רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

באופן מסורתי, מחקרים ביולוגיים וקליניים הדורשים ניתוח מיקרוסקופי ברזולוציה רמת תא בוצעו על ידי הרצת מספר ניסויים במקביל, כאשר דגימות בודדות הוצאו מהמחקר בנקודות זמן עוקבות לצורך הערכה באמצעות מיקרוסקופיה של אור; בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית, מולטיפוטונית ומיקרוסקופיית הרמוני שני הן כולן טכניקות שימושיות לדימות in situ. התשתית הנדרשת היא מורכבת ויקרה, וכוללת מערכות סריקה בלייזר ומקורות אור מורכבים. כאן אנו מדגימים כיצד לבנות מערכת מיקרו-אנדוסקופ סיב אופטי ברזולוציה גבוהה ביום אחד, באמצעות רכיבים זמינים מהמדף בעלות של פחות מ-5,000 דולר ארה"ב.

הפלטפורמה מציעה גמישות במונחים של רזולוציית תמונה, שדה ראייה ואורך גל עבודה. ראשית, מורכב שלד פשוט של מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) כדי להכיל מקור אור, מסננים אופטיים, עדשות, צרור סיבים אופטיים ומצלמת CCD. לאחר מכן, מותקנות עדשות ההדמיה, היוצרות תמונה מוגדלת של צרור הסיבים האופטיים על מצלמת ה-CCD.

לאחר מכן מותקן מקור LED עם אופטיקת תאורה כדי לספק אור עירור פלואורסצנטי לדגימה. לבסוף, באמצעות המיקרו-אנדוסקופ המורכב, דימות בזמן אמת חושף פרטים ברמה התאית של דגימות מסומנות פלואורסצנטית, כולל תרביות in vitro, מודלים של בעלי חיים in vivo ונבדקים אנושיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, הוא שהיא פשוטה וזולה מספיק כדי שחוקרים הפועלים במגוון רחב של תחומים יוכלו להטמיע אותה במהירות ולהתאימה לצרכיהם הספציפיים.

המיקרו-אנדוסקופ ברזולוציה גבוהה המתואר כאן צריך להיחשב כתצורת בסיס עם מספר וריאציות אפשריות בהרכבה וביישום. בבחירת רכיבים ליישום ספציפי, יש להתחשב בקשרים האינהרנטיים במיקרוסקופיית פלואורסצנציה בין ריכוז הפלואורופור, תאורת הפוטובליצ'ינג, העוצמה, רגישות המצלמה, ההגבר (gain) וזמן החשיפה. פלטפורמה זו תוכננה לשימוש עם pro flavin כחומר ניגודיות פלואורסצנטי, אך ניתן להגדירה לעבודה עם צבעים פלואורסצנטיים אחרים.

Pro flavin הוא צבע גרעין בהיר עם אורכי גל של ספיגה ופליטה בשיא של 445 ננומטר ו-515 ננומטר בהתאמה. שימוש בחומרי ניגוד אחרים יחייב את המשתמש לבחור מסנני עירור, פליטה ומסננים דיכרואיים בצורה מתאימה כדי להרכיב את מערכת המיקרו-אנדוסקופ. התחילו בחיבור של שני מוטות כלוב באורך שש אינץ' לשני מוטות כלוב באורך 1.5 אינץ' כדי ליצור זוג מוטות באורך 7.5 אינץ'. הבריגו את המוטות לפאה אחת של יחידת מראת הקיפול, ולאחר מכן התקינו מראה בקוטר של אינץ' אחד.

בשלב הבא, הברגו ארבעה מוטות באורך 0.5 inch לפניו המנוגדת של יחידת מראת הקיפול. החליקו את קוביית הכלוב על מוטות הכלוב באורך 7.5 inch דרך שני חורי המעבר התחתונים. הברגו את המוטות באורך two inch לפני הצד של קוביית הכלוב.

באמצעות מתאם מסוג C mount ל-SM one, חברו את המצלמה ללוח כלוב (cage plate). הדקו את לוח הכלוב על מוטות הכלוב בקוטר 0.5 inch כך שיהיה במקביל לפניו של יחידת המראה המתקפלת. בחרו עדשה צילינדרית (tube lens) בקוטר של one inch כדי ליצור תמונה של צרור הסיבים האופטיים על גבי המצלמה.

יש לבחור את אורך המוקד של העדשה כך שחתך של צרור הסיבים האופטיים יידגם על ידי לפחות שני פיקסלים. בעת ההדמיה למצלמה, הכניסו את העדשה לתוך שפופרת עדשות באורך של שלושה אינצ'ים והדקו את העדשה באמצעות טבעת נעילה. מפתח ברגים (spanner wrench) מסייע בהברגת טבעות נעילה לתוך שפופרות עדשות ארוכות.

הניחו את מסנן הפליטה לתוך שרוול העדשות בגודל שלושה אינץ' על גבי טבעת הקיבוע הראשונה, והוסיפו טבעת נוספת כדי להבטיח את קיבוע המסנן במקומו. ודאו כי כיוון המסנן תואם להנחיות של יצרן המסנן. הבריגו את שרוול העדשות לצד של קוביית הכלוב הקרובה ביותר למצלמת ה-CCD.

מיקום זה מוצג כאן גם כן. שימו לב שבדיאגרמה, עדשה ומסנן אלו מוצגים ללא צינור עדשות של שלושה אינצ'ים. למען הבהירות, חברו את המצלמה למחשב וצפו בתמונה על המסך.

כוון את מכלול הכלוב לעבר אובייקט מרוחק והזז את קוביית הכלוב לאורך המסילות עד שתמונת האובייקט תופיע במיקוד. השתמש במברג כדי להדק את ארבעת הברגים הממוקמים בצדי קוביית הכלוב. ברגים אלו אוחזים במסילות כאשר הם מהודקים ומקבעים את הקובייה במיקומה.

פעולה זו תבטיח שעדשת השפופרת תיצור תמונה ממוקדת של צרור הסיבים על המצלמה בשילוב עם עדשת העדשה המתוקנת לאינסוף. לאחר מכן, הכנס את מראת הדיכרואיקה למחזיק והצב אותה בזווית של 45 מעלות בתוך קוביית הכלוב. הברג את עדשת העדשה באמצעות מתאם הברגה מ-RMS ל-SM1 ושפופרת עדשה מתכווננת אל פני קוביית הכלוב המנוגדת למחזיק עדשת השפופרת.

לאחר מכן, הברגו מחבר SMA לתוך לוחית כלוב והתקינו אותה על המוטות במרחק העבודה של עדשת העדשה. הוסיפו את לוחית הבסיס ואת מכסה הקצה לצדדים הפתוחים של קוביית הכלוב. לאחר מכן, התקינו נורת LED על לוחית כלוב והגלישו אותה לקצה המוטות בעלי השני אינץ'.

הוסיפו עדשה לשפוף עדשות בקוטר 0.5 אינץ', כך שבעת הברגת השפוף לדופן קוביית הכלוב, תיווצר תמונה של ה-LED שתמלא את המפתח האחורי של עדשת העצם. כמו כן, הוסיפו את מסנן העירור לשפוף העדשות. בשלב זה, ניתן להשתמש בדרייבר LED כדי לשלוט בעוצמת אור ההארה באמצעות אפוקסי.

חבר מחבר SMA עבור סיב של 1030 מיקרון לאסמבלה של סיבי אופטיקה עם שדה ראייה של 720 מיקרון. לפרטים על חיבור סיבים אופטיים, עיין ב-T Thor labs, מספר קטלוג FN nine six. מדריך לחיבור וליטוש של סיבים אופטיים.

הברגו את צרור סיבי ה-SMA אל תוך מחבר ה-SMA המותקן על מוטות הכלוב. כוון את הקצה הדיסטלי של הצרור לעבר מקור אור רחב-סרט; תאור פלואורסצנטי יספיק. לאחר מכן, צפו בתמונה של הפנים הפרוקסימלי של הצרור במצלמת ה-CCD. לבסוף, כווננו את מיקום העדשה האובייקטיבית על ידי הברגה פנימה או החוצה מקוביית הכלוב.

עד שהתמונה של צרור הסיבים תופיע במיקוד, הגורם הבודד צריך להיות גלוי בבירור. ניתן להעלות את הרזולוציה המרחבית של המיקרו-אנדוסקופ על ידי הצמדת עדשה מיקרוסקופית או מערך עדשות לקצה הדיסטלי של צרור הסיבים. אופטיקות אלו מוגדרות כך שבמקום להניח את קצה הצרור ישירות על הרקמה, הקצה מדמים את פני השטח של הרקמה עם הגדלה.

בכך גדלה תדירות הדגימה המרחבית המוגבלת על ידי הובלת האור של צרור הסיבים. מידת ההגדלה של עדשת ה-grin תואמת לעלייה ברזולוציה המרחבית ובמקביל לירידה פרופורציונלית בשדה הראייה. בחרו עדשת grin עם ההגדלה ומרחק העבודה הרצויים עבור היישום שלכם.

וודאו שקוטר העדשה תואם לקוטר צרור הסיבים שבו אתם מתכננים לעבוד. התקינו את צרור הסיבים ואת עדשת ה-GRIN על במות מיקום ידניות נפרדות בעלות שלושה צירים תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה או סטראאוסקופ לצורך יישור מדויק.

כעת הניחו טיפה של דבק אופטי על גבי העדשה או על פני הצרור. בעזרת המתקנים למיקום ידני, הביאו את שני הרכיבים למגע. חשפו את הממשק לאור UV במינון המומלץ על ידי היצרן כדי להקשות את הדבק.

כדי להגן על עדשת ה-grin ועל הממשק המודבק, השתמשו בחלק קצר של צינור נימי מאלומיניום כדי להקיף את החיבור. החליקו את הצינור מעל החיבור ואבטחו אותו במקומו באמצעות טיפת אפוקסי בכל קצה של הצינור; השתמשו בצינור בידוד מתכווץ בחום כדי להשלים את ההרכבה. לפני ביצוע הדמיה מיקרו-אנדוסקופית, מרחו את חומר הניגוד על התאים או הרקמה המיועדים להדמיה כדי להדמות תאים ותרביות.

ראשית, הסירו את מצע הגידול באמצעות שאיבה. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת pro flavin על ידי הפיפטה בעדינות אל תוך הבאר. לאחר דגירה קצרה של עד דקה אחת, הסירו את תמיסת ה-pro flavin באמצעות שאיבה והשליכו אותה.

שטפו את התאים על ידי הוספה והסרה של תמיסת PBS רעננה לבאר; קיבעו את הקצה הדיסטלי של צרור הסיבים במתקן מאובטח עם שלבי מיקום ידניים בצירים x, Y ו-Z ליציבות. במהלך ההדמיה, לאחר יישום הצבע לתאים או לרקמה, הניחו את צרור הסיבים האופטי במגע קל עם הדגימה. צפו בתמונה של צרור הסיבים האופטי על מסך המחשב, תוך שימוש בתוכנה שסופקה על ידי יצרן המצלמה או בכל תוכנה מותאמת אישית שתרצו לפתח.

כוון את זמן החשיפה ואת הגדרות ההגבר (gain) של המצלמה כדי לקבל תמונה בעוצמת בהירות מקובלת. כאשר המיקרו-אנדוסקופ מורכב כהלכה, הוא יפעל כמיקרוסקופ פלואורסצנציית-אפי (epi fluorescence) המועבר דרך צרור סיבים אופטיים קוהרנטיים. לקבלת תוצאות דימוי אופטימליות, יש להקפיד על הגשמת שלושה תנאים מרכזיים.

ראשית, יש להדמה את הפנים הפרוקסימלי של צרור הסיבים על מצלמת ה-CCD ללא טשטוש מיקוד (defocus), וזאת כדי להשיג את הרזולוציה המלאה של המערכת. כאן, חלק מצרור סיבים מדוגם במיקוד גרוע, במיקוד חלקי ובמיקוד טוב. המיקוד האופטימלי נמצא על ידי כיוון המיקום הממשי של עדשת העדשה ביחס לפני הצרור.

שנית, יש להאיר באופן אחיד את הפנים הפרוקסימלי של צרור הסיבים לאורך כל קוטרו. כפי שתואר קודם לכן, הדבר מושג על ידי הגדרת אופטיקת התאורה לתאורת cola. התמונה המוצגת כאן נרכשה כאשר דגימה פלורסצנטית אחידה מוארת בתצורה מועדפת זו.

התוצאה המתאימה תחת תאורה קריטית מוצגת כאן. מבנה ה-LED מודגש על פני צרור הסיבים, מה שגורם להופעתו של תבנית לא רצויה זו המוטבעת על מבנה הדגימה האמיתי. שלישית, חשוב לוודא ששני הפנים, הפרוקסימלי והדיסטלי, של צרור הסיבים נקיים ונקיים משריטות ושברים.

בדוגמה זו, פסדיי פסדיי תמונה דבקים לפני השטח של הצרור, ונזק בצורת שבב קטן בשעה חמש נראה על היקף הסיב. ניתן להסיר פסדיי מפני השטח של הצרור על ידי ניקוי באופן דומה למחברים סיב אופטיים קונבנציונליים באמצעות נייר לעדשות ואיזופרופנול או כלי ניקוי סטנדרטיים לסיבים אופטיים. 1483 תאים סומנו ב-pro flavin וצרור הסיבים החשוף הונח בעדינות על הדגימה.

כאן מוצג דימוי in vitro שבו הודבק עדשת grin של 2.5 לקצה הצרור, ובכך הושג שיפור ברזולוציה המרחבית והפחתה בשדה הראייה. דימוי in vivo, שבו צרור סיבים בעוביין חיצוני של 0.5 millimeter הועבר דרך מחט gauge 21 והוחדר לרקמת גדיש שומן של בלוטת העשש בעכבר, בוצע כפי שניתן לראות בסרטון זה; אדיפוקיטים נראים בבירור עם תנועה הנובעת מהמחזור הלבבי. בדוגמה זו, בוצע דימוי של הרירית הפה במתנדב אנושי בריא באמצעות צרור סיבים גדול יותר בעוביין חיצוני של 1.5 millimeter.

בכל הדוגמאות, נעשה שימוש ב-pro flavin כחומר ניגודיות פלואורסצנטי לסיומן גרעינית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן התכנון וההרכבה של מיקרו-אנדוסקופ סיב אופטי עבור דימוי פלואורסצנטי של תאים ורקמות ב-in C two.