Name: ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד טכניקת סיב DNA לויזואליזציה של שכפול DNA ברמת מולקולה יחידה בתאי DT40. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דינמיקת מזלגות השכפול וחקר פגמים בשכפול הגנומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ט Helleday וד&quot;ר א Petermann לעזרה עם הטכניקה סיבים, כמו גם אנשי המעבדה לדיון מועיל. WN נתמך על ידי עמיתי מחקר בכיר הבינלאומי של האגודה הבינלאומית לחקר הסרטן ועל ידי הוועדה הפולנית הממלכתית עבור מענק המחקר המדעי (N301 165,935).

השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום הבא: שוואב ואח', EMBO ג', 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 תא תרבות חומרים: בסרום שור עוברית (FBS), עוף בסרום, פניצילין / סטרפטומיצין, 2-mercaptoethanol, RPMI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התרבות התא בינוני: להוסיף FBS 7%, עוף בסרום 3%, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -10 מיקרומטר 2-mercaptoethanol עד בינוני RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DT40 התאים גדלים צלוחיות תרבות סטרילי התא ב 38 ° C ו 5% CO 2 בתוך חממה humidified. פיצול תאים מדי יום צפיפות של 5 x 10 5 תאים / מ"ל 6. </li></ol> 2. תיוג בשנת vivo חומרים: IdU, CldU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של פתרונות אנלוגים נוקלאוטיד: להמיס IdU עד 5 מ"מ ו - 2.5 מ"מ CldU בינוני. מחממים שתי פתרונות בקצרה עד 60 ° C ו מערבולת עד אנלוגי נוקלאוטידיםUES מתמוססים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף IdU לריכוז סופי של 25 מיקרומטר עד גדל באופן אקספוננציאלי DT40 תאים לערבב את ההשעיה תא היטב. דגירה התאים למשך 20 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם התווית הראשונה, להוסיף CldU לריכוז סופי של 250 מיקרומטר ולטפל תאים כפי שמתואר בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם קרח קר PBS ו resuspend אותם בריכוז של 7.5 x 10 5 תאים / מ"ל בקור PBS. שמור את התאים שכותרתו על הקרח. </li></ol> ההליך המתואר תיוג הוא רק הצעה והוא יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על עיצוב ניסיוני. 3. Cell ו-DNA תמוגה מתפשטת חומרים: שקופיות זכוכית, תמוגה פתרון סיבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון תמוגה סיבים: 50 mM EDTA ו - SDS 0.5% ב 200 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 Pipet פתרון μl תמוגה על גבי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה לערבב את הפתרונות. דגירה של 2 דקות תמוגה התא כדי להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיה שקופיות ° 15 על מנת לאפשר הסיבים להתפשט לאורך השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון סיבים הגיע לתחתית המגלשה, למקם אותו אופקית אוויר יבש. לאחר ייבוש, קו דק, אטום צריך להיות גלוי לאורך השקופית. בשלב זה, תחילת סיבים נמתח יש לסמן בעיפרון כמו אחרי מכתים הקו לא יהיה גלוי יותר. סימן זה יהיה מאוחר לעזור לאתר את סיבי מתחת למיקרוסקופ. </li></ol> 4. Immunofluorescence מכתים חומרים: מתנול, חומצה אצטית, HCl, BSA 5% ב-PBS, צנצנת מכתים, אנטי BrdU (העכבר) נוגדן,אנטי BrdU (עכברוש) נוגדנים, אנטי עכבר כבשים Cy3 נוגדן, אנטי עכברוש עז אלקסה נוגדן 488 פלואוריד, בינוני Vectashield הרכבה, coverslips, לק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות לטבול מתנול / חומצה אצטית (03:01) בצנצנת מכתים ו דגירה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות מזוקקים H 2 O, לטבול אז HCl 2.5 M עבור 80 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות מתוך הצנצנת מכתים ולאסוף PBS עודף עם מגבת נייר. מניחים את השקופיות אופקית BSA pipet 5% על גבי שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם coverslip להפיץ את BSA באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים העיקרי BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:25 אנטי BrdU (עכבר) ו 1:400 אנטי BrdU (חולדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את coverslip מעדנות שקופיות הזכוכית כדי להסיר אותו. אין להפעיל כוח אם להחליק כיסוי במקלות לשקופית. שקופית ניתן rehydrated ב PBS עד coverslip הופך רפויד ניתן להסיר בקלות. איסוף עודפי BSA עם מגבת נייר במקום שקופיות אופקית. 50 Pipet μl של הפתרון נוגדן ראשוני על כל שקופית. מכסים שוב עם coverslip להפיץ את הפתרון נוגדנים באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את נוגדנים משני BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:500 כבשים אנטי עכבר Cy3 ו 1:400 עז אנטי עכברוש אלקסה פלואוריד 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 50 μl של הפתרון נוגדנים משני כמתואר עבור נוגדנים ראשוניים. הגנו על שקופיות אור דגירה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של המדיום Vectashield גובר על כל שקופית ולהחיל coverslip. לחץ בעדינות על coverslips ולהסיר את הנוזלים העודפים מסביב עם מגבת נייר. חותם coverslips שקוף עם מסמר פוליס שעות ולתת להם יבש. אחסן את השקופיות ב -20 ° C. </li></ol> 5. תמונה הרכישה חומרים: מצלמה פלואורסצנטי, מיקרוסקופ מניחים טיפת שמן טבילה לשקופית קרוב כדי לסמן את העיפרון ולהתחיל באיתור סיבים. בדרך כלל, יש צרור סיבים הראשי, אבל סיבים אלה הם הסתבכו מדי ולא ניתן לנתח מאוחר יותר. להתרחק צרור הראשי כדי למצוא אזורים שבהם סיבים מופרדים בבירור זה מזה (איור 2). היינו לבחור תמונות רק באמצעות ערוץ אחד צבע כדי למנוע הטיה. לאחר מכן, היינו לוקחים כ 10 תמונות של כל קו הזמן, נקודת ריכוז או התא. עם זאת, מספר התמונות תלוי איך סיבים רבים ניתן לספור על כל תמונה. תתקדמי השקופית כדי לקחת את התמונות השונות, כמו אזור אחד של שקופית לא יכול לספק אורכי סיב נציג או שכפול מבנים. 6. ניתוח נתונים "Jove_content"&gt; חומרים: ניתוח תמונה תוכנית, למשל ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ייבוא ​​תמונות לתוך תוכנית ניתוח התמונה. מדוד את אורכי של קטעי סיבים ו / או לספור את המבנים שכפול שונים (איור 3). רק לספור סיבים אשר גלויים לעין ואשר לא להאריך מעבר לקצה של התמונה. אנחנו בדרך כלל למדוד את אורך של כ 100 סיבים לספור 150-200 מבנים שכפול והיינו חוזרים ניסויים בודדים לפחות שלוש פעמים. 7. נציג תוצאות: ה-DNA משוכפל חדש ניתן דמיינו כקווים של נוגדן הנקרא אנלוגים נוקלאוטיד. בניסויים שלנו מזלג מתמשך מיוצג אותות אדום וירוק סמוך (איור 3). פרוטוקול תיוג כפול גם מאפשר לנו להגדיר ארבע כיתות העיקריים של שכפול מבנים: 1) אירועים חדשים ייזום ניתן divid עורך אל המקורות כי ירו בעוד התאים הודגרו עם התווית הראשונה המקורות כי ירו במהלך הדגירה עם התווית השנייה. הראשון מורכב ירוק אדום ירוק אותות השכנות השנייה של קו ירוק בלבד. 2) אירועים סיום להתבטא אדום ירוק אדום אותות סמוכים. 3) מקורות וביניהם אתרים בגנום עם מקורות צפופים. אתרים אלה כוללים מקורות ברציפות אותות סיום. 4) בהתאם לעיצוב הניסוי, נתקע / מזלגות התמוטט יכול להיות מוגדר כאיתות רק 7 אדום או קו אדום ואחריו בדרכי ירוק קצר 8,9. שימוש בתנאים המתוארים כאן, תאים מסוג בר DT40 יש מזלג מהירות ממוצעת של 0.4 מיקרומטר / min. אנחנו יכולים לזהות כ 63% מזלגות מתמשך, מקורותיה 10%, מזלגות נתקע 16% (שטחים רק אדום), הפסקות 8% סיבים שזורים 3%. יור 1 "/&gt; . איור 1 (א) בצד השמאלי של הקריקטורה מתארת ​​את השלב הראשון של ההליך תיוג DNA: הוספת IdU אל DT40 התאים גדל באופן אקספוננציאלי מוביל את אנלוגי נוקלאוטיד להיות משולב בקלות לתוך המוביל מסונתז החדש ואת מפגרת גדילי דנ"א. זה יכול להיות דמיינו באמצעות נוגדן ספציפי, יופיע קו אדום כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. כתוצאה מכך, הליך אותו הוא חזר עם CldU כפי שמוצג בצד ימין של הדמות. לאחר הדגרה עם אנלוגי נוקלאוטידים השני, מזלג פעיל יהיה גלוי כמו בדרכי אדום ירוק הסמוך. אורך סיב ממוצע הוא יחסי זמן הדגירה של אנלוגים של נוקלאוטידים. (ב) דנ"א DT40 תאים lysed נמתח על ידי כוח הכבידה לשקופית מיקרוסקופ ואת אנלוגים נוקלאוטיד משולבים הם דמיינו ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי. igure 2 "/&gt; באיור 2. תמונה הקרינה נציג מראה סיבים בר DT40 תאים סוג שכותרתו לאחר מכן במשך 20 דקות כל אחד עם IdU ו CldU. רוב הסיבים מופרדים היטב אחד מהשני ולכן יכול להיות מנותח בקלות. הבר לבן מייצג 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> . איור 3 הטכניקה תיוג פעמיים סיבים מאפשר להבחין בין מבנים שכפול שונים; 1 - מזלגות שכפול פעיל, 2 - אתרים חדשים של שכפול הדנ"א (ירי מקורות חדשים), 3 - הפסקות מזלג (שני מזלגות מתכנסים), 4 - סיבים שזורים (אתרים של מקורות צפופים) ו 5 - מזלגות נתקע (אות רק אדום).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מתארים שיטה המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ&quot;א בשלב S-ברמה מולקולה בודדת. בעשר השנים האחרונות, גרסאות שונות של הטכניקה סיב DNA fluorography שפותחו כדי לחזות את תנועת מזלגות שכפול בודדים בתוך תאים חיים. פרמטר קריטי כל הטכניקות הללו היא הליך המשמש כדי להשיג את הטוב ביותר האפשרי מתיחה של ה-DNA על משטחי זכוכית מתן היטב מופרדים סיבי ה-DNA. צעד חיוני כדי להשיג את זה הזמן הדגירה של ההשעיה תא בשקופית מיקרוסקופ, כמו גם זמן תמוגה. פרמטרים אלה תלויים זרימת האוויר ואת הטמפרטורה במעבדה מסוימת, יש לקבוע באופן אמפירי. החלק המעשי של הניסוי סיב ה-DNA נעשה בדרך כלל בתוך יום אחד. עם זאת, רכישת תמונה ניתוח שלאחר מכן הוא יותר זמן רב ודורש תרגול. פרוטוקול תיוג יכול להיות המודעהapted לענות על בעיות מדעיות שונות: באמצעות סוכן המפריע שכפול במהלך תיוג את הדופק second מפקחת התארכות מזלג / השתהות בתגובה ללחץ replicative. בתרחיש זה, את התווית הראשונה לא צריך להיות דהוי כמו נוקלאוטיד השני הוא הוסיף עודף. לחלופין, תרופות המעכבות שכפול ניתן להשתמש בשילוב או רק לאחר תוספת של התווית הראשונה. זה דורש את התווית הראשונה את התרופה להסירו לפני אנלוגי נוקלאוטידים השני הוא מיושם. הליך זה מאפשר לקבוע את החשיבות של גורמים שונים לתקן את ה-DNA על יציבות replicative מזלג / התאוששות בתנאים של לחץ replicative (מזלג כלומר השתהות ו / או קריסה). ראויים לציון, ניתוח מפורט יותר של פרטי התוכנית שכפול ה-DNA יכול להתבצע תוך שימוש גישות חלופיות שילוב סריקות ה-DNA ואת הקרינה הכלאה באתרה. זה לעומת זאת, היא טכנית יותר מאתגרת ומחייבת expenאלימה עם ציוד. היכולת לנתח איכותית וכמותית פרטי שכפול הדנ&quot;א מספק כלי הכרחי לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA עצמו, כמו גם את המסלולים, כי לדכא יציבות גנומית הקשורים מזלגות שכפול. אין ספק, assay זה יהיה עוד יותר לעזור לשפוך אור על מנגנוני תיקון, שכפול ה-DNA בתיווך המאפשרים לתאים נורמליים להגיב / להסתגל לשינויים סביבתיים, כמו גם כמה תאים סרטניים לנצל מנגנונים אלה להתנגד רעילות של תרופות מיקוד מזלגות שכפול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> עוברית זהב בסרום שור (FBS) </td><td> PAA </td><td> ת 15-151 </td><td></td></tr><tr><td> עוף בסרום </td><td> סיגמא </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-כלורו-2&#39;-deoxy-uridine (CldU) </td><td> סיגמא </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי תלושי No1 </td><td> מדעי המעבדה suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield בינוני הרכבה </td><td> H-1000-Vector מעבדה </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן Anti-BrdU (עכבר) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן Anti-BrdU (חולדה) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> כבשים אנטי עכבר Cy3 </td><td> סיגמא </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכברוש עז אלקסה פלואוריד 488 נוגדן </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של שכפול ה-dna של dt40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-dna

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

שמירה על יציבות מזלג השכפול הוא בעל חשיבות עליונה לחלוקת תאים לשמר חיוניות ולמנוע מחלות. התהליכים המעורבים לא רק להבטיח שכפול הגנום נאמן מול נזק לדנ&quot;א אנדוגני אקסוגני, אלא גם למנוע אי יציבות גנומית, גורם סיבתי מוכר התפתחות הגידול. כאן, אנו מתארים מיקרוסקופיה מבוססי פלואורסצנציה פשוטה וחסכונית שיטה לחזות שכפול הדנ&quot;א בקו B-cell העופות DT40. קו זה התא מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את תפקוד החלבון in vivo על ידי גנטיקה הפוכה בתאים חוליות 1. Fluorography DNA הסיבים DT40 תאים חסר גן מסוים מאפשר להבהיר את הפונקציה של המוצר הזה גנים שכפול דנ&quot;א יציבות הגנום. שיטות מסורתיות כדי לנתח את הדינמיקה מזלג שכפול תאים חוליות להסתמך על מדידת קצב הכוללת של סינתזת דנ&quot;א אוכלוסייה של הדופק שכותרתו תאים. זוהי גישה כמותית אינו מאפשר ניתוח איכותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזה של DNA. לעומת זאת, קצב התנועה של מזלגות פעיל ניתן בעקבות ישירות כאשר באמצעות סיב DNA טכניקה 2-4. בגישה זו, ה-DNA המתהווה מתויג in vivo על ידי שילוב של נוקלאוטידים הלוגניים (איור 1A). לאחר מכן, סיבים בודדים נמתחים לשקופית מיקרוסקופ, ו שכפול ה-DNA קטעי שכותרתו מגואלות נוגדנים ספציפיים דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1B). ייזום של שכפול, כמו גם כיווניות מזלג נקבעת על ידי שימוש רצופות של שני אנלוגים שונה אחרת. יתר על כן, הגישה תיוג כפול מאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת ה-DNA בשלב-S, כלומר שכפול מבנים כגון מזלגות שוטף נתקע, מוצא צפיפות שכפול, כמו גם הפסקות מזלג. לבסוף, את הליך הניסוי ניתן להשיגעורך תוך יום, ודורש רק ציוד מעבדה כללי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ&quot;א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

שמירה על יציבות מזלג השכפול היא בעלת חשיבות עליונה עבור תאים המתחלקים, וזאת כדי לשמר את חיוניותם ולמנוע מחלות. התהליכים המעורבים אינם...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ויזואלית שכיפול DNA ברמה של מולקולה בודדת. התחילו בשילוב של אנלוגים של נוקלאוטידים מחולגנים לתוך DNA שסונתז לאחרונה. בתאים חיים, העבירו את התאים עם ה-DNA המסומן למסך מיקרוסקופ.לאחר מכן מניחים את התאים ופורסים את ה-DNA על גבי זכוכית המיקרוסקופ. צביעה אימונו-פלואורסצנטית עוקבת של סיבי ה-DNA וניתוח של תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית יכולים להאיר את הדינמיקה הגלובלית של מזלגי השכפול, ובכך לאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על תוכנית השכפול הכוללת. במהלך השנים האחרונות פותחו גרסאות שונות של טכניקות DNA fiber Fluor כדי להדמיז את תנועתם של מזלגי שכפול בודדים בתוך תאים חיים.ניסוי in vivo זה בתאי DT 40 שאתם עומדים לצפות בו כעת ניתן להשלים תוך יום אחד, והוא דורש רק ציוד מעבדה כללי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. את הפרוצדורה תדגים ד"ר רבקה שוואב, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. כדי לסמן תאי DT 40 in vivo, התחילו עם תרבית בצמיחה אקספוננציאלית. הוסיפו סימון IDU לריכוז סופי של 25 micromolar וערבבו את תרחיף התאים.דגרו את התאים למשך 20 דקות ב-38 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר מכן, הוסיפו את תגית ה-CLDU לריכוז סופי של 250 µM. ערבבו ודגרו את תרחיף התאים.כעת שטפו את תאי ה-DT 40 ב-PBS קר מאוד. השעיו את משקעי התאים ב-PBS קר ושמרו את התאים המסומנים על קרח. טפטפו שני µL מתליית התאים על קצה אחד של למסלדת זכוכית והניחו לייבוש באוויר עד שנפח הטיפה יקטן משמעותית אך לא יתייבש לחלוטין.כעת, הוסיפו שבעה µL של תמיסת ליסיס של סיבים (fiber lysis solution) על תרחוף התאים, וערבבו בעדינות את התמיסות על ידי ערבוב עם טיפ של פיפטה; דגרו למשך שתי דקות. לאחר מכן, הטו את השקופיות בזווית של 15 מעלות כדי לאפשר לסיבים להתפשט לאורך השקופית. ברגע שתמיסת הסיבים הגיעה לתחתית השקופית, הניחו אותה באופן אופקי לייבוש באוויר.בשלב זה, קו עמום ודק אמור להיות נראה לאורך העגלה. סמנו את תחילת הסיבים המתוחים באמצעות עיפרון. ראשית, טבלו את העגלות בתערובת של מתנול לחומצה אצטית ביחס של שלושה לواحد למשך 10 דקות.שטפו את השקופיות במים מזוקקים, ולאחר מכן טבלו אותן בחומצה כלורית בריכוז 2.5 molar למשך 80 דקות. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. ספגו את שאריות ה-PBS בעזרת נייר סופג.לאחר מכן, הניחו את השקופיות במנח אופקי. כעת, טפטפו 5%BSA ב-PBS על גבי כל שקופית, הניחו זכוכית כיסוי והדגירו למשך 20 דקות. הזריזו בעדינות את זכוכית הכיסוי במורד השקופית.הסר את עודפי ה-BSA באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, טפטף 50 µL מתמיסת הנוגדן הראשוני anti-BRDU על כל שקופית.כסו את הדגימה בזכוכית כיסוי והדגירו בתא לח באמצעות לחות למשך שעתיים. לאחר הסרת זכוכיות הכיסוי, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. מרחו 50 µL של תמיסת הנוגדן המשני, הניחו זכוכיות כיסוי, והגנו על השקופיות מאור.לאחר מכן, הדגירו למשך שעה אחת. הסירו את כיסויות הזכוכית ושטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. לבסוף, הוסיפו טיפה של תמיסת קיבוע vector shield לכל שקופית.לחץ בעדינות על זכוכית כיסוי והסר נוזלים עודפים מסביבה. בעזרת נייר סופג, אטום את זכוכית הכיסוי באמצעות לק שקוף והשאר לייבוש באוויר. שמור את השקופיות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.הניחו טיפה של שמן אימרסיה על נחלילה קרוב לסימון העיפרון והתחילו באיתור הסיבים. התרחקו מהצרור המרכזי כדי למצוא אזורים שבהם הסיבים מופרדים בבירור זה מזה. בניסוי טיפוסי, בחרו תמונות המשתמשות בערוץ צבע אחד בלבד כדי למנוע הטיות.לאחר מכן, צלמו כ-10 תמונות של כל דגימה. נעו לאורך השקופית כדי לצלם תמונות שונות, שכן אזור אחד בשקופית עשוי שלא לספק אורכי סיב מייצגים או מבני שכפול. ייבאו את התמונות לתוכנה לניתוח תמונות.מדדו את אורכן של 100 נתיבי סיבים או ספרו בין 150 ל-200 מבני רפליקציה שונים. טכניקת סיבי הסימון הכפול מאפשרת להבחין בין מבני רפליקציה שונים. ניתן להדמות DNA ששוכפל לאחרונה כקווים של אנלוגים של נוקלאוטידים המסומנים בנוגדנים.כאן, מזלג שכפול המאריך באופן רציף מיוצג על ידי אותות אדומים וירוקים סמוכים. ניתן לחלק אירועי התחלה חדשים למקורות שהופעלו בזמן שהתאים דגרו עם הסימון הראשון, ולמקורות שהופעלו במהלך הדגירה עם הסימון השני. הראשונים מורכבים מאותות ירוקים, אדומים וירוקים סמוכים, והשנייה מקו ירוק בלבד.אירועי סיום מתבטאים בצבעים אדום וירוק סמוכים. אותות אדומים מפוזרים. מקורות מורכבים ממקורות רצופים ומאותות סיום.בהתאם למערך הניסוי, מזלגות שנעצרו או קרסו יכולים להיות מוגדרים כסימון אדום בלבד או כקו אדום, שאחריו מקטע ירוק קצר. בניסוי זה, לתאי DT 40 מסוג הפרא יש מהירות מזלג ממוצעת של 0.4 microns per minute. עם 63% מזלגות פעילים, 10% מקורות שכפול, 16% מזלגות שנעצרו, 8% סיומות, ו-3% סיבים משולבים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדגים ולנתח את הדינמיקה של מזלג השכפול בתאי DT 40. דבר זה יספק לכם כלי חיוני לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA.

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

המתודולוגיה מסייעת בניתוח השונות בדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות ננו-חלקיקים. ניתן לאמץ מתודולוגיות שונות המבוססות על רמת ציטוטוקסיות של החומר המעניין. בנוסף, תיאור של ניתוח התמונה מסופק כדי לסייע בניתוח סיבי DNA.

הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

כאן, אנו מתארים את ההליך לניתוח התקדמות השכפול באמצעות חזרות פתוגניות, נוטות למבנה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

למד טכניקת סיב DNA לויזואליזציה של שכפול DNA ברמת מולקולה יחידה בתאי DT40. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דינמיקת מזלגות השכפול וחקר פגמים בשכפול הגנומי.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

גלה סרטונים נוספים