ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את שכפול ה-DNA ברמת המולקולה הבודדת. התחל בשילוב אנלוגים של נוקלאוטידים הלוגנים ב- DNA שסונתז לאחרונה. בתאים חיים מאתרים את התאים עם הדנ"א המסומן במיקרוסקופ.

לאחר מכן החלק את התאים ומתח את ה-DNA על שקופית המיקרוסקופ. צביעה חיסונית לאחר מכן של סיבי DNA וניתוח תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית יכולים להאיר את דינמיקת מזלג השכפול הגלובלית כדי לאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על תוכנית השכפול הכוללת. במהלך השנים האחרונות פותחו גרסאות שונות של טכניקות סיבי ה-DNA Fluor כדי להמחיש את התנועה של מזלג שכפול בודד בתוך תאים חיים.

ניסוי in vivo זה בתאי DT 40 שאתה עומד לראות יכול להתבצע תוך יום אחד ודורש רק ציוד מעבדה כללי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המדגים את ההליך תהיה ד"ר רבקה שוואב, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. על מנת לתייג תאי DT 40 in vivo, התחל בתרבית הגדלה באופן אקספוננציאלי. הוסף תווית IDU לריכוז סופי של 25 מיקרומולר וערבב את תרחיף התאים.

ובכן דגרו את התאים למשך 20 דקות בחום של 38 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הוסף את תווית CLDU לריכוז סופי של 250 מיקרומולר. מערבבים ודוגרים את תרחיף התאים.

כעת שטפו את תאי DT 40 עם PBS קר כקרח. השעו את כדורי התאים ב-PBS קר ושמרו את התאים המסומנים על קרח. הבחין בשני מיקרוליטרים של מתלה התא על קצה אחד של מגלשת הזכוכית יבש אוויר עד שנפח הטיפה מצטמצם מאוד אך לא יבש לחלוטין.

כעת, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של תמיסת ליזה סיבים על גבי תרחיף התא, וערבבו בעדינות את התמיסות על ידי ערבוב עם קצה פיפטה למשך שתי דקות. לאחר מכן, הטה את המגלשות ל-15 מעלות כדי לאפשר לסיבים להתפשט לאורך המגלשה. לאחר שתמיסת הסיבים הגיעה לתחתית המגלשה, הנח אותה אופקית לייבוש באוויר.

בשלב זה, קו אטום דק אמור להיות גלוי לאורך השקופית. סמן את תחילת הסיבים המתוחים בעיפרון. ראשית טבלו שקופיות בשלושה עד אחד מתנול לחומצה אצטית למשך 10 דקות.

שוטפים את השקופיות במים מזוקקים, ואז טובלים בחומצה הידרוכלורית 2.5 מולרית למשך 80 דקות. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. אוספים עודפי PBS על מגבת נייר.

לאחר מכן כוון את השקופיות בצורה אופקית. כעת פיפטה 5% BSA ב-PBS על גבי כל שקופית, והנח תלוש כיסוי למשך 20 דקות. הזז את החלקת הכיסוי בעדינות במורד מגלשת הזכוכית.

הסר את עודפי ה-BSA בעזרת מגבת נייר. לאחר מכן פיפטה 50 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית נגד BRDU. לכל שקופית.

מכסים משחק בתלוש כיסוי ודוגרים בתא לח למשך שעתיים. לאחר הסרת החלקות הכיסוי, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. יש למרוח 50 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית, ולהגן גם על השקופיות מפני אור.

ואז לדגור למשך שעה. הסר את החלקות הכיסוי ושטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות. לבסוף, הוסף טיפה של מדיום הרכבה של מגן וקטורי על כל שקופית.

לחץ בעדינות על החלקת כיסוי והסר עודפי נוזלים סביבו. בעזרת מגבת נייר אוטמים את החלקות הכיסוי עם לק שקוף ומייבשים באוויר. אחסן את השקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס.

מניחים טיפת שמן טבילה על שקופית קרובה לסימן העיפרון ומתחילים לאתר את הסיבים. התרחק מהצרור הראשי כדי למצוא אזורים שבהם סיבים מופרדים בבירור זה מזה. בניסוי טיפוסי, בחר תמונות באמצעות ערוץ צבע אחד בלבד כדי למנוע הטיה.

לאחר מכן צלם כ-10 תמונות של כל דגימה. עבור לאורך השקופית כדי לצלם את התמונות השונות מכיוון שאזור אחד של שקופית עשוי שלא לספק אורכי סיבים מייצגים או מבני שכפול. ייבוא תמונות לתוכנית ניתוח תמונה.

מדוד את אורכי 100 דרכי הסיבים או ספור 150 עד 200 מבני שכפול שונים. טכניקת סיבי התיוג הכפול מאפשרת להבחין בין מבני שכפול שונים. ניתן לדמיין DNA משוכפל חדש כקווים של אנלוגים של נוקלאוטידים המסומנים בנוגדנים.

כאן, מזלג מתארך מתמשך מיוצג כאותות אדומים וירוקים סמוכים. ניתן לחלק אירועי חניכה חדשים למקורות שנורו בזמן שהתאים הודגרו עם התווית הראשונה ומקורות שנורו במהלך הדגירה עם התווית השנייה. הראשון מורכב מאותות ירוקים, אדומים ירוקים שכנים והשני מקו ירוק. רק.

אירועי סיום מתבטאים כירוק אדום סמוך. אותות אדומים שזורים זה בזה. המקורות מורכבים ממקורות עוקבים ואותות סיום.

בהתאם לתכנון הניסוי, ניתן להגדיר מזלגות תקועים או מכווצים כאות אדום בלבד או קו אדום, ואחריו מסלול ירוק קצר. בניסוי זה, לתאי DT 40 מסוג פרא יש מהירות מזלג ממוצעת של 0.4 מיקרון לדקה. עם 63% מזלגות מתמשכים, 10% מקורות, 16% מזלגות תקועים, 8% סיומות ו-3% סיבים משולבים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין ולנתח דינמיקת מזלג שכפול בתאי DT 40. זה יספק לך כלי חיוני לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA.