גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לקבוע את לוקליזציה הכניעה של קינאז מחזור תא גרעיני רגיל ולאחר מכן לנתח כיצד הלוקליזציה המיטוכונדריאלית שלו משפיעה על התקדמות מחזור התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר המיטוכונדריאלי, כגון כיצד הגרעין מתקשר עם המיטוכונדריה במהלך מחזור התא. על ידי תיוג חלבונים עם רצף מוביל מיטוכונדריה, אנו יכולים לנצל באופן ספציפי ביטויי יתר בחלבון במיטוכונדריה, כך שנוכל לחקור את התפקודים הספציפיים שלהם למיטוכונדריה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מיקוד המיטוכונדריה של חלבונים מסוימים, ניתן ליישם אותה גם על אברונים אחרים, כגון הגרעין, ER, גולגי וליזוזום. לאחר תרבית, הומוגניזציה וכדוריות של תאים בהתאם לפרוטוקול הטקסט, העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה. וצנטריפוגה את הדגימה בחום של 7, 000 גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש ב-200 מיקרוליטר של מאגר IBC קר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה, ולחלק את ההומוגנאט לשני מאגרים. צנטריפוגה את הדגימות שוב בטמפרטורה של 7, 000 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. וחזור על הכביסה.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים לאחד הכדורים, ואחסן את הליזאט ב-80 מעלות צלזיוס לצורך חיסון. כדי לבצע מיצוי נתרן פחמתי עם הגלולה השנייה כדי להפריד בין חלבונים מסיסים וקשורים לממברנה, הוסף 250 מיקרוליטר של 0.1 נתרן פחמתי מולרי pH 11.0, ודגירה על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה בחום של 100, 000 גרם למשך 20 דקות.

לאחר מכן אוספים את הסופרנטנט ומוסיפים נפח שווה של חומצה טרייה, 20% טריכלורואצטית כדי לזרז את החלבונים. שמור על קרח למשך 30 דקות. בינתיים, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים לגלולה ולסוניקט לפי פרוטוקול הטקסט לפני האחסון ב-80 מעלות צלזיוס לצורך חיסון.

לאחר הדגירה של TCA של 30 דקות, צנטריפוגה את התגובה ב-15,000 גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט, ואז השתמשו ב-80 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר בידוד שברים מיטוכונדריאלים מהתאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הפרד את השברים המיטוכונדריאלים ל-10 חלקים שווים.

גלולה את הדגימות ב -7, 000 גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השתמש ב-30 מיקרוליטר של מגוון ריכוזים של חוצצי סוכרוז היפוטוניים עם או בלי טריפסין, כדי להמיס כל כדור. ולדגור על קרח למשך 30 דקות.

הוסף 3 מיקרוליטר של PMSF 10 מילי-מולרי לבקבוקונים המכילים טריפסין כדי לעצור את עיכול הטריפסין. ולדגור על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות בחום של 14, 000 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

ולהעביר את הסופרנטנט לתוך צינור חדש. כדי לליז את הגלולה, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאים. סוניקציה של הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט ואחסן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבנות וקטורי ציקליןB-1 Cdk-1 מתויגים במיטוכונדריה ממוקדי GFP/RFP, לשכפל את רצף המיקוד של המיטוכונדריה מהקודמן של תת-יחידה 8A של ציטוכרום-c אוקסידאז אנושי, ולמסגר עם מסוף ה-n של GFP או RFP באתרי Nhe1 ו-bAmH1, של pEGFP-N1 או pERFP-N1, תוך שימוש בטכניקות שיבוט מולקולאריות סטנדרטיות. באמצעות הפריימרים המתוארים בפרוטוקול הטקסט, הגבירו את הגנים Cdk1 ו-cyclinB1 בהתאם לטכניקות סטנדרטיות. לאחר מכן השתמש ב-BamH1 כדי לעכל את מוצרי ה-PCR.

הפעל את התגובות על ג'ל אגרוז 1%, לפני השימוש בסכין גילוח כדי לחתוך את שברי ה-DNA בגודל הנכון. לאחר מכן השתמש בערכת מיצוי ג'ל כדי לטהר את ה-DNA. לאחר מכן, עכל מיקרוגרם אחד של פלסמידים MTS-pEGFP-N1 ו-MTS-pERFP-N1 עם מיקרוליטר אחד של BamH1 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר של פוספטאז אלקליין במעי השוק ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הפעלת מוצרי העיכול על ג'ל אגרוז 1% וטיהור ה- DNA כפי שתואר זה עתה, הגדר תגובת קשירה באמצעות הריאגנטים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן דגרו את התגובה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הפוך תאים מוכשרים e. coli dH5-alpha עם 10 מיקרוליטר מתערובת הקשירה. ולגדל את החיידקים על צלחות של אגר LB בתוספת 10 מיליגרם למיליליטר של קנמיצין ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה.

למחרת, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לבחור מושבה מצלחת. והכנס את הקצה לצינור המכיל 5 מיליליטר של קנמיצין LB. דגרו את התרבית למשך הלילה ולמחרת בבוקר, השתמשו בערכת הכנה מיני לפי פרוטוקול הטקסט כדי לבודד את הפלסמיד.

כדי להעביר תאי MCF-10A הגדלים באופן אקספוננציאלי, השתמש בפלסמידים Cdk1 או cyclinB-1 כדי להכין ריאגנט טרנספקציה של פלסמיד ביחס של 1:2 ל-100 מיקרוליטר של סרום ומדיום נטול אנטיביוטיקה. יש להעביר את התאים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. צבעו והדמיינו את המיטוכונדריה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כדי לבצע מיון תאים, העבירו 2 פעמים 10 לתאים החמישיים עם הווקטורים הרצויים בצלחת של 6 בארות באמצעות יחס של 1:2 של DNA למגיב טרנפיקציה שהוכן ב-2.5 מיליליטר של סרום ומדיום נטול אנטיביוטיקה. לאחר דגירה של הטרנספקציה במשך 48 שעות, השתמש בזרימה ציטומטרית כדי למיין בשידור חי את התאים המבטאים ביציבות את חלבוני Cdk-1 המתויגים ב-GFP ו-clyclinB1 המתויגים ב-RFP על פי פרוטוקול הטקסט. כדי למדוד את אורך מחזור התא באמצעות בדיקת ציטומטריית זרימה של תיוג EdU, זרעים מיינו תאים בצלחות של 6 בארות בצפיפות של 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים לבאר.

לאחר דגירה של לילה, הוסיפו EdU למדיום התרבית בריכוז סופי של 25 מיקרומולר ודגרו למשך שעה נוספת. לאחר מכן, במרווחים של שעתיים, השתמש ב-1% BSA ב-500 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף באר אחת של תאים. ואוספים בצינור של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את התאים ב -350 גרם למשך 5 דקות. ואז השליכו את הסופרנטנט. עקור את הגלולה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע.

מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמש במיליליטר אחד של 1% BSA ב-PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן השתמש ב-0.5 מיליליטר של אתנול 70% כדי לתקן את התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

בעת ביצוע תיוג EdU עם תאים שהועברו עם חלבונים מתויגים GFP ו-RFP, זה קריטי להרוות את האותות הפלואורסצנטיים מ-GFP ו-RFP. כדי להשיג זאת, אנו מוסיפים שלב נוסף של קיבוע תאים בן לילה באמצעות 70% אתנול. למחרת, לאחר שטיפה וחדירה של התאים על פי פרוטוקול הטקסט, הוסיפו 0.5 מיליליטר קוקטייל תגובה לכל צינור וערבבו היטב.

לאחר הדגירה בחושך ושטיפה נוספת, השתמש ב-50 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד או PI ב-1% BSA PBS כדי להכתים את ה-DNA. נתח את התאים על ידי זרימה ציטומטרית כדי לעקוב אחר האוכלוסייה החיובית ל-EdU. הצג תרשים נקודות מפוזר של תאים המסומנים ב-EdU צבועים בתכולת DNA ו-EdU.

השתמש בערוץ APC עבור Alexa 647 EdU תוך שימוש במסנן 670 של 30 פס-פס עם כל האור קיים, פחות מ-685 ננומטר פוגע במסנן זה ובערוץ phycoerythrin עבור PI עם מסנן 581 15-פס לפניו, כאשר כל האור הקיים פחות מ-600 ננומטר פוגע במסנן זה. עם אסטרטגיית שער סטנדרטית לרכישה, שרטט אזור FSC לפי אזור SSC למורפולוגיה, ואחריו PI על ידי Alexa 647 EdU לצביעה של תאים. רשום נתונים עבור כל הצינורות בזה אחר זה, ורכש 10,000 אירועים לדגימה.

באיור זה, חלבון המטריצה המיטוכונדריאלית Hsp60 וחלבון החלל הבין-ממברני Timm13 שימשו כסמני לוקליזציה של כניעה. בדומה ל-Hsp60, אך בניגוד ל-Timm13, ציקליןB1 ו-Cdk1 היו מוגנים מפני עיכול טריפסין, מה שמצביע על כך שהם מתמקמים במטריצה המיטוכונדריאלית. כפי שמוצג כאן, על ידי כתמים מערביים של השברים המיטוכונדריאלים המבודדים, תוך שימוש במבנים ציקליןB1 ו-Cdk-1 המתויגים MTS ו-GFP, הושג ביטוי יתר של ציקליןB1 ו/או Cdk-1 במיטוכונדריה.

באמצעות בדיקת מרדף דופק של EdU, הוכח שתאי שלב S מסומנים התקדמו דרך שלב G2M והופיעו בשלב G1 במהירות של 4 שעות בתאים המבטאים ציקלין מיטוכונדריאלי מסוג פרא B1 Cdk-1. בהשוואה ל-6 שעות, בתאים שעברו טרנספטציה עם בקרת וקטור או ציקלין B1 Cdk-1 מוטנטי, מה שמצביע על כך ששיפור של ציקלין המיטוכונדריאלי B1 Cdk-1 מאיץ את התקדמות מחזור התא. בעקבות הליך זה, ניתן למדוד שיטות אחרות כמו ייצור ATP מיטוכונדריאלי, צריכת חמצן, פוטנציאל ממברנה ומיני חמצן תגובתיים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז מחזור התא Cdk-1 משנה את הנשימה המיטוכונדריאלית ואת תפוקת האנרגיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את הלוקליזציה המיטוכונדריאלית ואת הפונקציות הספציפיות למיטוכונדריה של קינאז גרעיני.