ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA
27 באוקטובר 2011
DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ויזואלית שכיפול DNA ברמה של מולקולה בודדת. התחילו בשילוב של אנלוגים של נוקלאוטידים מחולגנים לתוך DNA שסונתז לאחרונה. בתאים חיים, העבירו את התאים עם ה-DNA המסומן למסך מיקרוסקופ.
לאחר מכן מניחים את התאים ופורסים את ה-DNA על גבי זכוכית המיקרוסקופ. צביעה אימונו-פלואורסצנטית עוקבת של סיבי ה-DNA וניתוח של תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית יכולים להאיר את הדינמיקה הגלובלית של מזלגי השכפול, ובכך לאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על תוכנית השכפול הכוללת. במהלך השנים האחרונות פותחו גרסאות שונות של טכניקות DNA fiber Fluor כדי להדמיז את תנועתם של מזלגי שכפול בודדים בתוך תאים חיים.
ניסוי in vivo זה בתאי DT 40 שאתם עומדים לצפות בו כעת ניתן להשלים תוך יום אחד, והוא דורש רק ציוד מעבדה כללי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. את הפרוצדורה תדגים ד"ר רבקה שוואב, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. כדי לסמן תאי DT 40 in vivo, התחילו עם תרבית בצמיחה אקספוננציאלית. הוסיפו סימון IDU לריכוז סופי של 25 micromolar וערבבו את תרחיף התאים.
דגרו את התאים למשך 20 דקות ב-38 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר מכן, הוסיפו את תגית ה-CLDU לריכוז סופי של 250 µM. ערבבו ודגרו את תרחיף התאים.
כעת שטפו את תאי ה-DT 40 ב-PBS קר מאוד. השעיו את משקעי התאים ב-PBS קר ושמרו את התאים המסומנים על קרח. טפטפו שני µL מתליית התאים על קצה אחד של למסלדת זכוכית והניחו לייבוש באוויר עד שנפח הטיפה יקטן משמעותית אך לא יתייבש לחלוטין.
כעת, הוסיפו שבעה µL של תמיסת ליסיס של סיבים (fiber lysis solution) על תרחוף התאים, וערבבו בעדינות את התמיסות על ידי ערבוב עם טיפ של פיפטה; דגרו למשך שתי דקות. לאחר מכן, הטו את השקופיות בזווית של 15 מעלות כדי לאפשר לסיבים להתפשט לאורך השקופית. ברגע שתמיסת הסיבים הגיעה לתחתית השקופית, הניחו אותה באופן אופקי לייבוש באוויר.
בשלב זה, קו עמום ודק אמור להיות נראה לאורך העגלה. סמנו את תחילת הסיבים המתוחים באמצעות עיפרון. ראשית, טבלו את העגלות בתערובת של מתנול לחומצה אצטית ביחס של שלושה לواحد למשך 10 דקות.
שטפו את השקופיות במים מזוקקים, ולאחר מכן טבלו אותן בחומצה כלורית בריכוז 2.5 molar למשך 80 דקות. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. ספגו את שאריות ה-PBS בעזרת נייר סופג.
לאחר מכן, הניחו את השקופיות במנח אופקי. כעת, טפטפו 5%BSA ב-PBS על גבי כל שקופית, הניחו זכוכית כיסוי והדגירו למשך 20 דקות. הזריזו בעדינות את זכוכית הכיסוי במורד השקופית.
הסר את עודפי ה-BSA באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, טפטף 50 µL מתמיסת הנוגדן הראשוני anti-BRDU על כל שקופית.
כסו את הדגימה בזכוכית כיסוי והדגירו בתא לח באמצעות לחות למשך שעתיים. לאחר הסרת זכוכיות הכיסוי, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. מרחו 50 µL של תמיסת הנוגדן המשני, הניחו זכוכיות כיסוי, והגנו על השקופיות מאור.
לאחר מכן, הדגירו למשך שעה אחת. הסירו את כיסויות הזכוכית ושטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. לבסוף, הוסיפו טיפה של תמיסת קיבוע vector shield לכל שקופית.
לחץ בעדינות על זכוכית כיסוי והסר נוזלים עודפים מסביבה. בעזרת נייר סופג, אטום את זכוכית הכיסוי באמצעות לק שקוף והשאר לייבוש באוויר. שמור את השקופיות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.
הניחו טיפה של שמן אימרסיה על נחלילה קרוב לסימון העיפרון והתחילו באיתור הסיבים. התרחקו מהצרור המרכזי כדי למצוא אזורים שבהם הסיבים מופרדים בבירור זה מזה. בניסוי טיפוסי, בחרו תמונות המשתמשות בערוץ צבע אחד בלבד כדי למנוע הטיות.
לאחר מכן, צלמו כ-10 תמונות של כל דגימה. נעו לאורך השקופית כדי לצלם תמונות שונות, שכן אזור אחד בשקופית עשוי שלא לספק אורכי סיב מייצגים או מבני שכפול. ייבאו את התמונות לתוכנה לניתוח תמונות.
מדדו את אורכן של 100 נתיבי סיבים או ספרו בין 150 ל-200 מבני רפליקציה שונים. טכניקת סיבי הסימון הכפול מאפשרת להבחין בין מבני רפליקציה שונים. ניתן להדמות DNA ששוכפל לאחרונה כקווים של אנלוגים של נוקלאוטידים המסומנים בנוגדנים.
כאן, מזלג שכפול המאריך באופן רציף מיוצג על ידי אותות אדומים וירוקים סמוכים. ניתן לחלק אירועי התחלה חדשים למקורות שהופעלו בזמן שהתאים דגרו עם הסימון הראשון, ולמקורות שהופעלו במהלך הדגירה עם הסימון השני. הראשונים מורכבים מאותות ירוקים, אדומים וירוקים סמוכים, והשנייה מקו ירוק בלבד.
אירועי סיום מתבטאים בצבעים אדום וירוק סמוכים. אותות אדומים מפוזרים. מקורות מורכבים ממקורות רצופים ומאותות סיום.
בהתאם למערך הניסוי, מזלגות שנעצרו או קרסו יכולים להיות מוגדרים כסימון אדום בלבד או כקו אדום, שאחריו מקטע ירוק קצר. בניסוי זה, לתאי DT 40 מסוג הפרא יש מהירות מזלג ממוצעת של 0.4 microns per minute. עם 63% מזלגות פעילים, 10% מקורות שכפול, 16% מזלגות שנעצרו, 8% סיומות, ו-3% סיבים משולבים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדגים ולנתח את הדינמיקה של מזלג השכפול בתאי DT 40. דבר זה יספק לכם כלי חיוני לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לוויזואליזציה של רפליקציית DNA ברמת השמולקולה בתאי DT40, מערכת גנטית מודלית של חולייתנים. הטכניקה מאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרי סינתזת DNA במהלך שלב S.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- תאי DT40 מהווים מודל רב-עוצמה לחקר תפקוד חלבונים.
- הבנת הדינמיקה של שכפול ה-DNA חיונית להבנה של היציבות הגנטית.
- טכניקות של מולקולה בודדת מספקות מידע מפורט על תהליכי השכפול.
- שיטות קודמות התפתחו כדי לאפשר ויזואליזציה של מזלגות שכפול בודדים.
מטרת המחקר
- להצגת דינמיקה של שכפול DNA בתאי DT40 חיים.
- לניתוח השפעתם של פרמטרים שונים על סינתזת DNA.
- לאספקת פרוטוקול ניסויי פשוט עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הטמעה של אנלוגים של נוקלאוטידים מהלוגנתיים לתוך DNA.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי DNA לצורך ויזואליזציה.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לניתוח הדינמיקה של מזלג השכפול.
- ניתוח כמותי של אורכי הסיבים ומבני השכפול.
תוצאות עיקריות
- מהירות מזלג השכפול הממוצעת בתאי DT40 מסוג בר (wild type) היא 0.4 microns per minute.
- 63% מהמזלגות נמצאים בתהליך שכפול פעיל, כאשר 10% הם נקודות התחלה (origins) ו-16% הם מזלגות שנעצרו (stalled forks).
- כמו כן, אופיינו אירועי סיום השכפול וסיבים משובצים.
- הטכניקה מאפשרת הבחנה בין מבני שכפול שונים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות חיוניות לגבי הדינמיקה של שכפול ה-DNA.
- ניתן להשתמש בה כדי לחקור פגמים בשכפול ה-DNA.
- הפרוטוקול נגיש וניתן להשלמתו תוך יום אחד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של מולקולה בודדת של שכפול DNA בתאי DT40 מאפשרת חקירה מדויקת של דינמיקת מזלג השכפול, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. גישה זו מספקת תובנות כמותיות ואיכותניות לגבי מנגנוני יציבות הגנום, ומספקת מידע ישיר לתיקוף מטרות ולניתוח מסלולים. זמן התגובה המהיר והנגישות של השיטה מקלים על שילובה בצינורי גילוי בעתקת תפוקה גבוהה לצורך מיון תיקי פיתוח וקידום מותאם סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של מהירות ומבנה מזלג השכפול לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין מזלגים פעילים, תקועים ומסתיים במערכות שעברו מודיפיקציה גנטית.
- מסייע להבהרת מסלולים על ידי כימות צפיפות נקודות מוצא השכפול ואירועי סיום מזלגים.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך תיעדוף מטרות המשפיעות על יציבות הגנום.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות מתוּקפות מבוססות תאי DT40 לסריקת תרכובות המשך המכוונות לתהליכי רפליקציה.
- מספק תוצרי פלט סטנדרטיים, הדירים וכמותיים עבור פיתוח בדיקות.
- מאפשר ניתוח בר-הרחבה של דינמיקת רפליקציה על פני רקעים גנטיים שונים.
- תומך בהערכה מהימנה של מולקולות מועמדות המשפיעות על סינתזת DNA.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלה על ידי מידול של אי-יציבות גנומית הקשורה לתהליכי tumorigenesis.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני עבור מטרות של תחזוקת הגנום.
- מסייע בקבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכונים על ידי כימות של פגמים בשכפול במודלים הנדסים.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה עבור פיתוח ביומרקרים תרגומיים במסלולי יציבות הגנום.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
טכניקה זו של סיבי DNA ממוקמת בתוך הרצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המולקולה המובילה, ומאפשרת בדיקת היפותזות ותיקוף מנגנוני לפני מחקרים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של התנהגות מזלג השכפול בתאים שעברו עריכה גנטית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה (assay-ready) עבור דינמיקת שכפול, התומכים בתהליכי הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדדים מדידים כגון מהירות המזלג, צפיפות נקודות מוצא ותדירות מבנים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של שכפול לבין אי-יציבות גנומית הרלוונטית למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי מודלים גנטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרים על תפקודי גנים ומנגנוני תרכובות בתאי חולייתנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר על יציבות הגנום.
- ערך תפעולי: מספק ניתוח מולקולה בודדת סטנדרטי, הניתן לשחזור ובניסולם, באמצעות תשתית מעבדה כללית.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) ותיעדוף יעיל של יעדי תחזוקת הגנום מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים ובניתביליות בין תוכניות עבור נכסים המכוונים לשכפול.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח כמותי של תמונות.
- נחושה גישה לציוד מעבדה כללי ולמיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולים של רכישת תמונות ומדידת מסלולים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של תאי DT40 שעברו עריכה גנטית או טיפול בתרכובות.
- מוגבל למערכות שבהן מתיחה וסימון של סיבי DNA ברמה של מולקולה בודדת הם ישימים.
