כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

קחו פרוסת מוח של עכבר קבועה כימית המוטמעת בתווך להטמעת רקמות.

שוטפים את הפרוסה עם חיץ כדי להסיר את המדיום.

הוסף תמיסה המחלחלת לממברנות וחוסמת אתרי קשירה לא ספציפיים.

הסר את הפתרון.

כדי לדמיין חלבונים סינפטיים עצביים, דגרו על הפרוסה עם נוגדנים ראשוניים.

נוגדנים אלה מכוונים לחלבון פרה-סינפטי המתבטא בסינפסות של אזורים ספציפיים במוח ולחלבון סינפטי המתבטא בכל מקום כסמן ייחוס.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הציגו נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.

צבעו את הגרעינים בצבע קושר DNA.

שוטפים עם מאגר ומרכיבים את הפרוסה באמצעות מדיום הרכבה מתאים.

דמיין את הפרוסה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

חשב את יחסי עוצמת הקרינה הממוצעים של חלבון המטרה וסמן הייחוס כדי לנתח את התפלגות חלבון המטרה על פני אזורי מוח שונים.

כדי להכין את הפרוסות לצביעה חיסונית, השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להסיר את תמיסת ה-PB מבאר אחת מבלי לשאוב פנימה את פרוסות המוח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף 250 מיקרוליטר PB טרי כדי לשטוף אותם מעודפי OCT. חזור על כביסה זו עבור כל באר בכל פעם כדי למנוע ייבוש הפרוסות.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להסיר את תמיסת ה- PB מהבאר הראשונה. השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ חוסם לכל באר, ועובד היטב שוב. דוגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר על שייקר למשך שלוש שעות. במהלך הדגירה ב-250 מיקרוליטר של מאגר נוגדנים לבאר לצינור תגובה.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 2 מיקרוליטר כדי להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן, פיפטה אותו ישירות לתמיסה, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, מערבל את הנוגדן המדולל הזה כדי להבטיח ערבוב נכון.

עובד היטב, הסר את המאגר החוסם עם פיפטה מפלסטיק והוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. דגרו את הצלחת על שייקר בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים בעזרת פיפטה מפלסטיק. שוטפים את הפרוסות עם 300 מיקרוליטר מאגר כביסה 1 לבאר, שלוש פעמים 10 דקות כל שטיפה על שייקר בטמפרטורת החדר. במהלך הכביסה, בעבודה בחושך, יש לדלל את הנוגדן המשני המחובר לפלואורופור בצינור תגובה באותו אופן שנעשה בעבר עם הנוגדן הראשוני.

לאחר סיום הכביסה, הסר את מאגר הכביסה בעזרת פיפטה מפלסטיק והוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לבאר. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. לאחר השלמת הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים בעזרת פיפטה מפלסטיק. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם מאגר כביסה 2 באותו אופן כמו עם מאגר כביסה 1.

במהלך שטיפה זו, יש לדלל כתם DAPI ב-0.1 PB מולארי כדי להשיג ריכוז של 1 עד 2000. לאחר הוצאת מאגר הכביסה מהצלחת, הוסיפו 250 מיקרוליטר תמיסת DAPI ודגרו בטמפרטורת החדר על השייקר למשך 5 דקות.

לאחר הסרת תמיסת ה- DAPI עם פיפטה מפלסטיק, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף 500 מיקרוליטר של 0.1 PB מולארי לבאר. הנח שקופית מיקרוסקופ מתחת לסטריאוסקופ. השתמש במברשת עדינה כדי להוסיף שלוש טיפות נפרדות של 0.1 PB מולארי על המגלשה. בעזרת המברשת, הניחו פרוסה אחת לכל טיפה על השקף, ולאחר מכן, שטחו וכוונו את הפרוסות.

לאחר שכל הפרוסות ממוקמות כהלכה, השתמש בממחטת נייר כדי להסיר עודפי PB ולייבש בזהירות מבלי לייבש את הפרוסות לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של מדיום הטבעה על השקף, וכסה אותו בזהירות עם כיסוי כדי להטמיע את פרוסות המוח.

כסו את השקופיות כדי למנוע חשיפה לאור והשאירו אותן לייבוש במכסה האדים למשך שעה עד שעתיים, ולאחר מכן אחסן אותן בקופסת שקופיות מיקרוסקופ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות למיקרוסקופיה קונפוקלית.

לאחר רכישת רקמות וירטואליות של כל פרוסת המוח עבור ערוצים שונים כמתואר בכתב היד, טען את כל הערוצים הבודדים עבור תמונה אחת לפיג'י על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן פתח. לאחר מכן, השתמשו בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לתחום חצי כדור אחד בערוץ DAPI. לחץ על עריכה, לאחר מכן על בחירה, ולאחר מכן צור מסיכה ליצירת מסיכה של האזור שנבחר.

לאחר מכן לחץ על נתח ולאחר מכן מדוד חלקיקים כדי לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת עבור ערוצים בודדים, הקפד לבחור ערוצים שונים כדי לקבוע את ערכי עוצמת הקרינה הממוצעת עבור כל ערוץ.

לאחר מכן, העתק את עוצמת הקרינה הממוצעת עבור הערוצים הבודדים לגיליון אלקטרוני. כדי לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת עבור הערוצים הבודדים באזור עניין, תחמו את האזור בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית.