Name: סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: למדו כיצד לכמת מספר סינפסות בתרביות נוירונים ובחתכי מוח באמצעות אימונוציטוכימיה. השיטה משתמשת בסמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים לזיהוי קולוקליזציה וניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותוכנת ImageJ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

במעבדה של בן א בארס (אוניברסיטת סטנפורד).: Puncta Plug-in עבור תמונה J נכתב על ידי בארי ווארק (ייעוץ Physion הכתובת הנוכחית) Analyzer מימון; <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלפרד פ &#39;סלואן קרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסתר א ויוסף Klingenstein קרן, Inc </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחבה מחקר ביו קרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרופה יוזמת מחלת הנטינגטון s </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay סינפסה שתוארו לעיל מבוסס בהקשר של מטרות הניסוי שלנו, שבו אנו מתמקדים בעיקר על תחזיות מעוררות של RGCs, לא מטוהרים תרבות או בחלק המוח. סיפקנו שולחן התייחסות לרישום נוגדנים פועלות היטב עבור תיוג סינפסות מעוררות (טבלה 1). Assay זה סינפסה ניתן להתאים לכמת מספר סינפסה האוכלוסייה כל הנוירונים או תת סינפטיים אחרים שבהם קיים סמן טרום postsynaptic סלקטיבית. לדוגמה, assay סינפסה המתואר כאן ניתן להחיל ללמוד סינפסות GAB...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> אנטיגן </td><td> מין </td><td> חד שבטיים / polyclonal </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> מהילה </td><td> יצירות תרבות </td><td> העבודות בסעיפים </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presynaptic </td><td> Synapsin </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> בסון </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Assay עיצובים </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> בסון </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> קביה </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptic </td><td> PSD-95 (6G6 1C9-clone) </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> זיקה ביו ריאגנטים </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> הומר </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> הומר </td><td> עכברוש </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> ארנב </td><td> Polyclonal </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> עכבר </td><td> חד שבטיים </td><td> Synaptic מערכות </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רשימת דוגמאות של סמנים טרום postsynaptic טוב שיש לנו מנוצל בהצלחה assay סינפסה שלנו. שימו לב כי זו אינה רשימה ממצה של כל סמנים זמינים. Y = כן, N = לא, ND = לא נקבע. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> חתול. לא. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poly-d-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield עם DAPI </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> אוקטובר </td><td> רקמות-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> טריס-Base (50 מ&quot;מ) </td><td> דיג </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA פתרון </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> גרעיניים PFA </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 גם תרבות צלחת </td><td> בז </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר עיזים אלקסה נוגדנים מצומדות </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> אספקה </td><td> חברה </td><td> חתול. לא. </td></tr><tr><td> 12mm, מס &#39;0 זכוכית coverslips </td><td> קרל הכט GmbH </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> מס &#39;1.5 זכוכית coverslip (עבור פרוסות) </td><td> VWR מדעי </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> שקופיות הזכוכית </td><td> VWR מדעי </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

סינפסות כימות: assay immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

אחת המטרות החשובות ביותר בחקר המוח היא להבין את הרמזים מולקולרית להורות כי בשלבים המוקדמים של היווצרות הסינפסה. ככזה זה הפך להיות הכרחי לפתח גישות אובייקטיבי לכמת שינויים קישוריות סינפטי. החל מ קיבעון המדגם, זה פרטים פרוטוקול איך לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה. מספר colocalizations אלה היא לכמת באמצעות תקע Puncta Analyzer (שנכתב על ידי Bary ווארק, זמין על פי דרישה, cellbio.duke.edu c.eroglu @) תחת פלטפורמת תוכנה לניתוח ImageJ. Assay סינפסה המתואר פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל הכנה או רקמה עצבית תרבות שעבורו יש לך סמנים טרום postsynaptic סלקטיבית. זה assay הסינפסה היא כלי רב ערך אשר יכול להיות מנוצל באופן נרחב במחקר של התפתחות הסינפטי.

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אחד היעדים החשובים ביותר במדעי המוח הוא להבין את הרמזים המולקולריים המנחים את השלבים המוקדמים של היווצרות סינפסה. ככזה, הדבר הפך ל...

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מדגים הדמיה של תאים חיים של טופולוגיית סינפסות אימונולוגיות, וחוקר את יחסי הגומלין בין לימפוציטים מסוג T לבין תאי אפיתל הנושאים אנטיגנים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תזוזה של ציטופלסמה אדומה וטבעות קרום צהובות בתאי אנדותל, דבר המצביע על היווצרות סינפסות אימונולוגיות.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של פרוסת מוח עכבר כדי לכמת את ההתפלגות של חלבון קדם-סינפטי מסוים. התהליך כולל חסימת אתרים לא ספציפיים, החלת נוגדנים ראשוניים לחלבון המטרה וסמן ייחוס, ולאחר מכן תיוג נוגדנים משני והכתמת נגד גרעינית. סמן הייחוס מבטיח כימות מדויק על ידי מתן קו בסיס עקבי, והתפלגות החלבון הפרה-סינפטי מנותחת על פני אזורי מוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

מקור: McLeod, F., et al. הערכת צפיפות הסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים בהיפוקמפוס. J. Vis. Exp. (2017). סרטון זה מדגים שיטה להמחשת סמנים סינפטיים בפרוסות מוח בהיפוקמפוס באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי קונפוקלי. הפרוסות מוכתמות במערכת החיסון בנוגדנים ראשוניים המכוונים לסמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. הסמנים המסומנים מוצגים לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את הארכיטקטורה הסינפטית באמצעות הקו-לוקליזציה שלהם.

ניתוח מיקרוסקופי של סינפסות בפרוסות היפוקמפוס של עכבר באמצעות אימונופלואורסצנציה

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

למדו כיצד לכמת מספר סינפסות בתרביות נוירונים ובחתכי מוח באמצעות אימונוציטוכימיה. השיטה משתמשת בסמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים לזיהוי קולוקליזציה וניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותוכנת ImageJ.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

גלה סרטונים נוספים