Name: תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאליים בתאים חיים באמצעות SYBR Gold ומיקרוסקופיית תאורה מובנית ברזולוציה על. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת הנוקלאונואידים בזמן אמת ללא צורך בביטוי חלבונים פלואורסצנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים באסיפא אקקטר ובאנג'ליקה ראמאולד (מכון מקס פלנק לביולוגיה חיסונית ואפיגנטיקה) לאספקת תאי הלה.

הערה: כל הקווים המוזכרים כאן היו מתורבתים בינונית גבוהה של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS), גלוטמין, פניצילין/סטרפטומיצין, ו פירובט. השפה כל מדיה ותוספי מזון לשמש ביום של תיוג והדמיה על ידי מחמם אותם עד 37 ° c בחממה להגדיר 5% CO2. כל תרבות התא עבודה כולל תיוג מתרחש בתנאים סטרילי תחת כיסוי הזרימה לבינארי.
1. תיוג תאים חיים
<ol><li>יום אחד לפני הליך תיוג, תרבות 4 x 105 תאי הלה ב 2 מ ל של בינוני בצלחת פטרי 35 מ"מ עם #1.5 זכוכית תחתית. ניתן להשתמש בשקופיות מרובות שקופיות, אך יש לכוונן אמצעי אחסון באופן פרופורציונלי לעוצמת הקול של הבאר. לדלל את ההשעיה התא יש כ 50,000 תאים/mL וזרע 2 מ ל של השעיית התא בצלחת פטרי 35 מ"מ.</li>
	<li>הכינו את הדלעות הבאות של פתרון מלאי מסחרי של SYBR גולד (SG): 1:5000. הכינו מיטומעקב אדום עמוק (כתם אדום רחוק) או מיטלגשש CMXRos אדום (כתם אדום) (טבלת חומרים; מלאימסחרימדולל 1:2000) במדיום התרבות האדום נטול פנול. הכן את אותן מדלעות הערכה של picoGreen כמו עבור SG. הערה: הפתרונות המתוארים בשלב 1.2 הם הפתרונות לתיוג 2x. הגן על כל הפתרונות המכילים צבעי פלורסנט מן האור ככל האפשר.</li>
	<li>לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ ל PBS פעם אחת. הוסף 1 ml פנול בינוני התרבות האדום ללא 35 מילימטר צלחת פטרי. עבור שקופית בעלת 8 היטב, השתמש באמצעי אחסון השווה ל-1/2 של הקיבולת הגבוהה ביותר (לדוגמה, הוסף 125 μL אם קיבולת היטב הכוללת היא 250 μL).</li>
	<li>להוסיף 1 mLof את התמיסה 2x תיוג הכין בשלב 1.2 כדי 35 מ"מ צלחת פטרי. עבור שקופית בעלת 8 היטב, השתמש באמצעי אחסון השווה ל-1/2 של הקיבולת הגבוהה ביותר. מודיית את התאים 30 דקות ב 37 ° c תחת 5% CO2. הערה: אין להפעיל את התאים עם פתרון תיוג SG עבור יותר מ 1 h, כי הדגירה עוד יגרום תיוג של דנ א גרעיני.</li>
	<li>מטפי בזהירות את המדיום המכיל את צבעי פלורסנט ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.</li>
	<li>הוסף מדיום תרבות התא נטול פנול ושמור את התאים בחושך בחממה של CO2 ב 37 ° צ' עד הדמיה.</li>
	<li>תאים חיים תמונה על מיקרוסקופ SR-SIM מצויד יחידת דגירה (ראה להלן).</li>
</ol>2. SR-SIM רכישת תמונה
<ol><li>להתקין אינקובטור העליון הבמה על הבמה המיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה הרצויה ו-CO2 ריכוז (g., 37 ° צ' ו 5% עבור תאים מיונקים) ולהתחמם לפחות 1 h לפני תחילת רכישת התמונה.</li>
	<li>הפעל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ SR-SIM, כולל לייזרים, ולהשאיר אותם להתחמם לפחות 1 h.</li>
	<li>בחר הגדלה גבוהה, הצמצם מספריים גבוה (NA) מטרה טבילה (למשל, 100x 1.46 NA שמן) מומלץ עבור SR-SIM על ידי יצרן המיקרוסקופ.</li>
	<li>התקן שקופית הצ או צלחת 35 מ"מ עם תאים המסומנים (משלב 1.6) על הבמה מיקרוסקופ מודחת.</li>
	<li>אתר את אזור העניין על המדגם, רצוי עם oculars. כדי להשיג את איכות הדימות SR-SIM הטובה ביותר, בחר את התאים המחוברים היטב לזכוכית.</li>
	<li>השתמש האחורי מבוססי אלקטרון high-end הכפלת חיוב מצמידים המכשיר (EM-CCD) מצלמה כדי לרכוש SR-SIM תמונות.</li>
	<li>באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, להגדיר הגבוה EM גבוהה מומלץ עבור המצלמה בשימוש (למשל, 300).</li>
	<li>לפני שרכשו את סדרת הזמן למעקב אחר נוקלאואיד, רכשו תמונה של שני צבעים של SR-SIM מאותו שדה תצוגה: ערוץ אחד לצביעת מיטוכונדריאלי ועוד אחד עבור SG. להגדיר את ערוץ הצבע הראשון המתאים לכתם מיטוכונדריאלי המשמש (למשל, עבור כתם מיטוכונדריאלי אדום רחוק, להגדיר את העירור על 633 ננומטר או יותר ו 650 nm לארוך פליטה מסנן). עבור האות SG, להגדיר את עירור ב 488 ננומטר ו 500-550 ננומטר מסנן פליטת מעבר.</li>
	<li>באמצעות התוכנה, להגדיר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי עבור שני 488 ננומטר וקווי כתם אדום הרחוק. הערה: הגדרה אופיינית היא 1% פלט לייזר כוח המותאם על-ידי מסנן tunable-אופטי acousto (AOTF).</li>
	<li>אם מיקרוסקופ ה-SIM רוכש ערוצים ברצף בלבד (הגדרת מצלמה אחת), ולאחר מכן לכבות את ערוץ זיהוי הכתמים האדום הרחוק.</li>
	<li>הגדר את הרכישה של מישור מוקד בודד על-ידי החלפת הרכישה של מחסנית Z על-ידי הסרת התיבה מחסנית z בתוכנה.</li>
	<li>הגדר את הזמן הקצר ביותר האפשרי מצלמה EM-CCD.</li>
	<li>קבע שלושה סיבובים של הרשת במקום חמישה סיבובים.</li>
	<li>כדי להגדיל את קצב המסגרות, בכרטיסיה רכישה של התוכנה, הגדר את המצלמה כך שתקרא את הנתונים רק מהאזור המרכזי של חיישן המצלמה במקום "שבב מלא". הערה: לדוגמה, מעבר מקריאת שטח של 1,000 x 1,000 פיקסלים מלאים לקריאה רק 256 x 256 פיקסלים מאפשר ירידה בזמן חשיפה למצלמה מ 50 ms כדי 13.4 ms ואת זמן המסגרת הכולל מ 1.8 s עד 1.2 s. אם רק חלק מרכזי של חיישן המצלמה נקרא, אז שדה התצוגה יהיה קטן מאוד עבור יעד 63 x או 100x המשמש בדרך כלל עבור SR-SIM. זמן חשיפה קצר יותר יקטין את היחס בין האות לרעש של התמונות.</li>
	<li>מיטוב כוח לייזר וחשיפה למצלמה זמן: לרכוש SR-SIM דו מימדי (2D) תמונות של תאים בעלי תוויות במספר ערכי כוח לייזר (g., 0.5%, 1%, 1.5%, 2%) כמה פעמים חשיפה (למשל, 13.4 ms, 25 ms, 50 ms).</li>
	<li>עבד את ערכות הנתונים הגולמיים של ה-SIM (ראה שלב 3.1).</li>
	<li>בחר כוח לייזר וחשיפה מצלמה פעמים התשואות תמונות ה-SIM עם נקודות בהירות המיטוסים (כלומר, נוקלאונואידים) עם פריטים קטנים או לא שנוצרו על ידי עיבוד ה-SIM. בדוק את האזורים מחוץ המיטו, (למשל, 1% כוח של 488 ננומטר לייזר המדינה מוצק 25 ms חשיפה של מצלמת EM-CCD).</li>
	<li>התחל רכישה של סדרת הזמן לשגות באמצעות הגדרות אופטימיזציה בשלבים 2.15 – 2.17.</li>
</ol>3. עיבוד וניתוח נתונים
<ol><li>תהליך הנתונים הגולמיים של ה-SIM מגדיר את מודול התאורה המובנית של תוכנה מתאימה (טבלת חומרים): בחר את תיבת הסימון אוטומטי עבור פרמטרי עיבוד ה-SIM. לעיבוד אוטומטי של קבצים מרובים, להשתמש בכלי עיבוד אצווה, לבטל את השימוש הנוכחי עבור אצווה, לחץ על הפעל אצווה ובחר קבצים מרובים עבור עיבוד ה-SIM.</li>
	<li>המרת ה-SIM מעובד סדרות זמן מערכות נתונים לפורמט ims עם ממיר קובץ imaris תוכנה (כלומר, הגירסה המתאימה לגירסה של Imaris אריס תוכנה).</li>
	<li>פתח קובץ שהומר בתוכנה (גירסה 8.4.1 או מאוחרת יותר) הכולל רשיון עבור המודול ' שושלת יוחסין ' (או ' מעקב ').</li>
	<li>הפעל את אשף היצירה "כתמים" על-ידי לחיצה על הוסף סמל כתמים חדשים . האשף ליצירה יופעל.</li>
	<li>בחר בכרטיסיה ' יצירה ' של האשף.</li>
	<li>בשלב הראשון של האשף, לחץ על מעקב אחר נקודות (לאורך זמן) והמשך לשלב השני של האשף.</li>
	<li>הגדר את קוטר XY המשוער ל-0.1-0.15 μm, לחץ על ' חיסור רקע ' והמשך לשלב השלישי.</li>
	<li>כוונן את הסף במסנן "איכות" על-ידי גרירת הקו האנכי בהיסטוגרמה, כך שרוב הנוקלאואידים מזוהים כ"נקודות", בעוד הממצאים אינם מזוהים (כלומר, הנקודות שזוהו מסומנות ככדורים המצופים בתמונה). בדוק אם זה המקרה בכל מסגרת ולאחר מכן להתאים את הסף במידת הצורך. המשך לרביעי ולאחר מכן לשלב החמישי של הקוסם.</li>
	<li>בחר באלגוריתם שינוי אוטומטי של התנועה . הגדר מרחק מקסימום עד 0.5 μm. הגדר את גודל הרווח המירבי כ-0.</li>
	<li>הסתכל על כל אחת מהמסגרות בסדרת הזמן ובדוק אם רצועות שווא מצוירות ואם מרווחים כלשהם בין רצועות מוצגים (הרצועות שנבנו על-ידי האשף עם ההגדרות הנוכחיות מסומנות באופן מיידי כקווים המצופים בתמונה). . כוונן את "מרחק מקסימום" אם יש צורך המשך לשלב השישי של האשף. בחרו במסנן ' מעקב אחר משך ' וקבעו סף של 3 – 5 s.</li>
	<li>אם הנקודות או הרצועות שזוהו כרגע אינן אופטימליות, חזור לשלבים הקודמים של האשף באמצעות לחצני ניווט (בחלק התחתון של חלון האשף) הדרושים לכוונון כלשהו של כל פרמטר לנקודות או ליצירת רצועות.</li>
	<li>כאשר הפרמטרים מכוונים בסדר לאפשר את התוכנה כדי לזהות את כל הנקודות ולבנות מסלולים כראוי, לחץ על כפתור הניווט החץ הירוק באשף כדי לאשר את היצירה של הרצועות.</li>
	<li>חלץ את הנתונים הסטטיסטיים של הרצועות על-ידי לחיצה על חלון סמל הסטטיסטיקה . בחר את פרמטרי הסטטיסטיקה הדרושים (כרטיסיות ערכיםמפורטים וממוצעים תחת סטטיסטיקה) ויצא את הערכים כקבצי csv על-ידי לחיצה על סמל כונן התקליטונים עבור כימות ופריטים חזותיים. הערה: מהירות המסלול המירבית, המשמעות של מהירות המעקב, אורך המעקב והתזוזה של הרצועה הן דוגמאות לפרמטרים החשובים.</li>
	<li>אם יש להציג או לפרסם את ערכת הנתונים של התמונה, צור תמונות ו/או קבצי וידאו המייצגים את סידרת הזמן עם שירים המצופים באופן אופציונלי באמצעות התמונה או כלי ההנפשה .</li>
</ol>4. רכישת תמונה מוקד
<ol><li>התקן חממה שלב העליון על הבמה המיקרוסקופ, להגדיר את הטמפרטורה הרצויה CO2 ריכוז (כלומר, 37 ° צ' ו 5% עבור תאים מיונקים) ולשמור חם לפחות 1 h לפני תחילת רכישת תמונה.</li>
	<li>להפעיל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה, כולל לייזרים, ולהשאיר אותם להתחמם לפחות 1 h.</li>
	<li>בחרו את האמצעי הרצוי לדגימת ההגדלה והדגימה המרחבית לפי קריטריוני נייקוויסט.</li>
	<li>עבור ערוץ SG, להגדיר את עירור על 488 nm וטווח זיהוי של 500 – 550 ננומטר. עבור ערוץ כתמים מיטוכונדריאלי, מוגדר ל 561 ננומטר ו-570 – 630 לפליטת nm עבור צבע אדום, או 633 הריגוש ננומטר ו > 650 ננומטר לצבע אדום רחוק.</li>
	<li>הגדר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי (בדרך כלל 1% או פחות) המאפשר רכישה של האותות עם רווחי גלאי PMT של 700 mV.</li>
	<li>לרכוש שני צבעים מיקוד תמונות של התאים, שבו הנוקלאונואידים מיטוכונדריאידים מזוהים "ערוץ SG" ו המיטו, מזוהים בערוץ "אדום" או "אדום רחוק".</li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li>
<li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013(2012).</li>
<li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li>
<li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+%28TFAM%29%3A+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li>
<li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li>
<li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li>
<li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).</li>
<li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM%2FdSTORM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li>
<li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li>
<li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range%2C+limits%2C+and+membrane+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li>
<li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contacts+couple+mtDNA+synthesis+with+mitochondrial+division+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells.</a> Science. 353 (6296), aaf5549(2016).</li>
<li>Dellinger, M., Geze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+in+living+animal+cells+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).</li>
<li>Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleoid+structure+regulated+by+mitochondrial+fission+contributes+to+cristae+reformation+and+release+of+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).</li>
<li>Zurek-Biesiada, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+of+DNA+in+situ+using+Vybrant%28%28R%29%29+DyeCycle+Violet+fluorescent+probe%3A+A+new+approach+to+study+nuclear+nanostructure+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution.</a> Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).</li>
<li>He, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA%28%2B%29+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li>
<li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li>
<li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ישנם מספר רכיבים קריטיים לפרוטוקול: כדי להשיג תיוג מועדף של דנ א מיטוכונדריאלי, הריכוז של הצבע איגוד ה-DNA במהלך הדגירה צריך להישמר נמוך מאוד (למשל, 1:10000 דילול של מלאי מסחרי אופייני), ואת זמן הדגירה צריך להיות 30 דקות. זמן הדגירה צריך לעולם לא יעלה על 1 h. SYBR זהב צבע יש להשתמש; אחרים DNA-כריכת צבעים אינם בהירים מספיק כדי ליצור אות חזק על תיוג בריכוז נמוך.
הגבלת הפרוטוקול שלנו היא שהצבען נשטף מן הנוקלאונואידים הדריאידים במהלך שלב החדירות. לכן, ההליך המתואר אינו מתאים לפרוטוקולים immunofluo...

מעגלית 16.5 kbp מולקולות DNA להוות את החומר הגנטי של המיטו, קידוד 22 tRNAs, 2 rRNAs, ו -13 פוליפפטידים הדרושים למערכות זרחון חמצוני מיטוכונזילציה. דנ א מיטוכונדריאלי מאוגד מקדם תמלול מיטוכונדריאלי (tfam) וחלבונים אחרים מהווים את הנוקלאונואידים מיטוכונדריאידים1,2,3,4. נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים משנים את הפיזור בין המרכיבים של רשת מיטוכונדריאלי5,6 במהלך שיפוץ מורפולוגית שלה, ביקוע או היתוך בהתאם לשלב מחזור התא, מתח, וגורמים אחרים (נבדק בתוך pernas ואח '7). בנוסף, התנועה של נוקלאונואידים מיטוכונדרילי, הוא מעורב זאבת מערכתית מחלת אודם8 ועשוי לשחק תפקיד במחלות אחרות. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה ללימודי תאים לחיים של אורגלים, אבל לטכניקה יש רזולוציה של > 200 ננומטר, שהוא גדול יותר מהגודל של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים (~ 100 nm9,10,11,12). מגבלה זו בוטלה על-ידי המכונה "טכניקות סופר-ברזולוציה", כגון מחסור בפליטה מאולצת (הוהיסטד) ומיקרוסקופ בודד לוקליזציה של מולקולה (smlm)13,14. עד כה, נוקלאונואידים מדריאידים ו-DNAs אחרים היו מאופטים בתאים חיים על ידי מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישירה (Dnas)15. פיין מבנים תת מיטוכונדריאלי עם תנוחות הקשורות עם mtDNA נצפו על ידי סטד בתאים חיים16. עם זאת, אלה טכניקות סופר ברזולוציה דורשים עוצמת תאורה גבוהה, מה שגורם להשפעות פוטורעילות על תאים חיים17. לכן, פקיעה הזמן הדמיה של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה היא מאתגרת. כדי להתייחס לכך, השתמשנו במיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה סופר (SR-SIM)18. ה-SIM מחייב הרבה יותר כוח התאורה מ-סטד ו-SMLM19. יתר על כן, בניגוד לטכניקות הסטד ו smlm, ה-SIM מאפשר הדמיה פשוטה ססגוניות תלת מימדי (3d), וזה לא דורש מאפיינים פוטופיסיים מסוימים של fluorophores או מאגר הדמיה הרכב19.
האסטרטגיה המקובלת לתיוג נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים היא תיוג פלורסנט של חלבון נוקלאואיד מיטוכונדריאלי, כגון TFAM20. עם זאת, במקרים רבים, אסטרטגיה זו אינה מתאימה. יתר על כן, ביטוי יתר של חלבון פלורסנט-מתויג TFAM מייצרת חפץ רציני21. התוויות של דנ א עם צבעים אורגניים יש יתרונות מעל חלבון פלורסנט (FP) מבוססי אסטרטגיה. צבעים אורגניים הם ללא מגביל הקשורים לתיוג FP: הם יכולים לשמש עבור כל סוג של תאים או tissueand יכול להיות מיושם בכל נקודת זמן של ניסוי. הדמיה של תאים חיים של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים דווחה עם מספר צבעים מחייב DNA: dapi22, sybr ירוק23, וברנט דיקטקל24, ו picogreen15,25,26. חיסרון משמעותי של רוב DNA-מחייב צבעים עבור תיוג נוקלאואיד הוא שהם כתם כל ה-DNA בתוך התא. מיקוד לצבוע בלבד DNA מיטוכונדריאלי הוא רצוי מאוד. כדי להשיג את זה, בחירה זהירה של צבע בעל תכונות מתאימות פיזיקאלית-כימיות הוא הכרחי. צבעי ליפוהיפילית בעלי מטען חיובי מנוקד, כגון rhodamine 123, ידועים לצבור בחיים המיטופינים, אשר לשמר את הפוטנציאל הממברנה שלילית שלהם. בנוסף, צבע אידיאלי עבור תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים צריך לאגד דנ א עם זיקה גבוהה לפלוט פלואורסצנטית בהיר על כריכת ה-DNA. בהתחשב דרישות אלה, cyanines מסוימים הם מבטיחים (למשל, picogreen), אבל DNA גרעיני הוא מוכתם בשפע על ידי צבעים אלה בו עם דנ א מיטוכונדריאלי15,25,26. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים עם צבע cyanine אחר, SYBR גולד (SG), ומעקב אחר הנוקלאונואידים בזמן לשגות סופר וידאו SIM ברזולוציה. יתר על כן, התאים לחיות SG ויטראז ניתן ליצור תמונה על ידי כל סוג של מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (confocal וקד, מסתובב דיסק, epiפלואורסצנט, וכו ') מתאים לתאים חיים מצויד עם מקור אור ננומטר 488.

<table><tbody><tr><td>Elyra PS1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ רב-מודאלי ברזולוציה גבוהה המכיל מודול למיקרוסקופ תאורה מובנית ברזולוציה גבוהה (SR-SIM)</td></tr> <tr><td>גלוקוז גבוה DMEM</td><td>GIBCO/ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>ibidi 8-well microSlide, תחתית זכוכית</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane/Oxford Instruments</td><td></td><td>חבילת תוכנה לניקוב והדמיה של תמונות</td></tr><tr><td>iXon 885</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>מצלמת EMCCD עם חיישן עם תאורה אחורית</td></tr><tr><td>LSM880 Airyscan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי עם גלאי מערך</td></tr><tr><td>Mitotracker CMXRos Red</td><td>ThermoFischer</td><td>M7512</td><td>מיטוכונדריה של תאים חיים אדומים כתם</td></tr><tr><td>Mitotracker אדום עמוק FM</td><td>ThermoFischer</td><td>M22426</td><td>אדום רחוק תא חי כתם מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>picoGreen</td><td>ThermoFischer</td><td>P7581</td><td>תא כתם DNA פרמונד</td></tr>, <tr><td>תוכנית Apochromat 100x/1.46 מטרת שמן</td><td>קארל זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR זהב</td><td>ThermoFischer</td><td>S11494</td><td>תא פרמונד, כתם DNA</td></tr> זן <tr><td>שחור 2012 תוכנה</td><td>קארל זייס</td><td></td><td>תוכנה לרכישת ועיבוד תמונות</td></tr></tbody></table>

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

נוקלאונואידים מדריאידים הם חלקיקים קומפקטית שנוצרו על ידי מולקולות DNA מיטוכונדריאלי מצופה חלבונים. דנ א מיטוכונדריאלי מקודד tRNAs, rRNAs, ומספר polypeptides מיטוכונדרימי חיוני. נוקלאונואידים מיטוכונדרילי לחלק ולהפיץ בתוך רשת מיטוכונדריאלי דינמית העוברת ביקוע/פיוז'ן ושינויים מורפולוגיים אחרים. ברזולוציה גבוהה לחיות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה לאפיון העמדה והתנועה של נוקלאואיד. עבור טכניקה זו, הנוקלאואידים מסומנים בדרך כלל באמצעות תגי פלורסנט של רכיבי החלבון שלהם, כלומר שעתוק הגורם (TFAM). עם זאת, אסטרטגיה זו זקוקה לביטוי יתר של חלבון פלורסנט לבנות מתויג, אשר עשוי לגרום לפריטים (מדווחים על TFAM), והוא אינו אפשרי במקרים רבים. לצבעי ה-DNA האורגניים אין החסרונות הללו. עם זאת, הם תמיד להראות כתמים של DNAs הן גרעינית ומיטוכונדריאלי, ובכך חסר ספציפיות לנוקלאונואידים מיטוכונדרילי. על-ידי לקיחת בחשבון את התכונות פיזיקאלית-כימיות של צבעים כאלה, בחרנו הזרע חומצה גרעין כתם (SYBR Gold) והשיגה תיוג מועדף של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים. מאפייני הצבע, במיוחד הבהירות הגבוהה שלה על הכריכה ל-DNA, לאפשר כימות הבאים של תנועה נוקלאואיד מיטוכונדריאלי באמצעות סדרת זמן של תמונות תאורה מובנית ברזולוציה סופר.

אפיון של תיוג תאים חיים עם SG ראשית, התפלגות ה-SG בתאים על הדגירה עם הצבע בדיעות שונות התאפיין במיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר הדגירה עם ריכוזים גבוהים של SG או picoGreen, שתי הצבעים בעיקר התווית את הגרעינים והראו כתמים מדומה בציטופלסמה (איור 1), בדומה לנתונים שפורסמו עבור אחר טעונה חיובי cyanine צבען (כלומר, picoGreen)15. עם זאת, עם הדגירה עם SG ב 1:10000 דילול, הכתמים קלוש הופיע גרעינים, ואילו בציטופלסמה, הבחנו דפוס ...

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

הפרוטוקול מאפשר תיוג ספציפי של גרעיני מיטוכונדריה בתאים חיים ואת המחקר הכמותי של תנועתם ברזולוציה גבוהה. הדגירה עם הצבע הפלואורסצנטי רק עוקפת את הצורך בחלבון פלואורסצנטי על פני ביטוי, נמנעת מממצאים ומגבלות קשורים ומאפשרת להחיל את הפרוטוקול שלנו על תאים שאינם ניתנים לניתוק. כדי להשיג כתמי גרעין מועדפים, יש להשתמש זהב SYBR ושום דבר אחר בתנאים שיש לנו אופטימיזציה.אחרת, ה-DNA התאי הכולל עשוי להיות מוכתם. יום אחד לפני הליך התיוג, תרבות ארבע פעמים 10 לתאי הלה החמישיים בשני מיליליטר של מדיום בצלחת פטרי 35 מ"מ. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים בשני מיליליטר של PBS לפני הוספת מיליליטר אחד של פנול אדום תרבות חינם בינוני אחד מיליליטר של פתרון תיוג 2X המתאים.לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, בזהירות שאפו את הצבע המכיל על טבעי מכל צלחת פטרי 35 מ"מ ולשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS. ואז להאכיל את התאים עם פנול טרי אדום תאים חופשיים תרבות בינוני ולהחזיר את התרבות לחממת תרבות התא מוגן מפני אור עד הדמיה חיה. להדמיית תאים חיים, לפחות שעה לפני מפגש ההדמיה, הנח את החממה העליונה על שלב מיקרוסקופ התאורה המובנה ברזולוציית העל והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת ריכוז הפחמן הדו-חמצני ל- 5%, הפעל את כל מרכיבי המיקרוסקופ כולל הלייזרים ובחר בהגדלה גבוהה, מטרת טבילה בצמצם מספרי גבוה כפי שהומלץ עבור מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית על ידי יצרן המיקרוסקופ.כאשר הלייזרים התחממו, התקינו את צלחת פטרי 35 מ"מ על שלב המיקרוסקופ ולהשתמש עיניים כדי לאתר אזור עניין עם תאים מחוברים לתחתית המנה. כדי להשיג תמונות מיקרוסקופיות תאורה מובנות ברזולוציית-על, השתמש במצלמת התקן מרוכבים של מטען מרוכך בקצה האחורי. בתוכנת רכישת התמונה, הגדר רווח גבוה להכפלת אלקטרונים כפי שהומלץ למצלמה.לפני רכישת סדרת זמן לשגות עבור מעקב גרעין, לרכוש תמונה מיקרוסקופית תאורה מובנית שני צבעים ברזולוציה סופר של אותו שדה מבט בערוץ אחד עבור כתמים מיטוכונדריאלי ועוד אחד עבור זהב SYBR. הגדר את ערוץ צבע התמונה המיטוכונדריאלית לגירוש ו הפליטה המתאימים לכתם המיטוכונדריאלי המשמש והגדר את מסנן הפליטה המתאים של excitation ו- bang Pass עבור צבע הזהב של SYBR. הגדר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי עבור שני הערוצים.אם המיקרוסקופ רוכש ערוצים ברצף בלבד, כבה את הערוץ לגילוי הכתמים המיטוכונדריאליים. untick תיבת מחסנית Z בתוכנה כדי לכבות את רכישת מחסנית Z כדי להגדיר את הרכישה של מטוס מוקד יחיד ולהגדיר את זמן החשיפה הקצר ביותר האפשרי מצלמה. הגדר שלושה סיבובים של הרשת ורכוש תמונות דו מימדיות של התאים המסווים במספר ערכי כוח לייזר וכמה פעמים חשיפה כדי למטב את כוח הלייזר בזמן החשיפה למצלמה.בחר את זמני החשיפה של לייזר ומצלמה המניבים תמונות מיקרוסקופיות תאורה מובנות עם כתמים בהירים במיטוכונדריה עם מעט או ללא חפצים ולהתחיל ברכישת סדרת לשגות בזמן באמצעות ההגדרות הממוטבות. לניתוח תמונות לשגות זמן, לפתוח את תמונות מיקרוסקופיה תאורה מובנית המרה ותוכנה לניתוח תמונה מתאימה כי יש מודול מעקב אחר נקודה ולחץ להוסיף כתמים חדשים כדי להפעיל את אשף יצירת כתמים. תחת הכרטיסיה יצירה, לחץ על עקוב אחר נקודות לאורך זמן והמשך לשלב השני של האשף.הגדר את קוטר ה- x-y המשוער ל- 0.1 עד 0.15 מיקרומטר. לחץ על חיסור רקע והמשך לשלב השלישי באשף. גרור את הקו האנכי בהיסטוגרמה כדי להתאים את סף מסנן האיכות עד שרוב הנוקלאוטידים מזוהים כנקודות בממצאים אינם מזוהים בתוך כל מסגרת.המשך אל השלב הרביעי והחמישי של האשף ובחר את אלגוריתם התנועה הרגרסיבית האוטומטית. הגדר את המרחק המרבי ל- 0.5 מיקרומטר ואת גודל הפער המרבי לאפס. כאשר הפרמטרים מכווננים היטב מאפשרים לתוכנה לזהות את כל הנקודות ולבנות מסלולים כראוי, לחץ על לחצן החץ עכשיו כדי לאשר את יצירת הרצועות ולחץ על סמל הסטטיסטיקה כדי לחלץ את סטטיסטיקת הרצועות.לאחר מכן בחרו בפרמטרי הסטטיסטיקה הדרושים ולחצו על 'שמירה בשם' כדי לייצא את הערכים כקבצי CSV של נקודות לכמות ולפריטים חזותיים. תיוג עם ריכוזים גבוהים של זהב SYBR או PicoGreen תוצאות כתמים בשפע של הגרעינים וכתמים punctate בתוך הציטופלסמה. בריכוזים נמוכים יותר, אות זהב SYBR קלוש מופיע בתוך הגרעינים בתבנית של כתמים בהירים נצפתה בתוך הציטופלסמה.תיוג PicoGreen בריכוזים נמוכים מניב בעיקר כתמים גרעיניים. כתמים בו זמנית עם ריכוזים נמוכים של זהב SYBR בצבע מיטוכונדריאלי אדום רחוק מגלה כי כמעט כל כתמי זהב SYBR מתרחשת בתוך המיטוכונדריה תוך תיוג בריכוזים גבוהים תוצאות כתמים משמעותיים של הגרעינים ציטופלסמה. דימות זמן-Lapse מגלה כי לאחר 45 דקות כתמי הגרעין קרובים לרוויה.קיבעון גורם לחלוקה מחדש קלה של הצבע לגרעין, בעוד חלחלה של התאים הקבועים מבטלת את דפוס הכתמים המנוקד של המיטוכונדריה ומשפרת את הכתמים הגרעיניים. אם זהב SYBR מתווסף לתאים לאחר קיבעון ו permeablization, אז הצבע מופץ באופן אחיד על פני הציטופלסמה ואת הגרעין וכתוצאה מכך אובדן הספציפיות הכתמים. הדמיה תלת-ממדית של תא חי על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית-על חושפת את הגרעין המיטוכונדריאלי כנקודות בהירות בתוך המיטוכונדריה.מעקב אחר מיקומו של הגרעין ברזולוציה מעבר למגבלת ההתפזרות מראה כי רוב הגרעינים מפגינים תנועות אקראיות למרחקים קצרים שכנראה מוגבלות לרשת המיטוכונדרית. חשוב לציין כי פרוטוקול זה אינו תואם את הקיבעון של המדגם. עם זאת, הפרוטוקול שלנו צריך להיות תואם למגוון רחב של בדיקות מבוססות הדמיה של תאים חיים לחקר מורפולוגיה, דינמיקה ופעילויות של מולקולות ואברונים.המחקר שלנו ממחיש את היתרונות של ארגון מחדש של צבעים לא אורגניים לטכניקות מבוססות תאים. זה עשוי לעורר את המחקר של צבעים פלואורסצנטיים אחרים עבור היישום שלהם במחקרים הסלולר.

specific-labeling-mitochondrial-nucleoids-for-time-lapse-structured

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Kennedy, L. H., et. al. הדמיה והדמיה חיה של אברוני אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות באמצעות וירוס הקשור לאדנו ומיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של מיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות של עכבר. הפרוסה מונחת בתוך תא אמבטיה עם זרימת נוזלים רציפה וטמפרטורה מבוקרת. לאחר הגדרת פרמטרים שונים של המיקרוסקופ הקונפוקלי, נלכדות תמונות זמן-lapse של מיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות אדומה, ואחריהן תמונות Z-stack של האוליגודנדרוציטים עם...

הדמיה קונפוקלית של תנועה מיטוכונדריאלית בתוך אוליגודנדרוציטים בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.

קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן אנו מתארים את לוקלייזר האירועים המיטוכונדריאלי (MEL), תוסף ImageJ שימושי בכימות השינויים התלת-ממדיים בביקוע המיטוכונדריאלי ובפעילות ההיתוך לאורך זמן. אנו מתארים גם צינור עיבוד תמונה שימושי לניקוי מיקרוגרפים לפני ניתוח ב-ImageJ.

הבנת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוגרפים פלואורסצנטיים דינמיים ותלת מימדיים

אנו מציגים פרוטוקול צביעה וניתוח מיקרוסקופ מיקום כרומטין חד-מולקולי (SMLM) בשלושה צבעים, המאפשר מיפוי שכפול של אאוכרומטין, הטרוכרומטין ו-RNAP II לניתוח מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר תיוג רב-צבעוני יעיל בסביבות גרעיניות צפופות, כולל מטרות הקשורות לכרומטין, ומאפשר גילוי סימולטני אמין.

פרוטוקול מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת רב-תוויות לחקר כרומטין בסביבה גרעינית צפופה

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

למד תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאליים בתאים חיים באמצעות SYBR Gold ומיקרוסקופיית תאורה מובנית ברזולוציה על. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת הנוקלאונואידים בזמן אמת ללא צורך בביטוי חלבונים פלואורסצנטיים.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

גלה סרטונים נוספים