לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

כאן אנו מתארים פרוטוקול המעסיק שפעת חיסונית, מיקרוסקופיה קונפוקנטית וניתוח מבוסס מחשב כדי לקבוע את התפלגות החלבון הסינפטי ביחס לחלבון ייחוס. השיטה שלנו עוקפת את השונות הטבועה בכתמי שפעת חיסונית באמצעות יחס ולא רמות פלואורסצנטיות מוחלטות. בנוסף לשיטה זו ניתן לנתח את ההטרוגניות של חלוקת החלבון ברמות שונות.

מפרוסות מוח שלמות לאזורי מוח לאזורים תת-אזוריים כמו השכבות השונות של ההיפוקמפוס. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לקבוע את התפלגות החלבון ברקמות שונות מלבד המוח ומערכות מודל מלבד עכברים. התחל על ידי שטיפת מוח עכבר מבודד וקבוע בעבר כמתואר בכתב היד.

ואז להעביר את המוח לצינור תגובה 15 מיליליטר עם 30% סוכרוז 0.1 PB טוחנת. כדי להגן על המוח דגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות או עד שהוא שוקע. לאחר מכן להשתמש בלהב חד כדי לקצץ את המוח המוגן קריו בהתאם לאזור העניין. לאחר מכן מניחים את המוח בתבנית קריו ומוסיפים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי להטמיע אותו כדי למנוע בועות ולכוון את המוח כראוי כדי שיהיה מישור קורונטל של חיתוך.

מניחים את עובש ההקפאה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהוא קפוא מוצק. הר את הרקמה הקפואה על מיקרוטום ההקפאה והמתן לפחות 15 דקות לפני הקטע כדי לצייד אותה לטמפרטורת המיקרוטום. התחל לחתוך את המוח לפרוסות קורונדל בעובי 25 מיקרומטר.

השתמש וו זכוכית OCT של הפרוסה הראשונה בזהירות מבלי לגעת ברקמת המוח. האוקטובר ידבק לוו הזכוכית. השתמש וו זכוכית כדי להעביר את פרוסת המוח לתוך הראשון גם.

לאסוף שלוש פרוסות סמוכות לגם בצלחת 24 גם מלא PB 0.1 טוחן. מאחסנים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס עד להכתמתן עד שבועיים. כדי להכין את הפרוסות עבור כתמים חיסוניים להשתמש צינור פלסטיק כדי להסיר את פתרון PB מ באר אחת מבלי לצייר את פרוסות המוח. לאחר מכן השתמש צינור 1000 מיקרו ליטר להוסיף 250 microliters של PB טרי לשטוף אותם של עודף OCT.

חזור על כביסה זו עבור כל באר באותו זמן, כדי למנוע ייבוש הפרוסות. לאחר מכן, השתמש צינור פלסטיק כדי להסיר את פתרון PB מהבאר הראשונה. השתמש צינור 1000 microliter להוסיף 250 microliters של חיץ חסימה לכל באר עובד היטב על ידי גם שוב.

דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר על שייקר במשך שלוש שעות. במהלך הדגירה להוסיף 250 microliters של מאגר נוגדנים לגם לצינור תגובה. לאחר מכן השתמש צינור 2 microliter להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן צינורות אותו ישירות לתוך הפתרון בעדינות צינור למעלה ולמטה מספר פעמים לערבב.

ואז מערבולת זה נוגדן מדולל כדי לא בטוח ערבוב תקין. עובדים היטב על ידי הסרת חיץ החסימה עם צינור פלסטיק ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני ל הבאר. דגירה את הצלחת על שייקר בארבע מעלות צלזיוס לילה.

למחרת להסיר את פתרון הנוגדן עם צינור פלסטיק. לשטוף את הפרוסות עם 300 microliters של חיץ כביסה אחד לכל גם שלוש פעמים עשר דקות כל לשטוף על שייקר בטמפרטורת החדר. במהלך הכביסה, עובד בחושך, לדלל את הפלואור עבור נוגדן שני כמה בצינור תגובה באותו אופן כפי שנעשה בעבר עם הנוגדן העיקרי.

לאחר הכביסה הושלמה להסיר את מאגר הכביסה עם צינור פלסטיק ולהוסיף 250 microliters של פתרון נוגדנים משני לכל באר. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לאחר הדגירה הושלמה להסיר את פתרון הנוגדן עם צינור פלסטיק.

לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם מאגר כביסה שתיים באותו אופן כמו עם חיץ כביסה אחד. במהלך כביסה זו לדלל כתם DAPI ב 0.1 PB טוחן כדי להשיג ריכוז אחד עד 2000. לאחר הסרת מאגר הכביסה מהצלחת מוסיפים 250 מיקרוליטרים של פתרון DAPI ו דגירה בטמפרטורת החדר על השייקר במשך 5 דקות.

לאחר הסרת פתרון DAPI עם צינור פלסטיק להשתמש צינור 1000 microliter להוסיף 500 microliters של 0.1 PB טוחן לבא. מקם שקופית מיקרוסקופ מתחת לסטריאוסקופ. השתמש במברשת עדין כדי להוסיף שלוש טיפות נפרדות של 0.1 PB טוחן על השקופית.

בעזרת המברשת מניחים פרוסה אחת בכל טיפה בשקופית ולאחר מכן משטחים ומכווןים את הפרוסות. לאחר שכל הפרוסות ממוקמות כראוי להשתמש ברקמת נייר כדי להסיר PB עודף להתייבש בזהירות מבלי לייבש את הפרוסות לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטרים של מדיום הטבעה על השקופית וכסו אותה בזהירות עם פתק כיסוי כדי להטמיע את פרוסות המוח.

מכסים את השקופיות כדי למנוע חשיפה לאור ולהשאיר אותם להתייבש מכסה המנוע אדים במשך שעה עד שעתיים ולאחר מכן לאחסן אותם בתיבת שקופית מיקרוסקופ בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר רכישת רקמות וירטואליות של פרוסת המוח כולה עבור ערוצים שונים כמתואר בכתב היד לטעון את כל הערוצים בודדים או תמונה אחת לתוך FIJI על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן לפתוח. לאחר מכן השתמש בכלי בחירת היד החופשית כדי לתוות חצי כדור אחד בערוץ DAPI.

לחץ על עריכה ולאחר מכן על בחירה ולאחר מכן צור מסיכה ליצירת מסיכה של האזור הנבחר. לאחר מכן לחץ על לנתח ולאחר מכן למדוד חלקיקים כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור ערוצים בודדים. הקפד לבחור ערוצים בודדים כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעים עבור כל ערוץ.

לאחר מכן, העתק את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הערוצים הבודדים לגיליון אלקטרוני. כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הערוצים הבודדים באזור מעניין, קבעו את האזור בעזרת הכלי לבחירת יד חופשית. לאחר הכתמה עם DAPI אשר כתמים גרעיני המוח חלקים יש דפוס punctate ואזורים עם צפיפות תאים גבוהה בהירים יותר מאשר אזורים עם צפיפות תאים נמוכה.

כתמים בנוגדן Mover חשפו הפצה הטרוגנית עם אזורי נקודה חמה בהירים ואזורים מעומעמים ברחבי המוח, שם כמו Synaptophysin חשף הפצה הומוגנית יותר. שכבת-על של תמונות הראתה את ההתפלגות המפרזת של פלואורסצנטיות אדומה המצביעה על חלבון Mover בהשוואה פלואורסצנטיות ירוקה המציינת סינפטופיצין. לאחר ניתוח כימות אומר ערכי עוצמת פלואורסצנטיות עבור ערוצים שונים על פני ההמיספרות על פני תחומי העניין נקבעו הן Mover ו Synaptophysin.

היחסים של ערכי פלואורסצנטיות ההובר לערכי פלואורסצנטיות סינפטופיצין מראים את ההתפלגות ההטרוגנית של Mover עם אזורים של רמות מוובר גבוהות ונמוכות יחסית לווסקים סינפטיים. השפע היחסי של ה-Mover היחס באזור עניין אחד בהשוואה לזה שמעבר להמיספרה ותורגם לאחוז הראה כמה Mover קיים בתחום עניין אחד ביחס לממוצע. שפע יחסי של הובר נקבע עבור שכבות שונות בשדות המשנה של ההיפוקמפוס.

שלושת אזורי העניין מכומתים על ידי השוואת היחס בשכבות המתאימות ליחס של חצי הכדור המתאים. הליך זה יכול בקלות להיות מותאם בשילוב עם טכניקות הדמיה שונות כגון מיקרוסקופ רזולוציה סופר כדי לקבוע בנוסף את התפלגות תת הסלולר של החלבון של עניין. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות מודל שונות כגון מהונדסים גנטית או בעלי חיים שטופלו בסמים.

זה יכול לאפשר גישה השוואתית על פני תנאי ניסוי שונים או אפילו מינים.