Name: לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד לכמת התפלגות הטרוגנית של חלבונים סינפטיים במוח העכבר באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו משתמשת ביחסי עוצמת פלואורסצנציה לניתוח מדויק של דפוסי חלבון ברקמות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מעולה. המחברים להכיר תמיכה על ידי הרמס Pofantis ו Andoniya Petkova. המחברים גם תודה מכון מדעי המוח האירופית השימוש של LSM800, סיוע טכני, במיוחד על ידי ד ר נילס Halbsgut. עבודה זו מומן על ידי גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת. JSV מאשר תמיכה על ידי המרכז עבור ננו מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB).

פרוטוקול זה אינו כרוך בניסויים בבעלי חיים. בניסויים המערבים המתות חסד של בעלי החיים כדי להשיג דגימות המוח אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת מספר אישור T 10/30.
הערה: עבור פרוטוקול זה, 3 עכברים C57BL/6 מבוגרים זכר שימשו.
1. הכנת הדוגמא
<ol><li>להכין מקבע מאגר פוספט 0.1 M (PB; ראה טבלה 1).</li>
	<li>לתקן את החיה על-ידי transcardial זלוף כפי שמתואר Gage. et al. 28. קודם לשטוף את הדם עם 0.9% NaCl-פתרון, אז perfuse עם 30 מ של 4% paraformaldehyde (PFA).</li>
	<li>לפתוח את הגולגולת עם מספריים ולבודד בזהירות בעזרת כפית עם קצוות קהים כדי למנוע נזק לרקמת המוח.</li>
	<li>מלא צינור תגובה 50 מ עם מקבע, postfix המוח ב- 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>הסר את מקבע, לשטוף את המוח ב- 50 מ של 0.1 M PB-מטרף למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר הרחצה, דגירה המוח בשפופרת תגובה 50 מ ב- 30% סוכרוז ב PB 0.1 M 48 שעות או עד שהיא שוקעת בצינור ב 4 ° C עבור cryoprotection.</li>
	<li>לקצץ את המוח cryoprotected עם סכין חדה, מניחים אותה cryomold, תטביע אותו עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. להימנע בועות. אוריינט המוח, להקפיא את cryomold במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>הר הרקמה קפוא על חלוקתה. Equilibrate את הרקמה כדי הטמפרטורה cryomicrotome למשך לפחות 15 דקות לפני חלוקתה.</li>
	<li>בסעיף המוח 25 מיקרומטר הילתית פרוסות עבות. לגעת OCT בזהירות עם קרס זכוכית בלי לגעת על רקמת המוח. לאסוף 3 סמוך פרוסות לכל באר היטב צלחת 24 ואחסן אותם ב- 0.1 M PB ב 4 ° C עד מכתים. הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עד שבועיים. עוד פעמים אחסון ניתן לשבש מאיכות רקמות, ובכך להשפיע על תוצאות הניסוי.</li>
</ol>2. immunofluorescence
<ol><li>להכין פתרונות כולל מאגר חסימה, מאגר נוגדן, שטיפת מאגר 1, ומאגר כביסה 2 (ראה טבלה 1).</li>
	<li>לשטוף פרוסות פעם אחת עם חמאת בוטנים כדי להסיר עודפי OCT.<ol>
<li>הסר את הפתרון עם פיפטה פלסטיק ללא מכניסה את פרוסות המוח. להוסיף 250 µL של חמאת בוטנים טריים עם פיפטה µL 1000. התראה: פרוסות צריך לא יתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים טוב מאת טוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את חמאת בוטנים עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 מאגר חסימה לכל באר עם פיפטה 1000 µL. תקופת דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על ניעור.</li>
	<li>במהלך זמן הדגירה, לדלל הנוגדנים העיקרית במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב. הערה: כדי לקבוע את הרקע פלורסצנטיות, stainings יש גם לבצעו ללא הוספת נוגדן ראשוני. בשביל זה, דגירה הפרוסה ב נוגדן פתרון ללא נוגדנים העיקרי לפי הפרוטוקול.</li>
	<li>לאחר זמן הדגירה, להסיר את המאגר חסימה עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים העיקרי לכל טוב. דגירה פרוסות עם נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C-מטרף.</li>
	<li>ביום למחרת, לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 1 3 x 10 דקות ב RT-מטרף.<ol>
<li>להסיר את המדיום עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 300 µL לרחוץ את מאגר 1 לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 10 דקות חוזרת 3 פעמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במהלך השלבים כביסה, לדלל הנוגדנים משני מצמידים fluorophore במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב. התראה: בגלל הנוגדנים הם רגישים לאור, כל הצעדים מנקודה זו ואילך יש לבצע בחושך.</li>
	<li>אחרי הצעדים כביסה, הסר הכביסה מאגר עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים משניים לכל טוב. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים משניים עבור 90 דקות ב RT בחושך.</li>
	<li>לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 2 3 x 10 דקות ב- RT.</li>
	<li>במהלך השלבים כביסה, לדלל 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב PB 0.1 M בריכוז של 1:2000.</li>
	<li>להסיר את המאגר כביסה 2 עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של דאפי פתרון לכל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT-ניעור.</li>
	<li>להסיר את הפתרון דאפי עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 500 µL של 0.1 M PB לכל באר עם פיפטה 1000 µL.</li>
	<li>הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ.<ol>
<li>בשקופית מיקרוסקופ תחת סטריאוסקופ המקום. עם מברשת בסדר, להוסיף 3 טיפות נפרדים של 0.1 M PB אותן לשקופית. מניחים פרוסה אחת לכל טיפה על גבי השקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>השתמש בכלי מברשת בסדר כדי לרדד, אוריינט את הפרוסות על השקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>כאשר כל הפרוסות ממוקמות כהלכה, להסיר את עודף חמאת בוטנים עם טישו ויבש השקופית בקפידה. זהירות: הימנעו ייבוש את פרוסות המוח לגמרי.</li>
		<li>הוסף µL 80 הטבעה בינוני אותן לשקופית. בזהירות הנמך את coverslip על גבי השקופית, ובכך להטביע את פרוסות המוח.</li>
		<li>להשאיר את השקופיות להתייבש בשכונה fume במשך 1-2 h (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>לאחר המדיום ההטבעה לחלוטין מוקשה, במקום השקופית מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הערה: מיקרוסקופ Epifluorescence בשילוב עם תוכנת deconvolution אמור להניב איכות תמונה דומה.</li>
	<li>התאם את הגדרות לייזר על-ידי הגדלת או הקטנת עוצמת לייזר עבור כל ערוץ כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.</li>
	<li>רוכשים את רקמות וירטואלי של הפרוסה כל המוח עבור הערוצים השונים.<ol>
<li>בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), בחרו באפשרות ' אריחים ', ניסחו באופן ידני על הפרוסה המוח בעזרת הגדרת אזור אריח.</li>
		<li>להפיץ נקודות תמיכה ברחבי אזור אריח ולהתאים את המוקד על הנקודות התמיכה השונים על-ידי הקשת לוודא אריח אזורים/תפקידים.
</li>
		<li>התאם את ההגדרות במצב רכישה בהתאם לגודל הרצוי הרזולוציה ואת הקובץ של התמונה שתיווצר ולהתחיל את הסריקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עם סיום הסריקה, השתמש בפונקציה Stitching לעבד את הרקמה וירטואלי. לייצא את הקובץ. tif עם הפונקציה לייצא את התמונה.</li>
</ol>4. המחשב המבוסס על ניתוח
<ol><li>לטעון כל הערוצים יחיד עבור תמונה אחת לתוך פיג'י29 על ידי לחיצה על קובץ | פתוח.</li>
	<li>בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית , ניסחו אחד בחצי הכדור דאפי-הערוץ. ליצירת מסיכה של הבחירה על ידי לחיצה עריכה | בחירה | יצירת מסיכת.</li>
	<li>לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד (Mover ו- synaptophysin) על ידי לחיצה נתח | מדד. הערה: הקפד לבחור את הערוצים השונים כדי לקבוע את ערכי העוצמה של זריחה מתכוון לכל ערוץ.</li>
	<li>העתק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד לתוך גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע עבור הערוצים יחיד באזור עניין על ידי בהתוויית האזור גם בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית . השתמש אטלס מוח של עכבר כהפניה.</li>
	<li>חזור על הצעדים 4.1-4.5 כל האונות ואת כל תחומי עניין. הערה: לקבוע את הערכים עבור האונה כל בנפרד על מנת מאוחר יותר להשוות את הערכים באזור לעניין זה בחצי הכדור הצפוני (ראה שלב 5.2).</li>
</ol>5. נתונים טיפול
<ol><li>במקרה הרקע הוא גבוה (ראה דיון), ייתכן שיש צורך חיסור רקע. בשביל זה, לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע על הפרוסה ללא ראשי נוגדן כנגד החלבון הפניה (כאן: synaptophysin) החסר ערך זה מ כל הערכים שהתקבלו עבור אזורים במוח והאונות.</li>
	<li>מתי נקבע עוצמות קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין (ראו טבלה 3), לחשב את היחס שבין Mover כדי synaptophysin על-ידי חלוקת הערך עבור Mover לפי הערך עבור synaptophysin ( צהוב בטבלה3). בצע פעולה זו עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין בנפרד.</li>
	<li>לחלק של היחס שהתקבל עבור אזור אחד של עניין על-ידי היחס שהתקבל עבור הכדור המתאים (כתום בטבלה3) כדי לקבוע את היחס של האזור בעל עניין הכדור.</li>
	<li>כדי לקבוע את השפע Mover היחסי, לתרגם את היחס שהתקבל ב- 5.2 באחוזים על-ידי קביעת שלו סטייה 1 (אדום בטבלה3). יחס של 1.25 ייתן לכן שפע Mover היחסי של 25% מעל הממוצע, יחס של 0.75 יניב שפע Mover היחסי של 25% מתחת לממוצע.</li>
</ol>

<ol><li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).</li>
<li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li>
<li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li>
<li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+p38%3A+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li>
<li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li>
<li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li>
<li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicular+GABA+transporter%2C+VGAT%2C+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic%2C+Presynaptic%2C+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li>
<li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+%3A+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li>
<li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li>
<li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+M+%22Understanding+the+molecular+diversity+of+GABAergic+synapses%22">Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses</a>. 5, 1-12 (2011).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li>
<li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li>
<li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network%3A+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li>
<li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tprg%2C+a+gene+predominantly+expressed+in+skin%2C+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li>
<li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation%3A+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li>
<li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Körber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li>
<li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+in+brain+sections%3A+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , ACADEMIC PRESS. (2001).</li>
<li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li>
<li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים שונים על פני פרוסות מבוטלות ומאפשרים לקבלת תיאור כמותי.
כמו עם כל פרוטוקול immunofluorescence, איכותי או כמותי, מספר גורמים יכולים להשפיע על ההצלחה, ובכך וחיסול הניתוח. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיו...

התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה1. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח2, נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics3, 4 , 5. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפטיים שונים על פני אזורים במוח.
השיטות של בחירה על כימות של חלבונים סינפטיים - כה - הן ספקטרומטר מסה המערבי סופג, במקום אימונוהיסטוכימיה6,7,8,9. במקרים מסוימים, מספר שיטות משמשות משלימים אחד את השני כדי להעריך את הכמות וגם הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים (קרי, וילהלם. et al. 10). שיטת נתאר כאן מאפשרת התאמה לשפות אחרות, כימות של חלבונים עניין ללא צורך באמצעות כל שיטה ביוכימית, פשוט העסקת immunofluorescent stainings. יתרון נוסף כאן הוא כימות יכול להיעשות על אזורים הרבה יותר קטן, לכן, ספציפיות יותר, מאשר אלה מושגת על ידי שיטות אחרות. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי חלבון התייחסות אמין יש צורך להעריך את ההתפלגות של החלבון עניין.
צביעת פלורסנט מאת אימונוהיסטוכימיה מאפשר לנו לזהות באופן שגרתי הלוקליזציה של חלבונים על פני אזורים במוח, כמו גם בתוך תאים עצביים שונים. כדי לזהות את מדורים שונים, משמשות סמני ספציפיים. בדרך כלל, נוגדנים נגד סינפסין ו synaptophysin11 ניתן לתייג הסינפטיות, בעוד נוגדנים נגד בסון תווית האזור הפעיל של מסוף presynaptic12. Vesicular מובילים, כגון שנאים גלוטמט vesicular (vGluT) או גאבא vesicular טרנספורטר (vGAT), משמשים להוספת תווית סינאפסות13 ו מעכבות14 מסופי presynaptic, בהתאמה. בצד postsynaptic, נוגדנים נגד החלבון הומר יכול להיות מועסק כדי לסמן מסופי postsynaptic ולאחר נוגדנים נגד צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD95)15,16,17 או gephyrin18 , 19 , 20 יכול תווית מסופי postsynaptic סינאפסות או מעכבות, בהתאמה. באמצעות נוגדנים נגד חלבון של עניין סמנים כגון אלה שתוארו לעיל, ניתן לקבוע הלוקליזציה של חלבון כזה. מחקרים רבים עד היום לעשות את זה באופן איכותי21 עם זאת, כדי לקבוע באופן אמין ההתפלגות דיפרנציאלית של חלבון ספציפי סינפטית, אחד חייב לא רק לקבוע נוכחותו או היעדרות אלא גם הריכוז היחסי שלו. את הטרוגניות בגדלים וצפיפות של הסינפסות הופך חשוב להקים יחס בין דה מרקר סינפטית החלבון עניין. אחרת, סינפסה-עשיר אזורים כגון שכבות שאינן פירמידה של ההיפוקמפוס, השכבה המולקולרית של הצרבלום יראה צפיפות גבוהה של חלבונים סינפטיים, רק בשל צפיפות גבוהה יותר של הסינפסות אך לא בשל נוכחות חזקה של חלבון זה כל סינפסה (למשל, Wallrafen, Dresbach1). מצד שני, חלבונים ב- סומא עצביים (למשל, TGN3822) בדרך כלל יראה נוכחות חזקה שכבת תאים כפירמידה בהיפוקמפוס או שכבת תאים בהיפוקמפוס או אסטרוציטומה גרגר בשל הריכוז הגבוה של גופי תאים עצביים באזורים אלו. לכן, התפלגות זו אי-הומוגניות של מבנים, במקרה זה synapses, יכול להוביל שערוך שווא של ההתפלגות של החלבון עניין עצמו. יתר על כן, יש השתנות מהותי צביעת עוצמות מדגמים ב- immunohistochemical stainings. הפרוטוקול המתואר כאן לוקח זאת בחשבון ומונעת הטיות כזה, כמו גם אזהרות אחרים הנובעים משימוש בשיטות immunohistochemical.
האחרונים שלנו לומדים, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי לתאר את הביטוי דיפרנציאלית של Mover (הנקרא גם TPRGL23 או SVAP3024) על פני אזורים שונים במוח116. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות סינפטית זה ניתן למצוא האגודה כדי הסינפטיות ומשפיע על2726,25,שחרור נוירוטרנסמיטר. לנו יש הקשורים לביטוי Mover שפע הסינפטיות, על ידי צביעת עבור synaptophysin כסמן הפניה שלפוחית סינפטית. מצאנו רמות גבוהות של Mover בפרט גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית pallidum על הגחון, האמיגדלה. בתוך ההיפוקמפוס, מצאנו בהתפלגות הטרוגנית של Mover, עם רמות גבוהות הרבדים הקשורים למחשוב אינטרה-בהיפוקמפוס, רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט.

<table><tbody><tr><td>צינורות תגובה של 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תגובה של 50 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 087721H</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מפלסטיק (חד פעמי)</td><td>Sarstedt</td><td>861,176</td><td></td></tr><tr><td>1000 מ"ל פיפטה</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; </td><td></td>17014382</tr><tr><td>פיפטה 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>שקופיות מיקרוסקופ IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>מקפיא מיקרוטום</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Roche</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>11666789001</tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P6148-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>רקמות טק</td><td>סאקורה&nbsp;</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>1,063,460,500</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Merck Millipore</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Merck</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>ארנב Anti-Mover</td><td>Synaptic Systems</td><td>RRID: AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>שרקנים אנטי-סינפטופיזין</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>RRID: AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-עכבר AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2337438</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>475904</tr><tr><td>ZEN2 כחול תוכנה</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopy תוכנה</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Analysis תוכנה</td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת immunofluorescence

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

נציג מכתים דפוסים של סמנים שונים ניתן לראות באיור1. התבנית משתנה בהתאם להתפלגות של החלבון. דוגמאות של חמש רמות rostro-סימטרית מוצגים בעמודות (א)-(E). צביעת דאפי נציג מוצג בשורה הראשונה: דאפי לאנאפוליס ה-DNA של התא, ובכך גרעינים מוכתמים. התוצאה היא דפוס punctate. אזורים עם צפיפות גבוהה תא בהירים יותר אזורים עם צפיפות נמוכה התא. ניתן לראות דוגמא לכל חלבון heterogeneously מבוזרת בשורה השניה. מצביע התזוזה מכתים מגלה התפלגות דיפרנ...

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

כאן אנו מתארים פרוטוקול המעסיק שפעת חיסונית, מיקרוסקופיה קונפוקנטית וניתוח מבוסס מחשב כדי לקבוע את התפלגות החלבון הסינפטי ביחס לחלבון ייחוס. השיטה שלנו עוקפת את השונות הטבועה בכתמי שפעת חיסונית באמצעות יחס ולא רמות פלואורסצנטיות מוחלטות. בנוסף לשיטה זו ניתן לנתח את ההטרוגניות של חלוקת החלבון ברמות שונות.מפרוסות מוח שלמות לאזורי מוח לאזורים תת-אזוריים כמו השכבות השונות של ההיפוקמפוס. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לקבוע את התפלגות החלבון ברקמות שונות מלבד המוח ומערכות מודל מלבד עכברים. התחל על ידי שטיפת מוח עכבר מבודד וקבוע בעבר כמתואר בכתב היד.ואז להעביר את המוח לצינור תגובה 15 מיליליטר עם 30% סוכרוז 0.1 PB טוחנת. כדי להגן על המוח דגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות או עד שהוא שוקע. לאחר מכן להשתמש בלהב חד כדי לקצץ את המוח המוגן קריו בהתאם לאזור העניין. לאחר מכן מניחים את המוח בתבנית קריו ומוסיפים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי להטמיע אותו כדי למנוע בועות ולכוון את המוח כראוי כדי שיהיה מישור קורונטל של חיתוך.מניחים את עובש ההקפאה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהוא קפוא מוצק. הר את הרקמה הקפואה על מיקרוטום ההקפאה והמתן לפחות 15 דקות לפני הקטע כדי לצייד אותה לטמפרטורת המיקרוטום. התחל לחתוך את המוח לפרוסות קורונדל בעובי 25 מיקרומטר.השתמש וו זכוכית OCT של הפרוסה הראשונה בזהירות מבלי לגעת ברקמת המוח. האוקטובר ידבק לוו הזכוכית. השתמש וו זכוכית כדי להעביר את פרוסת המוח לתוך הראשון גם.לאסוף שלוש פרוסות סמוכות לגם בצלחת 24 גם מלא PB 0.1 טוחן. מאחסנים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס עד להכתמתן עד שבועיים. כדי להכין את הפרוסות עבור כתמים חיסוניים להשתמש צינור פלסטיק כדי להסיר את פתרון PB מ באר אחת מבלי לצייר את פרוסות המוח. לאחר מכן השתמש צינור 1000 מיקרו ליטר להוסיף 250 microliters של PB טרי לשטוף אותם של עודף OCT.חזור על כביסה זו עבור כל באר באותו זמן, כדי למנוע ייבוש הפרוסות. לאחר מכן, השתמש צינור פלסטיק כדי להסיר את פתרון PB מהבאר הראשונה. השתמש צינור 1000 microliter להוסיף 250 microliters של חיץ חסימה לכל באר עובד היטב על ידי גם שוב.דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר על שייקר במשך שלוש שעות. במהלך הדגירה להוסיף 250 microliters של מאגר נוגדנים לגם לצינור תגובה. לאחר מכן השתמש צינור 2 microliter להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן צינורות אותו ישירות לתוך הפתרון בעדינות צינור למעלה ולמטה מספר פעמים לערבב.ואז מערבולת זה נוגדן מדולל כדי לא בטוח ערבוב תקין. עובדים היטב על ידי הסרת חיץ החסימה עם צינור פלסטיק ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני ל הבאר. דגירה את הצלחת על שייקר בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת להסיר את פתרון הנוגדן עם צינור פלסטיק. לשטוף את הפרוסות עם 300 microliters של חיץ כביסה אחד לכל גם שלוש פעמים עשר דקות כל לשטוף על שייקר בטמפרטורת החדר. במהלך הכביסה, עובד בחושך, לדלל את הפלואור עבור נוגדן שני כמה בצינור תגובה באותו אופן כפי שנעשה בעבר עם הנוגדן העיקרי.לאחר הכביסה הושלמה להסיר את מאגר הכביסה עם צינור פלסטיק ולהוסיף 250 microliters של פתרון נוגדנים משני לכל באר. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לאחר הדגירה הושלמה להסיר את פתרון הנוגדן עם צינור פלסטיק.לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם מאגר כביסה שתיים באותו אופן כמו עם חיץ כביסה אחד. במהלך כביסה זו לדלל כתם DAPI ב 0.1 PB טוחן כדי להשיג ריכוז אחד עד 2000. לאחר הסרת מאגר הכביסה מהצלחת מוסיפים 250 מיקרוליטרים של פתרון DAPI ו דגירה בטמפרטורת החדר על השייקר במשך 5 דקות.לאחר הסרת פתרון DAPI עם צינור פלסטיק להשתמש צינור 1000 microliter להוסיף 500 microliters של 0.1 PB טוחן לבא. מקם שקופית מיקרוסקופ מתחת לסטריאוסקופ. השתמש במברשת עדין כדי להוסיף שלוש טיפות נפרדות של 0.1 PB טוחן על השקופית.בעזרת המברשת מניחים פרוסה אחת בכל טיפה בשקופית ולאחר מכן משטחים ומכווןים את הפרוסות. לאחר שכל הפרוסות ממוקמות כראוי להשתמש ברקמת נייר כדי להסיר PB עודף להתייבש בזהירות מבלי לייבש את הפרוסות לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטרים של מדיום הטבעה על השקופית וכסו אותה בזהירות עם פתק כיסוי כדי להטמיע את פרוסות המוח.מכסים את השקופיות כדי למנוע חשיפה לאור ולהשאיר אותם להתייבש מכסה המנוע אדים במשך שעה עד שעתיים ולאחר מכן לאחסן אותם בתיבת שקופית מיקרוסקופ בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר רכישת רקמות וירטואליות של פרוסת המוח כולה עבור ערוצים שונים כמתואר בכתב היד לטעון את כל הערוצים בודדים או תמונה אחת לתוך FIJI על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן לפתוח. לאחר מכן השתמש בכלי בחירת היד החופשית כדי לתוות חצי כדור אחד בערוץ DAPI.לחץ על עריכה ולאחר מכן על בחירה ולאחר מכן צור מסיכה ליצירת מסיכה של האזור הנבחר. לאחר מכן לחץ על לנתח ולאחר מכן למדוד חלקיקים כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור ערוצים בודדים. הקפד לבחור ערוצים בודדים כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעים עבור כל ערוץ.לאחר מכן, העתק את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הערוצים הבודדים לגיליון אלקטרוני. כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הערוצים הבודדים באזור מעניין, קבעו את האזור בעזרת הכלי לבחירת יד חופשית. לאחר הכתמה עם DAPI אשר כתמים גרעיני המוח חלקים יש דפוס punctate ואזורים עם צפיפות תאים גבוהה בהירים יותר מאשר אזורים עם צפיפות תאים נמוכה.כתמים בנוגדן Mover חשפו הפצה הטרוגנית עם אזורי נקודה חמה בהירים ואזורים מעומעמים ברחבי המוח, שם כמו Synaptophysin חשף הפצה הומוגנית יותר. שכבת-על של תמונות הראתה את ההתפלגות המפרזת של פלואורסצנטיות אדומה המצביעה על חלבון Mover בהשוואה פלואורסצנטיות ירוקה המציינת סינפטופיצין. לאחר ניתוח כימות אומר ערכי עוצמת פלואורסצנטיות עבור ערוצים שונים על פני ההמיספרות על פני תחומי העניין נקבעו הן Mover ו Synaptophysin.היחסים של ערכי פלואורסצנטיות ההובר לערכי פלואורסצנטיות סינפטופיצין מראים את ההתפלגות ההטרוגנית של Mover עם אזורים של רמות מוובר גבוהות ונמוכות יחסית לווסקים סינפטיים. השפע היחסי של ה-Mover היחס באזור עניין אחד בהשוואה לזה שמעבר להמיספרה ותורגם לאחוז הראה כמה Mover קיים בתחום עניין אחד ביחס לממוצע. שפע יחסי של הובר נקבע עבור שכבות שונות בשדות המשנה של ההיפוקמפוס.שלושת אזורי העניין מכומתים על ידי השוואת היחס בשכבות המתאימות ליחס של חצי הכדור המתאים. הליך זה יכול בקלות להיות מותאם בשילוב עם טכניקות הדמיה שונות כגון מיקרוסקופ רזולוציה סופר כדי לקבוע בנוסף את התפלגות תת הסלולר של החלבון של עניין. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות מודל שונות כגון מהונדסים גנטית או בעלי חיים שטופלו בסמים.זה יכול לאפשר גישה השוואתית על פני תנאי ניסוי שונים או אפילו מינים.

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של פרוסת מוח עכבר כדי לכמת את ההתפלגות של חלבון קדם-סינפטי מסוים. התהליך כולל חסימת אתרים לא ספציפיים, החלת נוגדנים ראשוניים לחלבון המטרה וסמן ייחוס, ולאחר מכן תיוג נוגדנים משני והכתמת נגד גרעינית. סמן הייחוס מבטיח כימות מדויק על ידי מתן קו בסיס עקבי, והתפלגות החלבון הפרה-סינפטי מנותחת על פני אזורי מוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מאמר זה ממחיש כיצד ניתן לכמת את הביטוי של קולטני נוירוטרנסמיטורים ולנתח את הדפוס בסינפסות עם אלמנטים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מזוהים באמצעות שילוב של התמרה ויראלית של כלים אופטוגנטיים וטכניקת תיוג חיסוני העתק הקפאה-שבר.

בשילוב optogenetic ולהקפיא-שבר Replica immunolabeling לבחינת הסדר ספציפי קלט של גלוטמט הקולטנים עכבר האמיגדלה

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

למד לכמת התפלגות הטרוגנית של חלבונים סינפטיים במוח העכבר באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו משתמשת ביחסי עוצמת פלואורסצנציה לניתוח מדויק של דפוסי חלבון ברקמות שונות.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

גלה סרטונים נוספים