סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אחת המטרות החשובות ביותר במדעי המוח היא להבין את הרמזים המולקולריים המנחים את השלבים המוקדמים של היווצרות סינפסות. ככזה, זה הפך להיות הכרחי לפתח גישות אובייקטיביות לכימות שינויים בקישוריות הסינפטית. כדי לכמת את מספר הסינפסות במגוון תכשירים ניסיוניים, נוירונים מתורבתים או תכשירים של רקמת מוח בחתך קריו מוכתמים בסמנים סלקטיביים לפני ואחרי סינפטיים כדי לסמן נקודות מגע סינפטיות בין נוירונים.

לאחר מכן מצלמים את התאים או הרקמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונות שמונה סיביות הנדרשות לכל אחד מהערוצים המתאימים לשני הסמנים האימונוהיסטוכימיים. התמונות מנותחות באמצעות תמונה J 1.29 עם מנתח פונקטה. כדי לקבוע את מידת הקולוקליזציה בין סמנים סינפטיים לפני ופוסט, ניתן להשתמש בנקודות של לוקליזציה כדי לקבוע את מספר הסינפסות הקיימות בתכשיר.

היתרון העיקרי של הטכניקה המתוארת כאן על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים, הוא שבדיקת הסינפסה מאפשרת ניתוח תפוקה וכימות גבוהים בהרבה של מספר הסינפסות. ההשלכות העיקריות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול בהפרעות קליניות כגון מחלת אלצהיימר, אפילפסיה או אוטיזם בהן חריגות וקישוריות סינפטית היו מעורבות כבסיס לפתולוגיה הבסיסית. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות צורות התערבות שיכולות להפחית או לשפר את הליקויים שאנו רואים ביכולת של הנוירונים המושפעים ליצור סינפסה זה עם זה.

למרות ששיטה זו שימושית לחקר התפתחות המוח, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים מודלים אחרים או מערכות איברים שבהן אתה מעוניין לחקור או לכמת את מספר המגעים בין תאים שעבורם יש לך את היכולת לתייג באופן סלקטיבי כל פנים מנוגדות של כל אתר קשר. הכן תרביות עצביות על ידי ציפוי תאי גנגליון רשתית של חולדות מטוהרים מרשתית חולדות, שנקטפו מחמש עד שבע חיות על תלושי כיסוי זכוכית מצופים בפולי דה ליצין. בצלחת של 24 בארות, התאים מורשים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד חמישה ימים לפני הטרנספקציה.

לאחר הטרנספקציה יש לדגור על התאים למשך שבעה עד שמונה ימים נוספים כדי לאפשר לסינפסות להתפתח כאשר התאים המצופים הבשילו מספיק. הסר את אמצעי התרבות מהבארות והוסף 500 מיקרוליטר של פורמלדהיד חם מראש, 4%para לכל באר קבועה למשך שבע דקות. בטמפרטורת החדר לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים במי מלח עם פוספט.

חשוב לוודא שלעולם לא נותנים לתאים להתייבש בבארות. לאחר הוצאת מאגר מבאר, יש להחליפו מיד במאגר הבא. הכן מאגר חוסם המכיל 50% סרום עיזים רגיל ו-0.2% טריטון X 100.

לאחר הסרת PBS מכל אחד, הוסיפו היטב 200 מיקרוליטר של מאגר החסימה לכל באר וחסמו למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את המאגר החוסם ושטוף שלוש פעמים. עם PBS, הכינו דילול נוגדנים ראשוני במאגר נוגדנים של 90%, תמיסת NGS של 10% המכילה את זוג הנוגדנים לפני ואחרי הסינפטיים לבחירתכם.

כאן ארנב אנטי סינפסין, סמן קדם סינפטי ועכבר אנטי הומר. נעשה שימוש בסמן פוסט-סינפטי צנטריפוגה, דילול הנוגדנים העיקרי למשך חמש דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה על גבי ספסל כדי להסיר כל נוגדן משקע, ואז להוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל אחד. ובכן הניחו את הצלחת בכלי לח כדי למנוע ייבוש של התמיסה הראשונית.

דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני. שוטפים כל באר שלוש פעמים. עם PBS, הוסף 200 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים, מדולל אחד עד 1000 במאגר נוגדנים המכיל 10% NGS מוכן.

כמו קודם, מניחים את המנה בתא הלח ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך לאחר הדגירה עם משניים. שוטפים כל באר שלוש עד ארבע פעמים עם PBS. הנח טיפה של מדיום הרכבה של מגן וקטורי עם DPI על מגלשת זכוכית.

לאחר מכן הפוך את זכוכית הכיסוי עם התאים על הטיפה להרכבה. לבסוף, מרחו לק שקוף סביב שולי החלקת הכיסוי. הקפד להימנע מדחיפה או הזזה של החלקות הכיסוי במהלך היישום.

מכיוון שזה יחלוק את התאים, אפשר לשקופיות להתייבש לפחות 30 דקות במקום יבש וחשוך. כאן, ההדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי zes axio imager המצויד בערכות פילטרים מתאימות ומטרת טבילה בשמן. הנח שקופית המכילה תאים שאינם עוברים טרנספטציה על במת המיקרוסקופ.

באמצעות ערכת מסנני DPI כדי להמחיש גרעיני תאים, בחר תאים הנמצאים במרחק של לפחות שני קוטר תאים משכניהם הקרובים ביותר. שימוש ב-DPI לשלב זה יסייע במניעת הטיה ויבטיח אקראיות של בחירת התאים. עבור כל תא שנבחר, השג שמונה תמונות סיביות באמצעות ערכות המסננים המתאימות במקרה זה, GFP וטקסס אדום.

התמונה הפסאודו-צבעונית צריכה להראות סמנים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים באדום וירוק בהתאמה. לאחר מכן, הניחו שקופית המכילה תאים שעברו טרנספטציה על במת המיקרוסקופ. כאן התאים הועברו עם וקטור ביטוי עגבניות TD.

השתמש בסמן זה כדי לבחור תאים כמו קודם. עבור כל תא שנבחר, השג שמונה תמונות בור באמצעות ערכות המסננים המתאימות במקרה זה, GFP, טקסס אדום ומדע חמש. התמונה הפסאודו-צבעונית המונחת על גבי התמונה צריכה להכיל את הסמנים הפוסט-סינפטיים באדום, ירוק וכחול.

כאן, תוכנית מנתח הפנצ'ר משמשת לכימות של ניקוב סינפטי מקומי. תוסף מנתח Puncta נכתב על ידי בארי ווק והוא זמין לפי בקשה בתמונה J 1.26. פתח אחת מהתמונות שנאספו.

השתמש בכלי הבחירה המעגלי כדי לבחור אזור בקוטר תא אחד בערך באופן רדיאלי סביב ה-SOR המבוקש. לאחר בחירת אזור העניין, עבור לתפריט התוספים ובחר מנתח פנצ'ר בחלון אפשרויות הניתוח שמופיע בחר ערוץ אדום ערוץ ירוק. הראשון מחסיר רקע וקובץ תוצאות מוגדר.

לחץ על אישור. לאחר מכן הגדר מיקום לשמירת התוצאות. ניתן לייצא תוצאות אלה לאקסל לצורך ניתוח נוסף בחלון שמופיע.

לאחר מכן, ודא שנבחר רדיוס כדור מתגלגל של 50 ובטל את הסימון באפשרות הרקע הלבן. שינוי זה אינו נדרש אך לעתים קרובות מועדף על ידי משתמשי האפליקציה. כדי להקל על התצוגה החזותית לחץ על אישור.

חלון חדש יופיע לצד מסיכה המתאימה לתמונת הערוץ האדום. התאם את הסף עד שהמסכה האדומה תתאים ככל האפשר לכמה שיותר ניקוב בודד דיסקרטי. מבלי להכניס יותר מדי רעש, לחץ על סיום.

הגדר את גודל הפיסוק המינימלי לארבעה פיקסלים. אל תשנה שום דבר אחר. לחץ על אישור.

חזור על השלב הקודם הפעם עבור הערוץ הירוק. לאחר חזרה על כך עם הערוץ הירוק, התוסף יספק כימות המתאים לפונקטה בכל ערוץ בנפרד ופונקטה מקומית משותפת בין שני הערוצים. ניתן ליישם את בדיקת הסינפסה המוצגת כאן על קטעי קריו מהמוח ועל כל רקמה אחרת של מערכת העצבים כגון חוט השדרה או הרשתית.

בתנאי שיש זוג סמנים טרום-סינפטי ופוסט-סינפטי מתאים. התחל בקצירת רקמת מוח מעכבר שעבר המתת חסד על ידי הוצאה ושפע עם PBS. הניחו את כל המוח ב-4% פרלדהיד ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת.

שטפו את המוח שלוש פעמים עם PBS. Cryo מגן על המוח על ידי הכנסתו ל-30% סוכרוז. ב-PBS.

הרקמה תצוף בתחילה בארבע מעלות צלזיוס עד שהרקמה תשקע לתחתית. בשלב זה, הגנת הקריו הושלמה. הבא בפתרון של שניים לאחד של 20% סוכרוז ל-OCT ו-PBS להטמיע brainin בכיוון הרצוי לחתך.

לדוגמה, סגיטלי או קורונלי. לאחר מכן, הניחו משטח מתכת שטוח על גבי דלי קרח יבש. הניחו עליו את המוח המוטבע להקפאה לאחר ההקפאה, העבירו את המוח לשקית הקפאה והניחו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שנה לפני החיתוך.

בעזרת קריו קריוסטט חתכו את הרקמה למקטעים של 12 עד 16 מיקרון והרכיבו על שקופיות זכוכית. לאחר מכן, יבש את השקופיות על ידי הכנסתן לתנור 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות OCT.

עט פרפין משמש ליצירת מחסום הידרופובי סביב המגלשה ומאגר חוסם מתווסף למגלשה המונע מזרימה מהמגלשה על ידי גבול הפרפין. מניחים את השקופיות בסרום עיזים רגיל 20% ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לחסום את המקום הבא. החלקים בנוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS עם 0.3% טריטון ו-10% סרום עזים רגיל.

כאן, אנטיט ארנב, PSD 95 משמש לתיוג תאים גלוטמטרגיים, פוסט-סינפטיים ושרקן ניסיונות אנטי v glu 2 משמש לתיוג מסופים פרה-סינפטיים גלוטמטרגיים. הניחו את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס ודגרו במשך 36 עד 60 שעות לאחר הדגירה. שטפו את הנוגדן העיקרי על ידי טבילת השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 15 דקות כל אחת.

לאחר שלב זה, הקפד להגן על השקופיות מפני אור ישיר. יש למרוח נוגדנים משניים מדוללים אחד עד 200 ב-PBS עם סרום עזים רגיל של 0.3% טריטון ו-10%. הנה, עז אנטי חזיר ניסיונות.

אלכסה 4 8 8 ועיז אנטי ארנב. משתמשים באלקסה 5 9 4. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.

שטפו את השקופיות על ידי טבילתן ארבע פעמים ב-PBS למשך 15 דקות כל אחת להרכבה. הוסף טיפות קטנות של מדיום הרכבה של מגן וקטורי עם dappy וכסה את השקופיות בהחלקות כיסוי. מרחו לק כדי לעכב תנועות של החלקות הכיסוי.

הדמיה של חתך רקמות צריכה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזרים מתאימים תוך שימוש ביעד טבילה בשמן פי 63 עבור כל תמונת חתך, חתכים אופטיים טוריים במרווחים של 0.33 מיקרון על פני עומק כולל של חמישה מיקרון בסך הכל 15 קטעים אופטיים. יש לדמות לפחות שלושה חלקים מכל בעל חיים ויש לכלול לפחות שלושה בעלי חיים מתנאי ניסוי נתון. צור תחזיות עוצמה מקסימלית מקבוצות של שלושה מקטעים עוקבים, והניב חמש תחזיות המייצגות מיקרון אחד של עומק כל אחת.

אלה מכומתים באמצעות תמונה J כפי שמתואר עבור RG Cs עם החזר ROI שונה כדי לקבוע את מספר הסינפסות שנוצרו בהיעדר אסטרוציטים. אימונוכימיה בוצעה על rgc מנותק שטופל במצע גידול בסיסי באמצעות נוגדנים נגד בסון המוצג באדום והומר המוצג בירוק כצפוי. מעט מאוד נקודות של קו-לוקליזציה סינפטית נצפות כדי לקבוע את ההשפעה של מולקולות המופרשות אסטרוציטים על מספר הסינפסות שנוצרו במבחנה RG Cs מנותקים טופלו במדיה מותנית של אסטרוציטים של עכבר כל שלושה ימים במשך 12 ימים בסך הכל 12 ימים לאחר הצביעה.

סינפסות רבות ניכרו בתא העצב הזה, אך עד מהרה הוא מוצג באדום. הומר מוצג ב-RDCs מנותקים ירוקים שהועברו עם עגבניות TD מבוטאות ציטופלזמיות טופלו בגידול בסיסי בלבד. סינפסות בינוניות אינן נראות לעין.

עגבנייה TD נראית בכחול וסינפסה באדום. יש מעט מאוד אות שנראה להומר הפוסט-סינפטי המוצג בירוק. כאשר אותם תאים מטופלים באופן כרוני במדיום מותנה של אסטרוציטים של חולדות, נראות סינפסות רבות.

עגבנייה TD בכחול, סינפסין באדום והומר בירוק כאן. מוצג RGC מטוהר שטופל במדיום מותנה אסטרוציטים ונצבע לקדם סינפסה במסכות סף סמן ירוק הומר אדום ופוסט-סינפטי שנוצרו באמצעות מנתח פנצ'ר תואמות את שני הערוצים הקיימים. עם זיהוי נקודות של קולוקליזציה, מנתח פונקטה מוציא ייצוג גרפי של נקודות אלה.

פלט מספרי מסופק על ידי מנתח פונקטה המציין את מספר הפונקטה הבדידה שזוהתה בשני הערוצים ועבור נקודות של לוקליזציה. הנתונים המופקים על ידי ניתוח של נוירון זה ממחישים את יכולתן של מולקולות המופרשות על ידי אסטרוציטים לקדם את היווצרותן של סינפסות המוצגות כאן כבדיקת סינפסות שבה כומת קולוקליזציה של תיוג אימונוהיסטוכימי קדם-ופוסט-סינפטי כדי להדגים את העוצמה של היווצרות סינפסות המושרה על ידי אסטרוציטים על ידי ביטוי יתר של הקולטן העצבי עבור המולקולה החשובה המופרשת באסטרוציטים מולקולה סינפטית טרומבו ספון. באיור זה מוצג המספר הממוצע של סינפסות לנוירון שטופלו באופן כרוני במצע גדילה בסיסי, gm או במדיה מותנית אסטרוציטים.

A-C-M-A-C-M מקדם חזק יותר את היווצרות הסינפסות בתאי גנגליון ברשתית על פני ביטוי קולטן ה-thrombo spon בהשוואה לתאים על פני ביטוי וקטור ריק. כדי לכמת את הצפיפות הסינפטית בקוליקולוס העליון של העכבר, תאים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים סומנו בנפרד באמצעות סמנים אימונוהיסטוכימיים ספציפיים לתא. כפי שמוצג כאן, חלה עלייה במספר הסינפסות מהיום השביעי לאחר הלידה ל-P 14.

זה ממחיש את הגידול במספר הסינפסות באולוס העליון במהלך חלון זמן התפתחותי זה. לאחר השליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך כיומיים עבור תרביות עצביות מנותקות ותוך כחמישה ימים עבור קטעי מוח מקציר מהחיה לאחר הליך זה. שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופ אלקטרונים משמשות כדי לוודא שהשינויים במספר הסינפטי משקפים שינויים הן בסינפסות תפקודיות והן בסינפסות אולטרה נורמליות מבחינה מבנית בהתאמה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליישם אימונוהיסטוכימיה על ההכנה הניסיונית שלך לכימות מספר הסינפסות. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשתמש בנוגדנים ספציפיים לתא כדי לתייג באופן סלקטיבי תאים לפני ופוסט-סינפטיים. בהקשר זה, אנו מגדירים סינפסות כנקודות של קולוקליזציה בין האותות המתקבלים מכל אחד מהסמנים הללו.