סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אחת המטרות החשובות ביותר במדעי המוח היא להבין את הרמזים המולקולריים המנחים את השלבים המוקדמים של השראת הסינפסה. לפיכך, הפכה לדרישה הכרחית פיתוח של גישות אובייקטיביות לכימות שינויים בקישוריות הסינפטית. כדי לכמת את מספר הסינפסות במגוון של תכונות ניסוייות, צובעים נוירונים בתרבית או דגימות רקמת מוח שנחתכו בהקפאה (cryosections) באמצעות סממנים סלקטיביים פרה- ופוסט-סינפטיים, כדי לסמן את נקודות המגע הסינפטי בין נוירונים.

לאחר מכן מדמיינים את התאים או הרקמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומפיקים תמונות בפורמט שמונה ביטים עבור כל אחד מהערוצים המתאימים לשני הסמנים האימונוהיסטוכימיים. התמונות מנותחות באמצעות תוכנת Image J 1.29 עם תוסף puncta analyzer. כדי לקבוע את מידת הקולוקליזציה (מיקום משותף) בין הסמנים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, ניתן להשתמש בנקודות הקולוקליזציה כדי לקבוע את מספר הסינפסות הנמצאות בדגימה.

היתרון המרכזי של הטכניקה המתוארת כאן על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא שבדיקת הסינפסים מאפשרת ניתוח וכמתית של מספר הסינפסים בתפוקה גבוהה בהרבה. ההשלכות העיקריות של טכניקה זו פונות לעבר אבחון וטיפול בהפרעות קליניות כגון מחלת אלצהיימר, אפילפסיה או אוטיזם, שבהן מעורבות חריגות בקישוריות סינפטית כבסיס לפתולוגיה שבבסיסן. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות דרכי התערבות שיכולות להפחית או לשפר את הליקויים הנצפים ביכולתם של נוירונים פגועים ליצור סינפסים זה עם זה.

למרות ששיטה זו שימושית לחקר התפתחות המוח, ניתן ליישמה גם באורגניזמי מודל או במערכות איברים אחרות שבהן תרצו לחקור או לכמת את מספר המגעים בין תאים, ובתנאי שיש לכם את היכולת לסמן באופן סלקטיבי כל פני שטח נגדיים של כל אתר מגע. הכינו תרביות נוירונים על ידי זריעה של תאי גנגליון רשתית של חולדה, שסוננו מרשתית של חולדה שהופקה מבעלי חיים ביום P5 עד P7, על כיסויי זכוכית מצופים ב-poly-D-lysine. בתוך פלטה בעלת 24 בארות, התאיים גדלים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלושה עד חמישה ימים לפני הטרנספקציה.

לאחר הטרנספקציה, דגרו את התאים למשך שבעה עד שמונה ימים נוספים כדי לאפשר התפתחות של סינפסים כאשר התאים שהוצבו בצלחת הבשילו מספיק. הסירו את מצע התרבית מהבארות והוסיפו 500 microliters של 4% para formaldehyde שחומם מראש לכל בארה לקיבוע למשך שבע דקות. לאחר הקיבוע, בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים שלוש פעמים עם phosphate buffered saline.

חשוב להבטיח שהתאים לא יתייבשו לעולם בתוך הבארות. ברגע שמוסר בופר מבארה, יש להחליפו מיד בבופר הבא. הכינו בופר חסימה (blocking buffer) המכיל 50% normal goat serum ו-0.2% Triton X 100.

לאחר הסרת ה-PBS מכל באר, הוסיפו 200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באר והמתינו לחסימה במשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו את תמיסת החסימה ושטפו שלוש פעמים. באמצעות PBS, הכינו דילול של נוגדן ראשוני בתמיסה של 90% antibody buffer ו-10% NGS, המכילה את זוג הנוגדנים הפרה- ופוסט-סינפטיים שנבחרו.

כאן נעשה שימוש בનોגדן שפנים נגד synapsin, סמן טרום-סינפטי, ובנוגדן עכבר נגד homer, סמן לאחר-סינפטי. סובב במערך צנטריפוגה של שולחן למשך חמש דקות במהירות מקסימלית כדי להסיר נוגדים ששקעו, ולאחר מכן הוסף 200 µL של תמיסת נוגדן ראשוני לכל באר. הנח את הפלטה בתוך מכל עם לחות כדי למנוע התייבשות של התמיסה הראשונית.

יש להדגיר למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר ההדגרה עם הנוגדן הראשוני. יש לשטוף כל באר שלוש פעמים. בעזרת PBS, יש להוסיף 200 µL של הנוגדנים המשניים המתאימים, בדילול של 1:1000 בתמיסת באפר לנוגדנים המכילה 10% NGS שהוכנה מראש.

כפי שנעשה קודם לכן, הניחו את הצלחת בתא הלחות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחשיכה לאחר הדגירה עם הנוגדנים המשניים. שטפו כל באר שלוש עד ארבע פעמים ב-PBS. הניחו טיפה של מדיום קיבוע vector shield עם DPI על למסחית זכוכית.

לאחר מכן, הפכו את זכוכית הכיסוי עם התאים על גבי הטיפה לצורך קיבוע. לבסוף, מרחו לק שקוף מסביב לקצוות של זכוכית הכיסוי. הקפידו להימנע מדחיפה או הזזה של זכוכיות הכיסוי במהלך המריחה.

כיוון שפעולה זו תחשוף את התאים, יש להניח לשקופיות להתייבש למשך 30 דקות לפחות במקום יבש וחשוך. בשלב זה, הדימיון מבוצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה מסוג zes axio imager המצויד בסטים של פילטרים מתאימים ועדשה אובייקטיבית עם טבילה בשמן בעלת הגדלה של 63 פעמים. הנח על בננת המיקרוסקופ שקופית המכילה תאים שאינם טרנספקטות.

השתמשו במערכת מסנני DPI להדמיית גרעיני התאים ובחרו תאים המרוחקים לפחות שני קטרי תאים משכניהם הקרובים ביותר. שימוש ב-DPI בשלב זה יסייע במניעת הטיות ויבטיח בחירה אקראית של התאים. עבור כל תא שנבחר, השגיאו תמונות של שמונה ביטים באמצעות מערכות המסננים המתאימות, ובמקרה זה, GFP ו-Texas Red.

התמונה המונחית עם צבעים פסאודו-צבעוניים צריכה להראות סממנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בצבע אדום וירוק בהתאמה. לאחר מכן, הניחו על במה של המיקרוסקופ תגית המכילה תאים שעברו טרנספקציה. במקרה זה, התאים עברו טרנספקציה עם וקטור ביטוי TD tomato.

השתמשו בסמן זה כדי לבחור תאים כפי שנעשה קודם לכן. עבור כל תא שנבחר, השיגו שמונה תמונות של בורות (pits) באמצעות סטים של מסננים מתאימים, שבמקרה זה הם GFP, Texas Red ו-Sci five. התמונה הצבעונית המדומה (pseudo colored) המונחת אחת על השנייה צריכה להציג את הסמנים הפוסט-סינפטיים בצבעי אדום, ירוק וכחול.

כאן, תוכנת ניתוח הנקודות (puncture analyzer) משמשת לכימות של נקודות סינפטיות בעלות לוקליזציה משותפת. תוסף ה-Puncta analyzer נכתב על ידי Barry Walk והוא זמין לפי בקשה ב-image J 1.26. פתח את אחת התמונות שנאספו.

השתמש בכלי הבחירה המעגלית כדי לבחור אזור ברדיוס השווה בקירוב לקוטר של תא אחד סביב ה-SOR הרלוונטי. לאחר בחירת אזור העניין, עבור לתפריט התוספים (plugins) ובחר ב-puncture analyzer. בחלון אפשרויות הניתוח שיופיע, בחר Red Channel ו-Green Channel. ראשית, בצע הפחתת רקע (subtract background) והגדר את קובץ התוצאות.

לחצו על אישור. לאחר מכן, הגדירו מיקום לשמירת התוצאות. ניתן לייצא תוצאות אלו ל-Excel לצורך ניתוח נוסף בחלון שיופיע.

לאחר מכן, ודאו שרדיוס כדור מתגלגל (rolling ball radius) של 50 נבחר, ובטלו את הסימון של אפשרות הרקע הלבן. שינוי זה אינו נדרש, אך הוא מועדף לעיתים קרובות על ידי משתמשי האפליקציה. לצורך ויזואליזציה קלה, לחצו על אישור.

חלון חדש יופיע לצד מסכה התואמת לתמונת הערוץ האדום. כוון את הסף עד שהמסכה האדומה תתאים בצורה המיטבית למספר המרבי של נקבי דקירה בודדות ונפרדות. ללא הכנסת רעש רב מדי, לחץ על "בוצע".

הגדירו את גודל הכתב המינימלי לארבעה פיקסלים. אין לשנות דבר אחר. לחצו על אישור.

חזור על השלב הקודם, הפעם עבור הערוץ הירוק. לאחר חזרה על פעולה זו עם הערוץ הירוק, התוסף יספק כמותיות המתאימות לנקודות (puncta) בכל ערוץ בנפרד, וכן לנקודות עם לוקליזציה משותפת (co localized puncta) בין שני הערוצים. בדיקת הסינפסים המוצגת כאן ניתנת ליישום על נתחים קריוגניים מהמוח ועל כל רקמה אחרת של מערכת העצבים, כגון חוט השדרה או הרשתית.

בתנאי שקיים זוג סמנים פרה- ופוסט-סינפטיים מתאימים. התחילו באיסוף רקמת מוח מעכבר שהורג באמצעות דימום ושטפה של PBS. הניחו את המוח השלם ב-4% paraldehyde ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.

שטפו את המוח שלוש פעמים ב-PBS. הגנו על המוח מהקפאה על ידי הנחתו ב-30% sucrose ב-PBS.

הרקמה תצוף בתחילה; יש לשמור אותה בטמפרטורה של 4 °C עד שהרקמה תשקע לתחתית. בשלב זה, תהליך הקריו-הגנה הושלם. לאחר מכן, בתמיסה ביחס של שניים לאחד של 20% sucrose ל-OCT ו-PBS, יש להטמיע את המוח בכיוון הרצוי עבור החיתוך.

לדוגמה, סגיטלי או קורונלי. לאחר מכן, הניחו משטח מתכת שטוח על גבי דלי של קרח יבש. הניחו עליו את המוח המוטמע כדי להקפיאו. לאחר ההקפאה, העבירו את המוח לשקית הקפאה והניחו אותם בטמפרטורה של minus 80 °C למשך עד שנה לפני החיתוך.

בעזרת קריוסטט, בצעו חיתוך קריוגני של הרקמה לפרוסות בעובי 12 עד 16 מיקרון והניחו אותן על שקופיות זכוכית. לאחר מכן, ייבשו את השקופיות על ידי הנחתן בתנור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, שטפו אותן שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר שאריות של OCT.

משתמשים בעט פאראפין ליצירת מחסום הידרופובי מסביב לזכוכית, ומוסיפים למשטח תמיסות חסימה (blocking buffer) אשר נמנעות מזליגה מהשחלוח הודות למסגרת הפאראפין. מניחים את השחלוחים ב-20% normal goat serum ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר לצורך חסימה, ולאחר מכן מניחים את החתכים בנוגדנים ראשוניים המדוללים ב-PBS עם 0.3% triton ו-10% normal goat serum.

בשלב זה, נעשה שימוש ב-rabbit anti-PSD 95 כדי לסמן מדורים פוסט-סינפטיים גלוטמטארגיים, וב-Guinea pig anti-vGlu2 כדי לסמן טרמינלים פרה-סינפטיים גלוטמטארגיים. הנח את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C והדגש למשך 36 עד 60 שעות. לאחר ההדגשה, שטוף את הנוגדן הראשוני על ידי טבילה של השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 15 דקות בכל פעם.

לאחר שלב זה, יש לוודא שהשקופיות מוגנות מאור ישיר. יש להוסיף נוגדנים שניים המדוללים ביחס של 1:200 ב-PBS עם 0.3% triton ו-10% normal goat serum. במקרה זה, goat anti Guinea pig.

נעשה שימוש ב-Alexa 488 ובנוגדן עזים נגד ארנב Alexa 594. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.

שטפו את השקופיות על ידי טבילה ארבע פעמים ב-PBS למשך 15 דקות בכל פעם לפני ההרכבה. הוסיפו טיפות קטנות של תמיסת הרכבה Vector Shield באמצעות דאפי (dappy) וכסו את השקופיות בזכוכית כיסוי. מרחו לק גליטר כדי למנוע תזוזה של זכוכיות הכיסוי.

יש לבצע דימות של חיתוכי רקמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם לייזרים מתאימים, תוך שימוש בעדשה שרויה בשמן בהגדלה של 63 פעמים עבור כל תמונת חיתוך, וחיתוכים אופטיים סדרתיים במרווחים של 0.33 micron על פני עומק כולל של חמישה microns, לסך הכל 15 חיתוכים אופטיים. יש לדמות לפחות שלושה חיתוכים מכל חיה, ולכלול לפחות שלוש חיות מכל תנאי ניסויי נתון. יש להפיק תמונות השלכה בעוצמה מרבית (maximum intensity projections) מקבוצות של שלושה חיתוכים רצופים, כך שיתקבלו חמש השלכות המייצגות עומק של micron אחד כל אחת.

אלו כוונתו בכימות באמצעות Image J כפי שתואר עבור RG Cs, עם ROI שונה כדי לקבוע את מספר הסינפסות שנוצרו בהיעדר אסטרוציטים. אימונוכימיה בוצעה על rgc מפוזלים שטופלו במצע גידול בסיסי, תוך שימוש בנוגדנים נגד bassoon המוצג באדום ונגד homer המוצג בירוק, כמצופה. נקודות מעטות מאוד של קולוקליזציה סינפטית נצפו כדי לקבוע את השפעת מולקולות המופרשות מאסטרוציטים על מספר הסינפסות שנוצרו in vitro; RG Cs מפוזלים טופלו במצע מותנה של אסטרוציטים של עכבר מדי שלושה ימים, למשך 12 ימים בסך הכל, לאחר הצביעה.

סינפסים רבים היו גלויים בנוירון זה, אך soon מוצג באדום. Homer מוצג בירוק. RDCs מופרדים שעברו טרנספקציה עם Lee ציטופלזמי המבטא TD tomato טופלו במצע גידול בסיסי בלבד. סינפסים אינם נראים.

עגבניית TD נראית בכחול ובתיס בסינפסה נראית באדום. נראה אות חלש מאוד עבור הסמן הפוסט-סינפטי homer המוצג בירוק. כאשר אותם תאים מטופלים באופן כרוני במצע מותנה של אסטרוציטים של חולדה, נראים סינפסות רבות.

כאן, TD tomato מופיע בכחול, synapsin באדום, ו-homer בירוק. מוצג RGC מטוהר שטופל במדיום מותנה של אסטרוציטים ונצבע עבור pre synapse באדום וסמני post-synaptic homer בירוק; מסכות סף שנוצרו באמצעות puncture analyzer תואמות לשני הערוצים הקיימים. לאחר זיהוי נקודות של קולוקליזציה, Puncta analyzer מפיק ייצוג גרפי של נקודות אלה.

מנתח הנקודות (puncta analyzer) מספק פלט מספרי המציין את מספר הנקודות הבודדות שזוהו בשני הערוצים ואת נקודות הקולוקליזציה. הנתונים שהופקו מניתוח נוירון זה ממחישים את היכולת של מולקולות המופרשות מאסטרוציטים לקדם יצירת סינפסים, המוצגת כאן כבדיקת סינפסים שבה כומתה הקולוקליזציה של סימון אימונוהיסטוכימי פרה-סינפטי ופוסט-סינפטי כדי להדגים את ההגברה של יצירת סינפסים מושרית-אסטרוציטים על ידי ביטוי יתר של הרצפטור הנוירונלי למולקולה הסינפטוגנית החשובה המופרשת מאסטרוציטים, thrombospondin. באיור זה מוצג המספר הממוצע של סינפסים לנוירון שטופל באופן כרוני במצע גידול בסיסי, gm, או במצע המועשר באסטרוציטים (astrocyte conditioned media).

A-C-M-A-C-M מקדם באופן חזק יותר יצירת סינפסות בתאי עצב של הרשתית (retinal ganglion cells) המבטאים באופן יתר את קולטן ה-thrombospondin בהשוואה לתאים המבטאים באופן יתר וקטור ריק. כדי לכמת את הצפיפות הסינפטית בקוליקולוס העליון (superior colliculus) של עכברים, סומנו בנפרד המדורים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים באמצעות סמנים אימונוהיסטוכימיים ספציפיים למדורים. כפי שמוצג כאן, חלה עלייה במספר הסינפסות מהיום השביעי לאחר הלידה ועד ליום ה-P 14.

דבר זה ממחיש את העלייה במספר הסינפסות ב-superior colliculus במהלך חלון זמן התפתחותי זה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים פרוטוקול זה בכשני ימים עבור תרביות עצביות מופרדות, ובכחמישה ימים עבור חתכי מוח המופקים מהחיה בעקבות הליך זה. שיטות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית, משמשות לאימות שהשינויים במספר הסינפסות משקפים שינויים בסינפסות פונקציונליות ובסינפסות תקינות מבנית (ultrastructurally), בהתאמה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליישם אימונוהיסטוכימיה על הדגימה הניסיונית שלכם לצורך כימות מספר הסינפסים. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשתמש בנוגדנים ספציפיים למדורים כדי לסמן באופן סלקטיבי מדורים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. בהקשר זה, אנו מגדירים סינפסים כנקודות של קולוקליזציה בין האותים שהתקבלו מכל אחד מהסמנים הללו.