Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת
24 בספטמבר 2010
אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ציטופלזמה אקסונלית או אקטופלזמה טהורה מעצב היקפי. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של העצב הסיאטי. השלב השני של הפרוצדורה הוא הסרת רקמה חיבורית מהעצב והפרדה של ה-sles.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא אינקובציה של מקטעים קצרים של סיבי עצב במדיום היפוטוני. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא אינקובציה בתמיסה איזוטונית, סנטריפוגציה וסינון. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות דרגת העשרה גבוהה של רכיבים אקסונליים באמצעות אנליזת western blot.
שלום, שמי אילן ושמי מיי רוזנבאום. אנו מהמעבדה של פרופסור מייק פליי, מהמחלקה לביוכימיה במכון למדעים. היום נציג טכניקה חדשה של Oxy Opat Mesylation.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון OIS ידני באמצעות לחיצה של עצב פריפרי, הוא שההליך מקטין את זיהום הסרום והגליאה המגיעים לתכני האקסון. השתמשנו בטכניקה חדשה זו עבור מתילציה של op PLAs כדי לחקור retro signaling מבוסס D לאחר פגיעה בעצב הסיאטיק.
בואו נתחיל. הניחו את אחת משתיים מחולדות הוויסטאר (Wistar) שעברו הרדמה ובעלות גיל של 8 עד 10 שבועות על צדה, על משטח ניתוח, כדי לאפשר גישה ישירה לחלק הדיסטלי של העצב הסיאטי (sciatic nerve). גלחו את העור במרכז הירך ונגבו ביסודיות עם 70% ethanol.
השתמש במספריים כדי לגזור את העור מהירך. גזור בזהירות דרך השומן והרקמה החיבורית שבין השריר הדו-ראשי של הירך (femoral biceps) לשרירי העכוז השטחיים (superficial gluteal muscles). השתמש בפינצטה כדי להרים את האזור החשוף של עצב השייתן (sciatic nerve) ולהוציאו.
הקטע שהוסר יהיה באורך של כ-1.5 סנטימטרים. העבר את העצב ל-500 microliters של 2X PBS קר מאוד עם מעכבי פרוטאז בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. שמור על המבחנה על קרח.
חזור על הליך הניתוח בצד השני של החולדה ובשני הצדדים של חולדה שנייה. שרוט את תחתיתו של Petri dish באמצעות paster pipette ומלא אותו בשני מיליליטרים של 2X PBS בטמפרטורת החדר עם מעכבי פרוטאז.
העבר עצב בודד לצלוחית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמש בפינצטה עדינה כדי להסיר את ה-epineurium מהעצב על ידי משיכה שלו והשלכו, כך שנותרו ה-fascicles בצלוחית. הפר בעדינות את ה-fascicles זה מזה ומקרקעית הצלוחית.
התאים הבודדים יהפכו עכורים ויצופו על פני התמיסה. העבירו מיד את התאים שהופרדו למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה 500 µL של 0.2 X PBS עם מעכבי פרוטאז. שמרו את התאים על קרח.
הפרידו ואספו את ה-sles מהחלק הנותר של עצב ה-sciatic שבמבחנה בזהירות. הסרת ה-epineurium והפרדת ה-sles לא אמורות לארוך יותר מ-10 דקות לכל עצב.
הוצא את המבחנה המכילה את ה-SLES המופרד מהקרח. דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לשחרר מיאלין ומבנים לא-אקסונליים. שטוף את ה-sles בכל שלב של השטיפה.
השתמשו בפינצטה כדי להרים בעדינות את ה-sles ולהעביר אותם למבחנה חדשה המכילה מיליליטר אחד של 2X PB s עם מעכבי פרוטאז. נערו את המבחנה על נדנדה למשך חמש דקות. שטפו את ה-SLES בדרך זו שלוש פעמים לאחר השטיפה.
העבירו את ה-SLES לשפופרת אפנדור (Eppendorf) נקייה וריקה כדי להסיר עודפי נוזלים, ולאחר מכן העבירו לשפופרת המכילה 300 µL של 1x PBS עם מעכבי פרוטאז; דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. לצורך אלוציה של ה-opsm, ריכוזי מלח גבוהים יותר מפריעים להליכים פרוטאומיים עוקבים. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להשקיע את הרקמה ושאריות התאים, ושאבו את הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת אפנדור נקייה.
את הנוזל העליון שהתקבל. עליו להיות צלול. השתמש בספקטרופוטומטר למדידת ריכוז החלבון.
יש לקבל תנובה של 200 עד 250 micrograms של חלבון. יש לאחסן את תכשיר הפלזמה באליקווטים בטמפרטורה של 80- degrees Celsius למשך עד שישה חודשים. יש להימנע ממחזורי הפשרה וההקפאה.
להלן Western blot המשווה בין op plasm שבודד בשיטת הלחיצה הידנית לבין דגימות opsm שבודדו כפי שמוצג בפרוטוקול זה. שימו לב לרמות המופחתות של albumin ו-GFAP, המייצגות זיהומים של חלבוני דם ותאי גליה, בהתאמה. לעומת זאת, axonal tubulin beta three מועשר בתכשיר זה, מה שמעיד על רמה גבוהה של חלבוני אקסונים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מנתחים את העצב הסיאטי וכיצד מפרידים את ה-Paco כראוי. זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד אקסופלזמה מהעצב הסיאטי של חולדה בוגרת. השיטה כוללת דיסקציה של פסיקולומי עצב ואינקובציה בתווך היפוטוני כדי לשחרר ביעילות מילין ולהמיס מבנים שאינם אקסונליים, מה שמוביל להפקה של חומר עשיר באקסונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר אקסונלי
רקע
- בידוד של ציטופלזמה אקסונלית הוא קריטי לחקר התפקוד הנוירונלי.
- העצב הסיאטי משמש כמודל למחקרים של עצבים פריפריאליים.
- הבנת הרכיבים האקסונליים יכולה לסייע במחקר נוירולוגי.
- שיטות קודמות עשויות שלא להניב חומר אקסונלי טהור.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן לבידוד אקסופלסמה (axoplasm).
- שיפור רמת הניקיון של הציטופלסמה האקסונלית לצורך ניתוחים נוספים.
- הנגשת חקר הרכיבים האקסונליים באמצעות טכניקות ביוכימיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נתיחה של העצב הסיאטיק (sciatic nerve) כדי להגיע לאבונדות העצב.
- הסרה של רקמה חיבורית המקיפה את העצב.
- דגירה של מקטעי עצב בתווך היפוטוני.
- סבוב בנצנטריפוגה ולאחריו דגירה בתמיסה איזוטונית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבודד בהצלחה ציטופלזמה אקסונלית.
- ניתוח Western blot מאשר העשרה גבוהה של רכיבים אקסונליים.
- התוצאות מדגימות את יעילות השיטה.
- מודגשים יישומים פוטנציאליים בחקר ביולוגיה אקסונלית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חסונה לבידוד אקסופלזמה.
- ניתן להשתמש בה במחקרים שונים הקשורים לתפקוד נוירונלי.
- הממצאים תורמים להבנת המבנה והתפקוד של האקסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של ציטופלזמה אקסונית טהורה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך התיקוף של מטרות בתוכניות למחלות נוירודגנרטיביות. פרוטוקול זה תומך באמינות חיזויית על ידי הפחתת רעש ביולוגי ממזהמים שאינם אקסוניים במודלים של עצבים פריפריים. הוא מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מסלולי איתות אקסוניים הרלוונטיים לגילוי טיפולים נוירותרפויטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הרכב החלבונים באקסונים כדי להבהיר היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מפחית זיהום של תאי גליה וסרום המסיק את אותות המעורבות של המטרה.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף תפקודי של המטרה באמצעות העשרה של רכיבים אקסונליים כגון tubulin beta three.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר ליזאטים סטנדרטיים עשירים באקסונים המתאימים לסריקה ביוכימית.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה ספקטרופוטומטרית של ריכוז החלבון לצורך נורמליזציה.
- שחזור: תנובה עקבית של 200-250 micrograms תומכת בסריקה אמינה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופקליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פגיעה בעצב היקפי ואיתות רטרוגרדי לאחר טראומה לעצב הסיאטיק.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני של מטרות ביולוגיות אקסונליות.
- החלטות מותאמות סיכון: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על בסיס מודולציה של מטרות אקסונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולטורים אקסונליים.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבירור מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד ציטופלזמה אקסונלית לצורך פרופיל פרוטאומי.
- סריקה: מאפשר הכנה של ליזאטים סטנדרטיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: ניתוח Western blot מספק מדדים כמותיים להעשרה אקסונלית.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרי סיגנלינג רטרוגרדי הרלוונטיים למודלים של פגיעה בעצבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להפחתת סיכונים בבדיקת מטרות בעצבים פריפריאליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות העשרה גבוהה של רכיבים אקסונליים והפחתה של אותות מזהמים.
- ערך תפעולי: שלבי דיסקציה ואינקובציה סטנדרטיים מבטיחים הדירות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: תעדוף טוב יותר של מטרות על ידי מזעור של תוצאות חיוביות שגויות מחלבונים גליאליים או מחלבוני דם.
- השפעה על הפורטפוליו: קידום של מועמדים לטיפול נוירותרפויטי המותאם לסיכון, בהסתמך על קריאות אקסונליות נקיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של עצבים פריפריים ובטכניקה סטרילית.
- נדרשת תשתית הכוללת צנטריפוגה, ספקטרופוטומטר ומעכבי פרוטאז.
- נדרשת סטנדרטיזציה של תזמון האינקובציה ההיפוטונית בין המבצעים השונים.
- שיקולי התאמה עבור סוגי עצבים אחרים או מינים שאינם עצב הסיאטיק של חולדה.
- מגבלה מעשית: משך הפרוצדורה מגביל יישום בתפוקה גבוהה ללא אוטומציה.
