Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת
September 24th, 2010
אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ציטופלזמה אקסונלית טהורה או אקטופלזמה מהעצב ההיקפי. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של העצב הסיאטי. השלב השני של ההליך הוא הסרת רקמת חיבור מהעצב והפרדת הזנים.
השלב השלישי של ההליך הוא דגירה של קטעים קצרים של סלעי עצב במדיום היפוטוני. השלב האחרון של ההליך הוא דגירה בצנטריפוגה איזוטונית של תמיסה ו-opsm milian. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות רמה גבוהה של העשרה לרכיבים אקסונליים על ידי ניתוח כתמים מערביים.
היי, שמי אני, אל ואני יכול רוזנבאום. אנחנו מהמעבדה של פרופסור מייק פ. מחלקת העבודה של המכון למדע המבוסס על כימיה ביולוגית. היום אנו הולכים לייצג טכניקה חדשה של Oxy Opat Mesylation.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון סחיטה ידנית OIS של עצב היקפי. כלומר, הליך זה מפחית את הסרום וזיהום הגלוס מגיע לתוכן אקסונלי. השתמשנו בטכניקה חדשה זו למתילציה של op PLAs כדי לחקור איתות רטרו מבוסס D לאחר פגיעה בעצב הסיאטי.
אז בואו נתחיל. הניחו אחת משתי חולדות וויסטאר בנות שמונה עד עשרה שבועות שהומתו על צדה על מחצלת ניתוח להתקרבות ישירה לחלק הדיסטלי של העצב הסיאטי. גלחו את העור באמצע הירך והחליפו היטב עם אתנול 70%.
השתמש במספריים כדי לחתוך את העור מהירך. חותכים בזהירות את השומן ורקמת החיבור בין שרירי הירך לשרירי העכוז השטחיים. השתמש במלקחיים כדי להרים את האזור החשוף של העצב הסיאטי ולהסיר אותו.
החלק שהוסר יהיה באורך של כ -1.5 סנטימטרים. העבירו את העצב ל-500 מיקרוליטר של PBS קר כקרח 2X עם מעכבי פרוטאז בצינור מיקרו צנטריפוגה. שמור את הצינור על קרח.
חזור על הליך הדיסקציה בצד השני של החולדה ומשני צידי החולדה השנייה. מגרדים את תחתית צלחת פטרי עם פיפטה פסטר וממלאים אותה בשני מיליליטר טמפרטורת החדר. נקודה שנייה X PBS עם מעכבי פרוטאז.
העבירו עצב בודד לצלחת מתחת למיקרוסקופ הניתוח. השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את ה-epi nearium מהעצב על ידי משיכתו והשלכתו, והשארת הקלילים בצלחת. הפרד בזהירות את האמצעים זה מזה ואת תחתית המנה.
פאלים בודדים יהפכו מעוננים ויצופו על פני התמיסה. העבירו מיד את הפלים המופרדים לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 500 מיקרוליטר של 0.2 X PB s עם מעכבי פרוטאז. שמור את הסולות על קרח.
הפרד ואסוף סלים מהסיאטיק שנותר בצינור עם תרגול. הסרת האפינוריום והפרדת הזפים. אמור לקחת לא יותר מ-10 דקות לכל עצב.
הסר את הצינור המכיל את ה-SLES המופרדים מהקרח. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לשחרר מבנים לא אקסונליים של מיאלין וכינים. שוטפים את הסלים לכל שטיפה.
השתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את הסלס ולהעביר אותם לצינור טרי המכיל מיליליטר אחד של 2X PB s עם מעכבי פרוטאז. לנער את הצינור על נדנדה למשך חמש דקות. שטפו את ה-SLES בדרך זו שלוש פעמים לאחר הכביסה.
העבירו את ה-SLES לצינור איינור ריק טרי כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן העבירו לצינור המכיל 300 מיקרוליטר של XPBS אחד עם מעכבי פרוטאוס מודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. כדי לנטרל את ה-opsm, ריכוזי מלח גבוהים יותר מפריעים להליכי פרוטאומיקה נוספים. צנטריפוגה את החוברת ב -10,000 גבינה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הרקמה ופסולת התאים מהסופרנטנט לתוך צינור איינור נקי.
הסופרנטנט השיג. צריך להיות ברור. השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז החלבון.
יש להשיג תשואה של 200 עד 250 מיקרוגרם חלבון. אחסן את תכשיר ה-op plasm במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. הימנע ממחזורי הפשרה והקפאה.
להלן בלוק מערבי המשווה פלזמת אופלסמה מבודדת בשיטת הסחיטה הידנית עם דגימות opsm מבודדות כפי שמוצג בפרוטוקול זה. שימו לב לרמות המופחתות של אלבומין ו-GFAP המייצגים זיהום חלבון בדם ותאי גליה בהתאמה. לעומת זאת, טובולין אקסונלי בטא שלוש מועשר בתכשיר זה ומצביע על רמה גבוהה של חלבונים אקסונליים.
לאחר צפייה בכל הסרטון הזה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח עצב סאטי וכיצד להפריד את פאקו כראוי. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד אקסופלזמה מהעצב הסיאטי של חולדה בוגרת. השיטה כוללת ניתוק של צרורות עצבים ודגירה במדיום היפוטוני כדי לשחרר ביעילות מיאלין ולפרק מבנים שאינם אקסונליים, מה שמוביל לחילוץ חומר עשיר באקסונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- מחקר אקסונלי
רקע
- בידוד של הציטופלזמה האקסונלית הוא קריטי לחקר התפקוד הנוירוני.
- העצב הסיאטי משמש כמודל למחקרי עצבים היקפיים.
- הבנת הרכיבים האקסונליים יכולה לסייע במחקר נוירולוגי.
- שיטות קודמות עשויות שלא להניב חומר אקסונלי טהור.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול אמין לבידוד אקסופלזמה.
- לשפר את טוהר הציטופלזמה האקסונלית לצורך ניתוח נוסף.
- לאפשר את המחקר של רכיבים אקסונליים באמצעות טכניקות ביוכימיות.
שיטות ששימשו
- ניתוק העצב הסיאטי כדי לגשת לצרורות העצבים.
- הסרת רקמת חיבור המקיפה את העצב.
- דגירה של קטעי עצב במדיום היפוטוני.
- צנטריפוגה ודגירה נוספת בתמיסה איזוטונית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מצליח לבודד ציטופלזמה אקסונלית.
- ניתוח Western blot מאשר העשרה גבוהה של רכיבים אקסונליים.
- התוצאות מדגימות את יעילות השיטה.
- מודגשים יישומים פוטנציאליים בחקר הביולוגיה האקסונלית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חזקה לבידוד אקסופלזמה.
- ניתן להשתמש בה במחקרים שונים הקשורים לתפקוד נוירוני.
- הממצאים תורמים להבנת המבנה והתפקוד האקסונלי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
