כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

קחו פרוסת מוח של עכבר קבועה כימית המוטמעת בתווך להטמעת רקמות.

שוטפים את הפרוסה עם חיץ כדי להסיר את המדיום.

הוסף תמיסה המחלחלת לממברנות וחוסמת אתרי קשירה לא ספציפיים.

הסר את הפתרון.

כדי לדמיין חלבונים סינפטיים עצביים, דגרו על הפרוסה עם נוגדנים ראשוניים.

נוגדנים אלה מכוונים לחלבון פרה-סינפטי המתבטא בסינפסות של אזורים ספציפיים במוח ולחלבון סינפטי המתבטא בכל מקום כסמן ייחוס.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הציגו נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.

צבעו את הגרעינים בצבע קושר DNA.

שוטפים עם מאגר ומרכיבים את הפרוסה באמצעות מדיום הרכבה מתאים.

דמיין את הפרוסה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

חשב את יחסי עוצמת הקרינה הממוצעים של חלבון המטרה וסמן הייחוס כדי לנתח את התפלגות חלבון המטרה על פני אזורי מוח שונים.

כדי להכין את הפרוסות לצביעה חיסונית, השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להסיר את תמיסת ה-PB מבאר אחת מבלי לשאוב פנימה את פרוסות המוח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף 250 מיקרוליטר PB טרי כדי לשטוף אותם מעודפי OCT. חזור על כביסה זו עבור כל באר בכל פעם כדי למנוע ייבוש הפרוסות.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להסיר את תמיסת ה- PB מהבאר הראשונה. השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף 250