פסיפס ניתוח פונקציה ג'ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתמרן את תפקוד הגנים במהלך התקופה שלאחר הלידה של התפתחות המוח. זה מושג על ידי בחירה והכנת הנגיפים המתאימים, העמסתם למזרק והכנת ציוד ההזרקה. לאחר מכן מוזרק וירוס למוחם של גורי עכברים שזה עתה נולדו, והשלב האחרון הוא להקריב את החיות ולדמות את האזורים המוזרקים.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תיוג דיפרנציאלי של תאי בקרה ונוקאאוט באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד תקופת ההתפתחות שלאחר הלידה מווסתת גנטית. להזרקה, ניתן להשתמש בתמיסת וירוס הזמינה מסחרית הקשורה לאדנו, בטיטר מלא, בדרך כלל 10 עד 12, עותקי גנום למיליליטר כדי לתפעל מספר רב של תאים.

אם רוצים דליל או תיוג, התחל בדילול של 1 עד 10. לאחר הפשרת הנגיף על קרח, העבירו מיד את נפח הדילול המקדים לצינור PCR סטרילי של 250 מיקרוליטר. שמור את הדילול על קרח. כעת.

הכן את משאבת ההזרקה על ידי בחירת מזרק מתאים וחיבורו למחט טעינה. לאחר מכן, שרטטו בעדינות את תמיסת הנגיף עד שתראה בועת אוויר קטנה מאוד במזרק וניתן להשתמש בצבע טעינה אינרטית כדי להקל על שלב זה. כעת אבטח את המזרק למשאבה בעזרת מחזיק.

לאחר מכן חבר בעדינות צינורות חיבור בין המזרק למחזיק המחט. ודא שמחט ההזרקה נמצאת במגע ישיר עם צינור החיבור שבתוך מחזיק המחט. כעת, העבירו לאט את התמיסה דרך צינור החיבור עד שטיפה זעירה של תמיסה נראית בקצה המחט.

אבטח בזהירות את הבוכנה ליד בלוק הדוחף עם סוגר על המשאבה. הגדר את קצב ההזרקה לשמונה מיקרוליטר לדקה והגדר את נפח ההזרקה בין מיקרוליטר אחד לשני מיקרוליטר. לאחר מכן התאם את הגדרת קוטר המזרק של המשאבה כך שתתאים לקוטר המזרק שבו אתה משתמש.

לבסוף, כדי להגן על הגורים בשלב ההתאוששות, כוונו את הפלטה החמה ל-38 מעלות צלזיוס וכסו אותה במגבת נייר. באמצעות פרוטוקול מאושר על ידי IACUC, הכינו גורי עכבר P אפס או P אחד להזרקה על ידי הרדמה קרה. מרטיבים כמה מגבות נייר במים ומניחים אותן על קרח.

לאחר מכן הניחו ארבעה או חמישה גורים על מגבת הנייר מופרדים היטב. קפלו את מגבות הנייר מעל הגורים, הניחו בעדינות כמות קטנה של קרח כתוש על גבי מגבות הנייר ודגרו על הגורים למשך כחמש דקות. ניתן להחזיק את הגורים בבטחה על קרח עד 15 דקות ועדיין להתאושש היטב.

כעת מקם גור מורדם על בלוק הרכבה לגישה הטובה ביותר לאתר ההזרקה. קליפת המוח, למשל, נגישה בצורה הקלה ביותר על ידי הנחת החיה שטוחה על בטנה. ניתן לאבטח את הגור במקומו באמצעות פלסטר, לייצב ידנית את ראש הגור ולמשוך את העור בחוזקה כדי למנוע ממנו לזוז.

לאחר מכן נווט בציוני דרך אנטומיים של הגולגולת כמו תפר הלמבדה, ובחר נקודת הזרקה הניתנת לשחזור ביד השנייה, הכנס בעדינות את המחט דרך הגולגולת. אל תלחץ חזק אם המחט לא חודרת בקלות לגולגולת. במקום זאת, מקם מחדש את המחט ונסה שוב בעדינות.

עומק ההזרקה משתנה מעט בין בעלי חיים בודדים וזנים לקליפת המוח, עומק של חצי עד מילימטר בדרך כלל עובד. כעת, הזריקו את תמיסת הנגיף על ידי כך שעמית לעבודה יפעיל את המשאבה כדי למזער את תנועות הידיים. באופן אידיאלי, ניתן להשתמש בדוושת רגל כדי להפעיל את המשאבה לאחר ההזרקה.

שמור את המחט במקומה למשך מספר שניות, ולאחר מכן שמור על ראש הגור דומם בצורה חלקה. החלק את המחט החוצה. כעת, אפשרו לגור להתאושש במשך חמש עד 10 דקות על הפלטה החמה המכוסה.

במהלך תקופה זו, המשיכו להזריק גורים אחרים. כאשר כל הגורים חזרו לצבעם הוורוד וכולם זזים, שפשפו אותם בעדינות עם חלק מהמצעים הביתיים שלהם. רק אז ניתן להחזיר אותם לאמם.

אחרת, ניתן להתייחס אליהם כאל גורים לא מוכרים, שסביר להניח שהאם תהרוג לאחר שהגורים יוחזרו לאמם. נקה את מערך ההזרקה על ידי טעינה מלאה של המזרק באצטון או 70% אתנול. אם משתמשים ברכיבים רגישים לאצטון כגון סנו, אקורט, דבקים, יש לשטוף את התמיסה דרך מערך ההזרקה מספר פעמים באמצעות תמיסה טרייה בכל פעם.

זה יסיר את כל תמיסת הנגיף שנותרה ויזרז את הממיסים להתאדות. לאחר שטיפת ההתקנה, יש לחטא את אזור העבודה של האקונומיקה כדי להשאיר אותה מוכנה לנסיין הבא. מנטור. טכניקה מוצלחת מייצרת זיהום עצבי חזק באתר ההזרקה.

הזרקות לאזורים ספציפיים כמו קליפת המוח וקוליקולוס עליון יוצרות בדרך כלל זיהומים מקומיים עם התפשטות מינימלית לאזורים סמוכים. שימוש בתמיסת וירוס טיטר גבוהה הופך את ההדבקה באזורים סמוכים כמו ההיפוקמפוס, לסבירה יותר להזרקה עם תמיסת וירוס עם טיטר נמוך. כתוצאה מזיהום דליל בדרך כלל ליד אתר ההזרקה כמו הזרקת המוח הקטן בקו האמצע, מספר התאים הנגועים צריך להיות מתואם עם טיטר של התמיסה הנגיפית המוזרקת.

לדוגמה, הזרקת תערובת של תמיסות טיטר גבוהות של שני נגיפי R AAV שמונה המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים שונים לתוך המוח הקטן, מדביקה תאי קינג'י רבים המסומנים באופן דיפרנציאלי. לעומת זאת, הזרקת תמיסת וירוס עם טיטר נמוך עלולה לגרום לזיהום דליל כדי לסייע בהדמיית תאים בודדים. ניתן לצפות בתאי עצב עם תווית פלואורסצנטית ישירות ברקמה חיה חתוכה טרייה, או שהם יכולים להיות נתונים לצביעה חיסונית.

זה משפר את האותות הפלואורסצנטיים האנדוגניים לרכישת תמונה מאוחרת יותר על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה או קונפוקלית. לבסוף, RAAV 8 מסוגל להדביק מגוון סוגי נוירונים בקליפת המוח עם תיוג חזק של תהליכים עדינים לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כ-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.