplasm עם צמצום של זיהום גליה רקמות וכלי דם. השיטה מניבה כ 70-100 axoplasm סך מיקרוגרם חלבון לכל one 8-10 חולדה הישנה שבוע Wistar. 1. לנתח עצבים sciatic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים שני עכברושים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. אשר למוות על ידי מישוש מחוסר דופק לפני תחילת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית באזור דיסקציה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור, השרירים להפריד ולבודד עצב השת באמצעות מספריים מלקחיים בזהירות מבלי לפגוע בכלי הדם. לנתח הן עצבים sciatic (כ 1.5 ס"מ כל אחת) מן החי כל לאסוף את כל ארבעת העצבים Eppendorf עם 500 μL PBS 0.2X + מעכבי, שמרה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פלחי החוצפה כלי פלסטיק המכילים לפחות 2 מ"ל PBS 0.2X מעכבי פרוטאז +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את epineurium מן העצבים באמצעות מלקחיים קנס כאמור היקף המשקפת. הפרד את fascicles בזהירות רבה עד שהם הופכים מעוננים מתחילים לצוף על פני השטח של פתרון. צעד זה צריך להיות מתורגל עד שהוא יכול להתבצע במהירות ובאופן מדויק (לא לוקח יותר מ 10 דקות לכל העצב). </li></ol> 2. , דגירה כביסה elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מופרדות fascicles לצינור Eppendorf טרי עם 500 μL של PBS 0.2X המכיל מעכבי פרוטאז עבור הדגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לפחות 3 פעמים עם 1 מ"ל של אותו למאגר ידי העברת fascicles מהצינור Eppendorf אל צינור Eppendorf ורועדת במשך 5 דקות לאחר ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את עודפי הנוזלים לשים את fascicles לתוך צינור חדש Eppendorf ריק ולאחר מכן להעביר את fascicles לצינור Eppendorf חדש עם 300 μL של PBS 1X המכיל מעכבי פרוטאז עבור הדגירה 20-30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 דקות ב XG 10,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant וחלבון ריכוז למדוד. זוהי הכנה axoplasm שלך. </li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Axoplasm המערבי כתם השוואת מבודדים בשיטה לסחוט ידנית עם דגימות axoplasm מבודד כמתואר בפרוטוקול זה. שים לב רמות נמוכות של אלבומין ו GFAP, המייצג חלבון בדם זיהומים תא גלייה, בהתאמה. לעומת זאת, טובולין B3 axonal מועשר לקראת זה, המעיד על רמה גבוהה של חלבונים axonal.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מנתח ביוכימיים ו proteomic אישרו כי הליך זה מפחית את זיהום תא בסרום גליה 3 לעומת השיטות שתוארו בעבר על ידי בידוד axoplasm לסחוט מכני 1. השתמשנו בפרוטוקול זה בידוד axoplasm לחקור dynein מבוססי איתות מדרדר לאחר פגיעה עצבית sciatic 2, מצפה שיהיה השירות בחקר של תהליכים רבים אחרים העצבים ההיקפית מבוגר, לרבות האקסון, גליה אינטראקציות 4.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר Wistar חולדות (80-10 שבועות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS 0.2X ו pbs 1X פתרונות המכילים מעכבי פרוטאז (Roshe) 2 טבליות לכל 50 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eppendorfs עבור 1.5 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלי פלסטיק 35 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים לנתח כולל: מספריים מלקחיים קנס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקפת שולחן אור </li></ul> נוגדנים עכבר אנטי GFAP שיבוט GA-5 היה מן סיגמא (G6171). הארנב נגד אלבומין היה מן Cedarlane (CLAG5140). אנטי טובולין עכבר β3 ו הארנב נגד gERK היו סיגמא (T2200 ו - M5670 בהתאמה).

axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

בידוד של הציטופלסמה axonal טהור (axoplasm) מתוך עצב היקפי הוא קריטי עבור מחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנחנו מדגימים ולתאר פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגרים המבוססת על הצעדים הבאים: (1) דיסקציה של fascicles עצב והפרדה של רקמות החיבור, (2) הדגירה של קטעים קצרים של fascicles העצב בינוני hypotonic לשחרר את המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים; ו (3) מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים. אפיון proteomic וביוכימיות של הכנה זו אישרה רמה גבוהה של העשרת עבור רכיבים axonal.

אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.

Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

בידוד של ציטופלזמה אקסונית טהורה (אקסופלזמה) מעצב היקפי הוא קריטי למחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנו ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ציטופלזמה אקסונלית או אקטופלזמה טהורה מעצב היקפי. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של העצב הסיאטי. השלב השני של הפרוצדורה הוא הסרת רקמה חיבורית מהעצב והפרדה של ה-sles.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא אינקובציה של מקטעים קצרים של סיבי עצב במדיום היפוטוני. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא אינקובציה בתמיסה איזוטונית, סנטריפוגציה וסינון. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות דרגת העשרה גבוהה של רכיבים אקסונליים באמצעות אנליזת western blot.שלום, שמי אילן ושמי מיי רוזנבאום. אנו מהמעבדה של פרופסור מייק פליי, מהמחלקה לביוכימיה במכון למדעים. היום נציג טכניקה חדשה של Oxy Opat Mesylation.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון OIS ידני באמצעות לחיצה של עצב פריפרי, הוא שההליך מקטין את זיהום הסרום והגליאה המגיעים לתכני האקסון. השתמשנו בטכניקה חדשה זו עבור מתילציה של op PLAs כדי לחקור retro signaling מבוסס D לאחר פגיעה בעצב הסיאטיק.בואו נתחיל. הניחו את אחת משתיים מחולדות הוויסטאר (Wistar) שעברו הרדמה ובעלות גיל של 8 עד 10 שבועות על צדה, על משטח ניתוח, כדי לאפשר גישה ישירה לחלק הדיסטלי של העצב הסיאטי (sciatic nerve). גלחו את העור במרכז הירך ונגבו ביסודיות עם 70% ethanol.השתמש במספריים כדי לגזור את העור מהירך. גזור בזהירות דרך השומן והרקמה החיבורית שבין השריר הדו-ראשי של הירך (femoral biceps) לשרירי העכוז השטחיים (superficial gluteal muscles). השתמש בפינצטה כדי להרים את האזור החשוף של עצב השייתן (sciatic nerve) ולהוציאו.הקטע שהוסר יהיה באורך של כ-1.5 סנטימטרים. העבר את העצב ל-500 microliters של 2X PBS קר מאוד עם מעכבי פרוטאז בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. שמור על המבחנה על קרח.חזור על הליך הניתוח בצד השני של החולדה ובשני הצדדים של חולדה שנייה. שרוט את תחתיתו של Petri dish באמצעות paster pipette ומלא אותו בשני מיליליטרים של 2X PBS בטמפרטורת החדר עם מעכבי פרוטאז.העבר עצב בודד לצלוחית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמש בפינצטה עדינה כדי להסיר את ה-epineurium מהעצב על ידי משיכה שלו והשלכו, כך שנותרו ה-fascicles בצלוחית. הפר בעדינות את ה-fascicles זה מזה ומקרקעית הצלוחית.התאים הבודדים יהפכו עכורים ויצופו על פני התמיסה. העבירו מיד את התאים שהופרדו למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה 500 µL של 0.2 X PBS עם מעכבי פרוטאז. שמרו את התאים על קרח.הפרידו ואספו את ה-sles מהחלק הנותר של עצב ה-sciatic שבמבחנה בזהירות. הסרת ה-epineurium והפרדת ה-sles לא אמורות לארוך יותר מ-10 דקות לכל עצב.הוצא את המבחנה המכילה את ה-SLES המופרד מהקרח. דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לשחרר מיאלין ומבנים לא-אקסונליים. שטוף את ה-sles בכל שלב של השטיפה.השתמשו בפינצטה כדי להרים בעדינות את ה-sles ולהעביר אותם למבחנה חדשה המכילה מיליליטר אחד של 2X PB s עם מעכבי פרוטאז. נערו את המבחנה על נדנדה למשך חמש דקות. שטפו את ה-SLES בדרך זו שלוש פעמים לאחר השטיפה.העבירו את ה-SLES לשפופרת אפנדור (Eppendorf) נקייה וריקה כדי להסיר עודפי נוזלים, ולאחר מכן העבירו לשפופרת המכילה 300 µL של 1x PBS עם מעכבי פרוטאז; דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. לצורך אלוציה של ה-opsm, ריכוזי מלח גבוהים יותר מפריעים להליכים פרוטאומיים עוקבים. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להשקיע את הרקמה ושאריות התאים, ושאבו את הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת אפנדור נקייה.את הנוזל העליון שהתקבל. עליו להיות צלול. השתמש בספקטרופוטומטר למדידת ריכוז החלבון.יש לקבל תנובה של 200 עד 250 micrograms של חלבון. יש לאחסן את תכשיר הפלזמה באליקווטים בטמפרטורה של 80- degrees Celsius למשך עד שישה חודשים. יש להימנע ממחזורי הפשרה וההקפאה.להלן Western blot המשווה בין op plasm שבודד בשיטת הלחיצה הידנית לבין דגימות opsm שבודדו כפי שמוצג בפרוטוקול זה. שימו לב לרמות המופחתות של albumin ו-GFAP, המייצגות זיהומים של חלבוני דם ותאי גליה, בהתאמה. לעומת זאת, axonal tubulin beta three מועשר בתכשיר זה, מה שמעיד על רמה גבוהה של חלבוני אקסונים.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מנתחים את העצב הסיאטי וכיצד מפרידים את ה-Paco כראוי. זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בגלל הפשטות של ניתוח תוצאות התנהגותיות חזקים, היצרות כרונית של עצב השת הוא אחד מראש יחסני במודלים של בעלי חיים של כאב נוירופתי. תוך 24 שעות לאחר הניתוח, רגישות יתר לכאב הוא הקים ניתן למדוד כמותית באמצעות פריי פון aesthesiometer (מבחן מכני) ו מטר כאבים plantar (מבחן תרמית).

היצרות כרונית של העצב Sciatic ואת רגישות יתר לכאב בדיקה אצל חולדות

סרטון זה מתאר את הבידוד והטיפוח של תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של עכבר. תאים מבודדים עוברים תרבית במדיה ספציפית. תאי Schwann מבודדים באמצעות עיכול דיפרנציאלי והיצמדות. לאחר מכן הם מועברים לכיסויים חוץ-תאיים מצופים מטריצה לצורך התקשרות והתפשטות.

בידוד תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של העכבר

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי Schwann מסיבי עצב סיאטיים של עכבר.

הפרדה מגנטית של תאי Schwann מעצבים סיאטיים של עכבר

סרטון זה מדגים הקלטה של סיב יחיד של הולכה עצבית של סיבי C בחולדות. חולדה מורדמת נחתכת כדי לחשוף את העצב הסיאטי, המספק אספקה חושית ומוטורית לגפיים התחתונות. לאחר מכן נחשפים סיבי ה-C הבודדים. גירוי חשמלי ניתן באמצעות אלקטרודות גירוי המושתלות בכף הרגל, ותגובה נרשמת מסיב עצב בודד.

In vivo הקלטה של סיב יחיד של סיבי C של עצב סיאטי בחולדות

כאן, אנו מציגים טכניקת in vivo להעברת גנים לתאי שוואן (SCs) בעצב הסיאטי של המכרסם. טכניקה פשוטה זו שימושית לחקירת מנגנוני איתות המעורבים בפיתוח ותחזוקה של SCs מיאלינים.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.

השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

שיטה זו מאפשרת הקלטה של הכוח של התכווצויות עוויתות וטלטוניות ופוטנציאל פעולה בשלושה סוגים של יחידות מנוע בשריר גסטרוקנמיוס חולדה. הבידוד הפונקציונלי של יחידה מוטורית אחת מושרה על ידי גירוי חשמלי של האקסון.

בידוד פונקציונלי של יחידות מנוע יחיד של שריר גסטרו-קסטרונומיוס חולדה

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה של רקמת עצב סיאטית שלמה של חולדה לגירוי אלקטרופיזיולוגי ex vivo ורישום באמבט מלוחים בעל שני תאים מווסתים סביבתית.

הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

למדו פרוטוקול לבידוד אקסופלזמה מעצב השת של חולדה בוגרת באמצעות חיתוך פאסיקולים וחשיפה למדיום היפוטוני. שיטה זו מאפשרת עשירת רכיבים אקסונליים לניתוח ביוכימי של תפקוד עצבי.

Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

גלה סרטונים נוספים