ויזואליזציה של שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי של תאים בודדים על ידי הגברה אות Edu

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג ולהמחיש שכפול M-T-D-N-A בנוירונים מתורבתים. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של נוירונים עם EDU האנלוגי של תימידין למשך שעתיים עד 24 שעות. השלב השני של ההליך הוא תיוג ה-EDU המכיל אלקין עם אזיד אורגון ירוק פלואורסצנטי 4 88 באמצעות תגובה קוולנטית מזורזת נחושת.

השלב האחרון של ההליך הוא להגביר את האות הירוק של האורגון עם שלב הגברת אות ארמיד על מנת לדמיין את ה-EDU ששולב ב-DNA MT שסונתז לאחרונה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שכפול DNA של MT בתאים תת-תאיים ספציפיים של נוירונים באמצעות שילוב של כימיה של EDU קליקה והגברת אות מוח הדמעות לאחר מכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תיוג BRDU, הוא שתיוג EDU קל ומתון יותר, ומאפשר צביעה אימונו-פלואורסצנטית נוספת של סמנים עצביים.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בוויסות מספר המיטוכונדריה, כגון כיצד נוירונים פוגשים עומסי אנרגיה משתנים בתאים התת-תאיים שלהם, כולל גופי תאים, אקסונים, דנדריטים ומסוף סינפטי. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות מרובות המבוססות על מיטוכונדריה, כולל נוירופתיה וניוון עצבי. אך חשוב מכך, ניתן ליישם אותו גם במערכות אחרות שבהן שינויים בעותק ה-DNA המיטוכונדריאלי ככל הנראה עומדים בבסיס הפתוגנזה של מצב המחלה, כולל רעילות לתרופות, סרטן והזדקנות.

סרטון זה ידגים כיצד לתייג את ה-DNA המיטוכונדריאלי החדש שסונתז בקיצור M-T-D-N-A בנוירונים של גנגליון שורש גבי שגודלו על פתקי כיסוי זכוכית סטריליים של 12 מילימטר. בצלחת תרבית של 24 בארות יש לדלל את המלאי של 10 מילי-מולר של חמישה אתנול שני דוקסי אורידין, בקיצור EDU מערכת הבדיקה של Clicka EDO Microplate אחד עד 100 במדיום תרבית עבור מלאי XEDU של 10. לאחר מכן מוסיפים את מלאי 10 XEDU ישירות למדיום בכל באר מדגרים את הנוירונים המטופלים למשך שעתיים עד 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במכסה אדים.

מקבעים את הנוירונים ב-2% אלדהיד פרפורם למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף פעמיים ב-XPBS אחד למשך שתיים עד חמש דקות בכל כביסה. ניתן לאחסן את הנוירונים הקבועים ב-XPBS טרי בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש.

הכן תא לח כמתואר בטקסט הנלווה. השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר 28 החלקות כיסוי קבועות, כולל בקרות EDU חיוביות ושליליות ליריעות של פרפורם הידרופובי M בתוך החדר הלח. יש למרוח מחדש 200 עד 300 מיקרוליטר של XPBS אחד כדי לכסות את פני השטח של כל החלקת כיסוי.

הכן את ערכת הבדיקה Click it כמתואר בטקסט וביצרנים והוראות לתיוג DNA מיטוכונדריאלי ב-75 עד 80 מיקרוליטר של תמיסה חדירה המכילה 0.1% טריטון X ב-XPBS אחד לכל כיסוי, החליק, כסה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השתמש בפיפטה להעברת נורה עם קצה קצה של 200 מיקרוליטר צמוד לקצה. כדי להסיר בעדינות את הנוזל מבלי לאבד תאים.

השתמש בפיפטת נורה כדי להציף בעדינות את המכסה. החלק עם 200 עד 300 מיקרוליטר של XPBS אחד כדי לשטוף היטב את התמיסה הקודמת. שטפו כל תלוש כיסוי פעמיים.

פיפטה 75 עד 80 מיקרוליטר של מי חמצן טריים 1% ב-XPBS אחד על כל החלקת כיסוי. דגירה מכוסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להרוות פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. שטפו פעמיים עם XPBS אחד כמו לפני הכינו טרי את קוקטייל הקליק בתגובה כמפורט בטקסט הנלווה.

מזלפים אותו למעלה ולמטה כדי לערבב. אין לתקן את הנוירונים עם 75 עד 80 מיקרוליטר של לחיצה על קיבוע EDU לכל החלקת כיסוי לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. במהלך הדגירה של הפוסט-פיקס, יש לדלל את קוקטייל התגובה בנפח שווה של קיבוע EDU קליקה.

הוסף את קוקטייל התגובה לכל כיסוי החלקה כדי להגן מפני אור ולדגור אותו בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. הסר בעדינות את שטיפת קוקטייל התגובה פעמיים עם מאגר חסימה אחד מדולל תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. בדוק אם יש כתמים ירוקים של אורגון בגרעינים לאחר השלמת צביעת ה-EDU.

התחל את הגברת אות הטרמיטים או TSA הוסף תמיסת בלוק TSA של 1% לכל החלקת כיסוי ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. סובב בקצרה את מלאי הנוגדנים המצומד של צנון הסוס הירוק פרוקסידאז הוכן שעתיים עד 24 שעות לפני ה-TSA, לדלל את הנוגדן העיקרי 1 עד 300 בתמיסת חסימת TSA ולהפוך או לפיפטה כדי לערבב מערבולת קשר כוונון. מוסיפים 75 מיקרוליטר לכל כיסוי, מחליקים ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, שטפו שלוש פעמים עם XPBS אחד בטמפרטורת החדר. דגרו את החלקות הכיסוי בכביסה הסופית למשך 30 עד 60 דקות נוספות כדי להבטיח שהנוגדן הראשוני הלא קשור יוסר הכן את תגובת ה-IDE בהתאם לחלק הטקסט של פרוטוקול זה מיד לפני השימוש.

דגרו את החלקות הכיסוי בתגובת IDE למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם דגירה אחת של XPBS בכביסה הסופית למשך 30 עד 60 דקות כמו קודם לכן במיקרוסקופ. בדוק אם יש תושבת תיוג DNA MT נוירונים מוכתמים בהצלחה על שקופיות זכוכית עם מדיום הרכבה ANTIFA המכיל DPI המוצגים כאן הם תמונות ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות מייצגות של נוירונים גנגליון שורש גבי עובריים ובוגרים המשמשים בדרך כלל לניתוח.

דיאגרמות סכמטיות אלו מייצגות את הנוהל לתיוג EDU ב-MTD NA עם אות פלואורסצנטי ירוק. תאי נוירובלסטומה F 11 פעילים מיטוטית משמשים כבקרה חיובית וממחישים את דפוס התיוג של EDU ששולב ב-DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי בתמונות פלואורסצנטיות מייצגות אלה המונחות על גבי שדה בהיר. אותות הניקוב הירוקים מראים את אות ה-EDU המוגבר המשולב ב-M-D-D-N-A שסונתז לאחרונה של נוירוני גנגליון שורש גב עובריים ובוגרים כאחד.

הליך תיוג ה-EDU מאפשר צביעה אימונו-פלואורסצנטית לאחר מכן של סמנים עצביים כגון נוירופילמנט באדום. דיאגרמות סכמטיות אלו מייצגות את הנוהל לתיוג EDU ו-MTD NA עם אות פלואורסצנטי אדום. תאי נוירובלסטומה F 11 פעילים מיטוטית משמשים כבקרה חיובית וממחישים את דפוס התיוג של EDU ששולב ב-DNA הגרעיני והמיטוכונדריאלי.

תרשים סכמטי זה מייצג את הנוהל לתיוג BRDU ב-M-T-D-N-A שסונתז לאחרונה עם אות פלואורסצנטי ירוק או אדום. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפעיל בקרות באמצעות תאים פעילים מיטוטית על מנת לבדוק את תיוג ה-EDU וגרעיני התאים המוצלחים לפני שתמשיך לשלבי ההגברה כדי לדמיין תיוג DNA MT בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונופלואורסצנציה סטנדרטית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד סינתזת DNA של מיטוכונדריה מווסתת בתת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים או תאים עצביים בגלל התפתחותה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את ויסות המספר המיטוכונדריאלי במודלים של תרבית הן של פיזיולוגיה נורמלית והן של מודלים של תרבית המדמים מחלה לקויה.

מצבים נוירולוגיים.