רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

באופן מסורתי, מחקרים ביולוגיים וקליניים הדורשים ניתוח מיקרוסקופי ברזולוציה ברמה התאית בוצעו על ידי הפעלת ניסויים מרובים במקביל לדגימות בודדות שהוסרו מהמחקר בזמן עוקב נקודות להערכה על ידי מיקרוסקופ אור בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית, מולטיפוטונית ומיקרוסקופיה הרמונית שנייה הן כולן טכניקות שימושיות להדמיה באתר. התשתית הנדרשת מורכבת ויקרה וכוללת סריקת מערכות לייזר ומקורות אור מורכבים. כאן אנו מדגימים כיצד לבנות מערכת מיקרו-אנדוסקופ סיבים אופטיים ברזולוציה גבוהה ביום אחד, תוך שימוש ברכיבי מדף בפחות מ-5,000 דולר אמריקאי.

הפלטפורמה מציעה גמישות מבחינת רזולוציית תמונה, שדה ראייה ואורך גל הפעלה. ראשית, מסגרת מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי פשוטה מורכבת כדי להכיל מקור אור, מסננים אופטיים, עדשות, צרור סיבים אופטיים ומצלמת CCD. לאחר מכן, מותקנות עדשות ההדמיה, היוצרות תמונה מוגדלת של צרור הסיבים האופטיים במצלמת ה-CCD.

לאחר מכן מותקן מקור LED עם אופטיקה של תאורה על מנת לספק אור עירור פלורסנט לדגימה. לבסוף, עם המיקרו-אנדוסקופ המורכב, הדמיה בזמן אמת חושפת פרטים ברמת התא של דגימות המסומנות פלואורסצנטיות, כולל תרביות מבחנה, מודלים של בעלי חיים in vivo ונבדקים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטון, הוא שהיא פשוטה וזולה מספיק כדי שחוקרים העובדים במגוון רחב של תחומים יוכלו ליישם אותה במהירות ולהתאים אותה לצרכים הספציפיים שלהם.

יש להתייחס למיקרו אנדוסקופ ברזולוציה גבוהה המתואר כאן כתצורת בסיס עם מספר וריאציות אפשריות בהרכבה וביישום. בבחירת רכיבים ליישום ספציפי, שקול את הקשרים האינהרנטיים הכרוכים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בין ריכוז פלואורול, תאורת פוטו-הלבנה, עוצמה, רגישות מצלמה, רווח וזמן חשיפה. פלטפורמה זו מיועדת לשימוש עם פרו פלבין כחומר ניגוד פלואורסצנטי, אך ניתן להגדיר אותה לעבודה עם צבעים פלואורסצנטיים אחרים.

פרו פלבין הוא כתם גרעין בהיר עם אורכי גל ספיגה ופליטה שיא של 445 ננומטר ו-515 ננומטר בהתאמה. השימוש בחומרי ניגוד אחרים ידרוש מהמשתמש לבחור פליטת עירור, ומסננים דיכרואיים כראוי להרכבת מערכת המיקרו אנדוסקופ מתחילים בחיבור שני מוטות כלוב בגודל 6 אינץ' לשני מוטות כלוב בגודל 1.5 אינץ' ליצירת זוג מוטות באורך 7.5 אינץ'. הברג את המוטות לפנים אחד של יחידת המראה המתקפלת, ולאחר מכן התקן מראה בקוטר סנטימטר אחד.

לאחר מכן, הברג ארבעה מוטות בגודל 0.5 אינץ' לפנים הנגדיות של יחידת המראה המתקפלת. החלק את קוביית הכלוב על מוטות הכלוב בגודל 7.5 אינץ' דרך שני החורים התחתונים. הברג את המוטות בגודל שני אינץ' לתוך הפנים הצדדיות של קוביית הכלוב.

באמצעות תושבת C למתאם SM אחד, חבר את המצלמה לצלחת כלוב. אבטח את לוחית הכלוב על מוטות הכלוב בגודל 0.5 אינץ' בסמוך לפנים יחידת המראה המתקפלת. בחר עדשת צינור בקוטר אינץ' אחד כדי ליצור תמונה של צרור הסיבים האופטיים במצלמה.

יש לבחור את אורך המוקד של העדשה כך שהגורם לחבילת הסיבים האופטיים יידגמו בשני פיקסלים לפחות. כאשר מצולמים על המצלמה, הכנס את העדשה לצינור עדשה באורך שלושה אינץ' ואבטח את העדשה עם טבעת שמירה. מפתח ברגים מועיל להברגה, שמירה על טבעות לתוך צינורות עדשה ארוכים.

זרוק את מסנן הפליטה לתוך צינור העדשה בגודל שלושה אינץ' על גבי טבעת השמירה הראשונה והוסף טבעת נוספת כדי לאבטח את המסנן במקומו. ודא שכיוון המסנן עומד במוסכמה שצוינה על ידי יצרן המסנן. הברג את צינור העדשה לצד קוביית הכלוב הקרובה ביותר למצלמת ה-CCD.

עמדה זו מוצגת גם כאן. שים לב שבתרשים, עדשה ומסנן אלה מוצגים ללא צינור עדשה בגודל שלושה אינץ'. לשם הבהרה, חבר את המצלמה למחשב וצפה בתמונה על המסך.

כוונו את מכלול הכלוב לאובייקט מרוחק והחליקו את קוביית הכלוב לאורך המסילות עד שתמונה של האובייקט תופיע במיקוד. השתמש במברג כדי להדק את ארבעת הברגים הממוקמים בצידי קוביית הכלוב. ברגים אלה אוחזים במסילות כאשר הם מהודקים ומחזיקים את הקובייה במקומה.

זה יבטיח שעדשות הצינור ייצרו תמונה ממוקדת של צרור הסיבים במצלמה בשילוב עם עדשת האובייקט המתוקנת באינסוף. לאחר מכן, הכנס את המראה הדיאית לתוך המחזיק והנח אותה ב-45 מעלות בקוביית הכלוב. הברג את עדשת האובייקט באמצעות מתאם חוט אחד RMS ל-SM וצינור עדשה מתכוונן לתוך הפנים של קוביית הכלוב מול מחזיק עדשת הצינור.

לאחר מכן, הברג מחבר SMA לתוך צלחת כלוב והתקן אותו על המוטות בערך במרחק העבודה של עדשת האובייקטיב. הוסף את לוחית הבסיס ואת מכסה הקצה לצדדים הפתוחים של קוביית הכלוב. לאחר מכן הרכיב נורית LED על צלחת כלוב והחלק אותה על קצה המוטות בגודל שני אינץ'.

הוסף עדשה לצינור עדשה בגודל 0.5 אינץ' כך שכאשר צינור זה מוברג בצד קוביית הכלוב, הוא ייצור תמונה של הנורית שממלאת את הצמצם האחורי של עדשת האובייקט. כמו כן, הוסף את מסנן העירור לצינור העדשה. בשלב זה ניתן להשתמש בדרייבר LED כדי לשלוט בעוצמת האור המאיר באמצעות אפוקסי.

חבר מחבר SMA עבור סיב 1030 מיקרון לחבילת הסיבים האופטיים של שדה הראייה של 720 מיקרון. לפרטים על מחבר סיבים אופטיים, עיין במעבדות T Thor, מספר חלק FN תשע שש. מדריך לחיבור וליטוש סיבים אופטיים.

הברג את צרור העיניים של מחבר ה-SMA לתוך שקע ה-SMA המותקן על הכלוב מוטות מכוונים את הקצה הדיסטלי של הצרור לעבר מקור אור רחב תאורת פלורסנט תספיק. לאחר מכן התבונן בתמונה של הפנים הפרוקסימליות של הצרור במצלמת ה-CCD. לבסוף, כוונן את מיקום עדשת האובייקט על ידי הברגה פנימה או החוצה מקוביית הכלוב.

עד שתמונת צרור הסיבים תופיע בפוקוס, הסיבה האישית צריכה להיות גלויה בבירור. ניתן להגדיל את הרזולוציה המרחבית של המיקרו אנדוסקופ על ידי הצמדת עדשת מיקרו או מכלול עדשות לקצה הדיסטלי של צרור הסיבים. אופטיקה זו מוגדרת כך שבמקום להניח את קצה הצרור ישירות על הרקמה, הקצה מצולם על פני הרקמה בהגדלה דם.

ובכך מגדיל את תדירות הדגימה המרחבית המוטלת על ידי הגורם המנחה את האור של צרור הסיבים. מידת ההגדלה תואמת את העלייה ברזולוציה המרחבית ובמקביל, לירידה פרופורציונלית בשדה הראייה. בחר עדשת חיוך עם הגדלה ומרחק עבודה רצויים עבור היישום שלך.

ודא שקוטר העדשה תואם לזה של צרור הסיבים. אתה מתכנן לעבוד עם. התקן את צרור הסיבים ועדשת החיוך על שלבי מיקום ידניים נפרדים של שלושה צירים תחת מיקרוסקופ או סטריאוסקופ בעל הספק נמוך ליישור מדויק.

לאחר מכן, הנח טיפה של דבק אופטי על העדשה או על פני הצרור. באמצעות המצבים הידניים, הבא את שני הרכיבים למגע. חשוף את הממשק לאור UV למינון המומלץ על ידי היצרן לריפוי הדבק.

כדי להגן על עדשת החיוך ועל הממשק המודבק, השתמש באורך קצר של צינורות נימי אלומיניום כדי לסגור את המפרק. החלק את הצינור מעל המפרק ואבטח אותו במקומו עם טיפת אפוקסי בכל קצה הצינור, השתמש בצינורות לכווץ חום כדי לסיים את ההרכבה. לפני הדמיה מיקרו אנדוסקופית, יש למרוח את חומר הניגוד על התאים או הרקמה להדמיה לתאי הדמיה ולתרבית.

ראשית, הסר מצעי גידול על ידי פפה. לאחר מכן הוסיפו תמיסת פרו פלבין על ידי פיפטינג בעדינות לבאר. לאחר דגירה קצרה של עד דקה, יש להסיר את תמיסת הפרו-פלבין על ידי פפה ולהשליך.

שטפו את התאים על ידי הוספה והסרה של תמיסת PBS טרייה לבאר הרכיבו את הקצה הדיסטלי של צרור הסיבים במתקן מאובטח עם מיקום ידניtages על ציר x, Y, Z ליציבות. במהלך ההדמיה לאחר מריחת הצבע על תאים או רקמות, הנח את צרור הסיבים האופטיים במגע קל עם הדגימה. הצג את התמונה של חבילת הסיבים האופטיים על מסך המחשב, באמצעות התוכנה המסופקת על ידי יצרן המצלמה או כל תוכנה מותאמת אישית שתרצה לפתח.

התאם את הגדרות זמן החשיפה והרווח של המצלמה כדי לקבל תמונה בעלת בהירות מקובלת. כאשר הוא מורכב כהלכה, המיקרו אנדוסקופ יפעל כמיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי המועבר דרך צרור סיבים אופטיים קוהרנטי. לקבלת תוצאות הדמיה מיטביות, יש לשים לב להבטיח עמידה בשלושה תנאים מרכזיים.

ראשית, יש לצלם את הפנים הפרוקסימליות של צרור הסיבים על מצלמת ה-CCD ללא דה-פוקוס על מנת להשיג את הרזולוציה המלאה של המערכת. הנה. חלק מחבילת סיבים מצולם עם מיקוד גרוע, מיקוד קל ומיקוד טוב. המיקוד האופטימלי נמצא על ידי התאמת המיקום בפועל של עדשת האובייקט ביחס לפנים הצרור.

שנית, הפנים הפרוקסימליות של צרור הסיבים צריכות להיות מוארות באופן אחיד על כל קוטרו. כפי שתואר קודם לכן, זה מושג על ידי הגדרת אופטיקת התאורה לתאורת קולה. התמונה המוצגת כאן נרכשה כאשר דגימת פלורסנט אחידה מוארת בתצורה מועדפת זו.

התוצאה המקבילה תחת הארה ביקורתית מוצגת כאן. מבנה ה-LED מצולם על פני צרור הסיבים וכתוצאה מכך הופעת דפוס לא רצוי זה המונח על מבנה המדגם האמיתי. שלישית, חשוב לוודא שגם הפנים הפרוקסימליות וגם הדיסטליות של צרור הסיבים צריכות להיות נקיות וללא שריטות ושבבים.

בדוגמה זו, פסולת תמונה מחוברת לפנים הצרור ונזק בצורת שבב קטן בשעה חמש נראה על היקף הסיבים. ניתן להסיר פסולת מפנים הצרור על ידי ניקוי באותו אופן כמו מחברי סיבים אופטיים קונבנציונליים עם נייר עדשות ואיזופרופנול או כלי ניקוי סיבים אופטיים סטנדרטיים. 1483 תאים סומנו בפרו פלבין וצרור הסיבים החשופים הונח קלות על הדגימה.

הדמיה חוץ גופית מוצגת כאן כאשר עדשת חיוך של 2.5 x נקשרה לקצה הצרור, הושג שיפור ברזולוציה המרחבית והפחתת שדה הראייה. הדמיה in vivo שבה צרור סיבים בקוטר חיצוני של 0.5 מילימטר הועבר דרך מחט בגודל 21 והתקדם לרקמת כרית שומן של עכבר בוצעה כפי שניתן לראות בסרט זה, אדיפוציטים נראים בבירור בתנועה עקב מחזור הלב. בדוגמה זו, הדמיה של רירית הפה במתנדב אנושי בריא בוצעה באמצעות צרור סיבים גדול יותר בקוטר חיצוני של 1.5 מילימטר.

בכל הדוגמאות, המוצגת פרו-פלבין שימשה כחומר ניגוד פלואורסצנטי לתיוג גרעיני. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן ולהרכיב מיקרו אנדוסקופ סיבים אופטיים להדמיה פלואורסצנטית של תאים ורקמות ב-C.