Name: מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למדו לעקוב אחרי מעגלים עצביים במוח העכבר העוברי באמצעות סמנים גנטיים חוצי-סינפטיים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציית תא בודד של התפתחות מעגלים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למייקל קנדליש על ההערות הביקורתיות על כתב היד. פרויקט זה נתמך על ידי מענקי Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 ו-SFB/TRR 152 P11 ו-Z02 לאולריך בוהם.

הערה: אתיקה הצהרה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של אוניברסיטת המבורג ובאוניברסיטת Saarland. 1. הכנה וקיבוע של רקמה העוברית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים את כל הציוד הדרוש ללנתח את העוברים ולהכין פתרונות לקיבעון הבא של הרקמה לפני להקריב בעלי החיים. הערה: תמיד להכין פתרון paraformaldehyde 4% טריים (PFA) (4% PFA ב 0.1 M מלוח פוספט (PBS), להתאים את ה- pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבת עכבר בהריון בעיתוי בנוהל שאושר מבחינה אתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על גבי פלטפורמה. להרטיב את הצד הגחוני של הבטן עם 70% אתנול ו לעשות חתך אנכי באמצעות מספריים חדים לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את השרשרת העוברית ולמשוך אותו החוצה מלקחיים בוטים באמצעות זהירות ולמקם אותו לתוך PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העוברים הבודדים מהשרשרת העוברית באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר. הסרה של רקמה נוספת סביב העוברים ולשטוף אותם בPBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת ביופסיה זנב קטנה (לפני העברת העובר לPFA) ודגירה אותו במאגר תמוגה זנב לזיהוי המין וgenotyping אלל נותב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל מהעובר בצד לרוחב ביותר ולהעביר כל עובר בנפרד לתוך צינור המכיל 4% PFA קר כקרח על קרח על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את העוברים בגיל צעיר יותר E13.5 או עבור 1.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. משרים את העוברים בE14.5 הגיל וE15.5 תמורת 2.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לE16.5 גיל עוברים או יותר, לערוף ולהסיר את העור החיצוני לפני השריית הראש בפתרון PFA. ראשי עוברי E16.5 יכולים להיות טבולים תמורת 4.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקיבוע מתאים, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. מעביר את העוברים לתוך סוכרוז 30% בפתרון PBS על 4 מעלות צלזיוס עד שהם שוקעיםלתחתית. </li></ol> 2. הקפאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסדר את כל החומרים הדרושים לפני שמתחיל את תהליך ההקפאה: cryo-עובש, cryo-כפפות, מלקחיים אנטומולוגיה במשקל הנוצה, בטוש ומתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית cryo-העובש עם סמן אלכוהול עמיד קבוע (להזכיר את הכיוון של רקמות, תאריך וגנוטיפ). הכן רפש של קרח יבש כתוש ו 100% אתנול בדלי קרח. מניחים כוס זכוכית בתוך המכיל איזופנטאן. חכה 10 דקות לאיזופנטאן להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להסיר את הרקמה מפתרון סוכרוז, נגב את סוכרוז העודף סביב הרקמות באמצעות מגבוני מעבדה. העברת הרקמה לתוך cryo-עובש שכותרתו מראש עם אוקטובר מספיק כדי לכסות את הרקמה. הימנע מכל בועות אוויר ב- OCT; במיוחד סביב הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הרקמה ב אוקטובר באמצעות מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצה, כדי למנוע נזק לרקמות. התחל הקפאה על ידי העברת cryo-molד לאמבטיה איזופנטאן מקורר מראש. לא להתיז איזופנטאן ל- OCT כפי שהוא לא להקפיא כראוי. עטוף את הדגימות ברדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 14 מיקרומטר חלקים סידוריים דקים בסדרה &quot;חמש באמצעות cryostat ולאסוף בשקופיות זכוכית SuperFrost® פלוס עבור immunofluorescence ניתוח (IF). אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד מנוצל. </li></ol> 4. הדמיה Tracer שימוש בפרוטוקול Tyramide איתותים ההגברה (TSA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ טריס-NaCl-Tween (TNT) ביום השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ TNT באמצעות 100 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 7.5, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 500 μl של Tween 20 בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. הוסף את Tween 20 לאט ולשטוף את פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שכל Tween 20 הוא בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-NaCl-חסימת חיץ (TNB) באמצעות של 1 M טריס-HCl 100 מיליליטר 7.5 pH, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 5 גרם חסימה מגיב (מסופק עם ערכה) לאט במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון בהדרגה ל -55 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף לפזר מגיב חסימה לחלוטין (זה לא צריך לקחת יותר מ30-60 דקות). כדי להשיג חימום אחיד להשתמש אמבט מים ב 55 ° C. הפתרון יופיע חלבי. להביא את הפתרון לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש מגיב ביוטין tyramide (מצורף לערכה) בכיתה HPLC-ביולוגיה מולקולרית / DMSO. תלוי איזה ערכה משמשת את הכמות המתאימה של DMSO עשויה להשתנות. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: סעיפים מבעלי חיים הטרוזיגוטיים לאללים Cre וR26 המתאימים יכולים לשמש לניתוח מעגל. שימוש שלections מהמלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, כפקדים שליליים. פנק את שקופיות בקרה שליליות בדיוק כמו שקופיות מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים. בנוסף, כולל שקופיות שליטה אחד מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים אבל להשאיר את מגיב TSA (שליטת unamplified). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל טרי חד להסיר אוקטובר העודף המקיף את חלקי רקמות ולסמן את הגבול סביב החלקים עם עט PAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השקופיות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% פתרון H 2 O 2 במתנול קר כקרח כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. דגירה של 10 דקות ב 0.5% Triton-X 100 בPBS לpermeabilization רקמות. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם TNB (חסימת פתרון, 200-300 μl לכל שקופית) במשך 30דקות ב RT בתא humidified. ודא שכל החלקים מכוסים לחלוטין על ידי TNB. אל תתנו לשקופיות להתייבש בין הצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את חיץ חסימת עודף ולהחיל antiserum העיקרי הכרה נותב (1: 1,000 העז נגד WGA לBL, 1: 15,000 ארנב נגד GFP לGTT) מדולל בTNB לשעה 2 ב RT או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד להשתמש נפח מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה (200-300 μl לכל שקופית) לחלוטין. הערה: דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקטעים עם antiserum המשני biotinylated הכרה בשורה של antiserum הראשון (1: IgG 500 הסוס האנטי-העז לאנטי-WGA, 1: IgG נגד ארנב העז 5,000 לאנטי-GFP בTNB עבור שעה 1 ב RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם TNT ב RT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה ב 1: 100 streptavidin (SA) peroxidase חזרת -conjugated (SA-HRP wi, ובלבדth הערכה) בTNB למשך 30 דקות ב RT בתא humidified. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. בינתיים להפשיר TSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל TSA 01:50 בdiluent ההגברה TSA (מצורפת לערכה; להשתמש בערכת TSA להדמיה של BL וערכת TSA + לGTT). דגירה סעיפי הרקמות בTSA המדולל לבדיוק 10 דקות ב RT. לדלל TSA רק לפני השימוש, באופן אידיאלי בשלב הכביסה הקודם, לא להשתמש בכל מגיב TSA מדולל שנותר לניסויים עתידיים; תמיד להכין טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה עם 1: 500 המצומד Alexa Fluor® 546 streptavidin בTNB למשך 30 דקות ב RT. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10 דקות ב 5% פתרון bisbenzimide PBS ב RT עבור מכתים גרעיני. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. הר עם Fluromount G ולבצע epifluorescence או confocal. <em&gt; פתרון בעיות: יעילות של העברה נותב תהיה תלויה ברמת הביטוי של מוקד ROSA26 בתאים המייצרים (שנקבע על ידי קו נהג Cre בשימוש) ועל המעגלים העצביים ניתחה (למשל מספר הנוירונים הפקה נותב, וכו &#39;התכנסות). לכן דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים כדי למנוע אות נמוכה או עודפת. רקע תמיד צריך לנתח באמצעות שקופיות בקרה מתאימות (ראה לעיל). </li></ol> 5. τlacZ מכתים לסעיפים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ C LacZ לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) פתרון מניות (40 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי הוספת 40 גרם של X-gal עד 1 dimethylformamide מיליליטר 70% (DMF). מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן tetrazolium הכחול ניטרו (NBT) stפתרון Ock (50 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי הוספת 50 גרם של NBT לDMF 1 מיליליטר 70%. מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LacZ קוֹבֵעַ באמצעות 80 μl של glutaraldehyde 25%, 5 מיליליטר של 4% PFA, 20 μl של 1 M MgCl 2, של 500 מ&quot;מ EGTA 100 μl, 1 מיליליטר של חיץ pH M פוספט 1 7.4 וDDH 2 O עד גמר נפח של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LacZ חיץ 1 מיליליטר באמצעות של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ&quot;מ EGTA, 50 מיליליטר של 1 M pH חיץ פוספט 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן B חיץ LacZ באמצעות 1 מיליליטר של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ&quot;מ EGTA, 5 deoxycholate מיליליטר של 1% נתרן, 10% NP-40 100 מיליליטר, 50 מיליליטר של חיץ פוספט pH 1 M 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ C LacZ על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות NBT ו12.5 μl של מניות פתרון X-gal עד 1 מיליליטר של חיץ B. LacZ הפוך טרי רק לפני השימוש ומכסים ברדיד אלומיניום. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השקופיות ב RT לפחות במשך 10-15 דקות (בינתיים להכין שקופיות עם עט PAP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הסעיף עם LacZ קוֹבֵעַ למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר בתא humidified בתוך קטר-מנדף כימי. לשטוף 3 פעמים עם PBS בתוספת 2 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות עם א &#39;חיץ LacZ שטוף את השקופיות עם LacZ חיץ 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT. לשטוף 2 פעמים עם החיץ B LacZ במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות בC חיץ LacZ ב30-37 מעלות צלזיוס במשך שעה 6 או לילה בתא humidified. הערה: הוספת נפח מספיק של חיץ C LacZ; שקופיות לא צריכים להתייבש במהלך דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה מתאימה לשטוף את השקופיות עם PBS בתוספת 2 מ&quot;מ MgCl 2. יש לשטוף את החלקים בקצרה עם DDH 2 O. Coverslip עם ג&#39;לטין גליצין של מאיר. מתאים למיקרוסקופ אור מצויד בסט-אפ הדמיה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC). </li></ol> 6. Gendאה וGenotyping Tracer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה זנב באמצעות 1 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 8.5, של 500 מ&quot;מ EGTA 100 μl, 200 μl של 10% SDS, 400 μl של 5 M NaCl וDDH 2 O כדי לפצות נפח סופי של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ תמוגה זנב לכל צינור Eppendorf המכיל ביופסית זנב. להוסיף K proteinase לריכוז סופי של 100 מ&quot;ג / מיליליטר. דגירה הלילה על שייקר ב 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 17,000 XG במשך 10 דקות ב RT. מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות חדש. הוסף 500 μl של isopropanol לsupernatant. מערבבים במשך לפחות 5 דקות על ידי היפוך הצינורות למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בצנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 5 דקות בRT. יוצקים את supernatant. הוסף 200 μl של 70% אתנול. לנער במשך 5 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant עם Pipetman (לא לשפוך את). ייבש את הכדור בתא חם (37 מעלות צלזיוס) במשך 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה ב100 μlpH הנמוך TE 8.0 או מים באמצעות טיפים רחבים נשא מסוננים. שים ב -55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ועל 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להמסה נכונה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש μl 1 של ה- DNA לתגובת PCR (תערובת תגובת 50 μl המכילה 1 μl של DNA זנב, 2.5 μl DMSO, 10:00 של כל צבע יסוד, 25 מיקרומטר של כל dNTP, וbetaine 1M). פריימרים PCR לgenotyping וזיהוי מין רשומים בטבלת חומרים. </li></ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

יש להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes להתחקות המעגלים העצביים של אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטי יש מספר יתרונות בהשוואה להזרקת stereotaxic של קליעים נותבים או וירוסי neurotopic. ראשית, נותב מופק כחלבון אנדוגני ולכן אינו מפיק כל תגובה חיסונית ומסלול עצבי סלקטיבית ניתן לנתח בבעלי חיים שונים עם שחזור גבוה. שנית, משום שזו שיטה לא פולשנית זה יכול להיות מנוצל כדי לאתר את המעגלים מתאי עצב אינו נגישים בקלות לזריקות stereotaxic, למשל ברחם. מגבלות כוללות יעילות נמוכה בד...

מעקב נתיב האנטומי הוא אחד הכלים הנפוצים ביותר בשימוש לפענח את הקשר בין המוח והתנהגות 1. קידום בטכנולוגיות מעגל התחקות עצביות העניק מדעני מוח עם היכולת לעקוב אחר מעגלים עצביים מאוכלוסיות נוירון זיהו גנטי בעכברים 2. למרות התקדמות הטכנולוגית אלה נותרים מאתגרים לפענח את היווצרותם של מעגלים עצביים במיוחד בתקופת התבגרות עוברית. סיבה לכך הוא שרוב שיטות המעקב שפותחו עד היום מבוססים על הזרקת stereotaxic של קליעים נותבים transsynaptic או וירוסי neurotropic מהונדסים גנטי (איור 1) 2,3. בעוד טכניקות אלה להשיג רזולוציה מרחב ובזמן של קישוריות, כמה מגבלות מובנות כגון זריקות נותב מאתגרות מבחינה טכנית למוח המתפתח, שחזור של אתר הזרקה, דלקת פוטנציאלית במקום ההזרקה וimpor ביותרcytotoxicity tantly נגרמת על ידי וירוסי neurotropic להגביל את השימוש בם 4. שיטה חלופית היא להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes בעכברים שעברו מוטציה גנטית. יש לנו לאחרונה שונו בטכניקה זו ופיתחתי מערכת בינארית transsynaptic גנטי התחקות למפות את המעגלים העצביים של כל אוכלוסייה עצבית מזוהה גנטי 5. האסטרטגיה הניסיונית שלנו מבוססת על שני זנים חדשים לדפוק בעכבר, המבטאים גם לקטינים שעורה נותב דו-כיווני (BL) 6 או בר רעלנים נותב מדרדר C התמזג GFP (GTT) 7 מלוקוס ROSA 26 לאחר Cre תיווך רקומבינציה. כאן אנו משמשים זני עכבר אלו כדי להביע את BL וGTT בתאי עצב המייצרים kisspeptin, neuropeptide שמעורב בויסות ההתבגרות של ציר הרבייה 8,9 באופן סלקטיבי. אנו מראים כי טכניקה זו היא מתאימה כדי לחזות את ההתפתחות והתבגרות של נשיקהמעגלים עצביים peptin במהלך התפתחות עוברית של מוח העכבר נקבת 5. אסטרטגית רבייה R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) והקווים נותב R26-GFP-TTC (GTT) הם לדפוק בזנים 5 שנושאים אללים ROSA26 רקומביננטי. R26-BIZ ואללים R26-GTT הם תעתיק שקטים בשל נוכחותם של איתות חזקה תעתיק תחנה, שמעוטרת בשני אתרי loxP 5. ביטוי של transgene BIZ וGTT מופעל על ידי ההסרה בתיווך Cre של אות תחנת תעתיק. ניתן להשתמש אללים R26-BIZ וR26-GTT באופן עצמאי על ידי פשוט חצייה עם קו נהג Cre. להטרוזיגוטיים בעלי חיים ניתוח לאללים Cre וR26 המתאימים ניתן להשתמש. המלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, צריכה לשמש כקבוצת ביקורת. לחלופין, אפשר גם ליצור triple לדפוק בבעלי חיים שנשאו את אללים Cre, R26-BIZ וR26-GTT, אולם זה יחייב צלב אחד נוסף.

<table><tbody><tr><td>ביסבנזימיד (צבע Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>תבנית קריו (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20 מ"מ</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל פורממיד (DMF)</td> <td>VWR כימיקלים</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>איזופנטן (מתיל 2-בוטאן)</td><td>סיגמא</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>גליצין ג'לטין של קייזר</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>סיגמא</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>תחליף Nonidet P40</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP עט</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>ערכת TSA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Light מצויד בהדמיית DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 מצויד בתוכנת</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>מיקרוסקופ Fluroscence</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 מצויד בתוכנת</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WGA (מזהה BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylayted סוס נגד עזים IgG</td><td>וקטור Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>עז ביוטינילציה אנטי ארנב IgG</td><td>וקטור Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFP (מזהה GTT)</td> <td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GnRH</td><td>זיקה ביו ריאגנט</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-חמור אנטי-ארנב IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">פריימרים</td></tr><tr><td>BL Fwd (לגנוטיפ BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (לגנוטיפ BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (לגנוטיפ Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (for Cre genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (עבור גנוטיפ GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (עבור גנוטיפ GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (עבור גנוטיפ מגדרי)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (for gender genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

מותנה הגנטי transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

מעקב אחר נתיב אנטומי הוא בעל חשיבות מכרעת לפענוח הקשר בין המוח להתנהגות. עם זאת, חשיפת היווצרותם של מעגלים עצביים במהלך ההתבגרות העוברית של המוח היא מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שרוב שיטות המעקב הטרנס-סינפטיות שפותחו עד כה תלויות בהזרקת מעקב סטריאוטקסי. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה גנטית בינארית למעקב גנטי טרנס-סינפטי מותנה במוח העכבר. לקראת מטרה זו יצרנו שני זני עכברים משלימים כדי לבטא באופן סלקטיבי את לקטין השעורה הטרנס-סינפטי הדו-כיווני (BL) ואת העוקב הטרנס-סינפטי הנסיגתי Tetanus Toxin שבר C מלוקוס ROSA26 לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. ייצור עוקב ספציפי לתא בעכברים אלה מקודד גנטית ואינו תלוי בהזרקת מעקב מכנית. לכן הגישה הניסויית שלנו מתאימה לחקר היווצרות מעגלים עצביים במוח העכברי העוברי. יתר על כן, מכיוון שהעברת עוקבים על פני סינפסות תלויה בפעילות סינפטית, ניתן להשתמש בזני עכברים אלה כדי לנתח את התקשורת בין אוכלוסיות עצביות מוגדרות גנטית במהלך התפתחות המוח ברזולוציה של תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב טרנס-סינפטי בעוברי עכברים באמצעות האללים הרקומביננטיים החדשים ROSA26. השתמשנו בטכניקה ניסויית זו על מנת לתאר את המעגלים העצביים העומדים בבסיס התבגרות ציר הרבייה במוח העכבר הנקבה המתפתח.

סעיף זה מציג תוצאות נציג שניתן להשיג בעבודה עם R26-BIZ (Z RES-τlac L- אני B) וR26-GTT (G FP- TT C) אללים. כאן אנו משתמשים R26-BIZ ואללים R26-GTT לנתח את ההבשלה של המעגלים העצביים המסדירים את ציר הרבייה. הרבייה בבעלי החוליות נשלטת מרכזית על ידי קבוצה קטנה של תאי עצב בהיפותלמוס, שמפרישים הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). Kisspeptin, activator חזק של נוירונים GnRH, היה מעורב בהסדרת פעילותם של נוירונים GnRH, עם זאת, כאשר המעגלים העצביים ב...

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

מטרת הניסוי הבא היא להמחיש את התפתחותם של מעגלים עצביים במוח של עוברי עכברים באמצעות שלוש מערכות שונות לסימון תאים: שימוש במסמן טרנס-סינפטי הנע באופן דו-כיווני, מסמן שני הנע אך ורק באופן רטרוגרדי, וסימון שלישי שאינו נע מהתא המטרה. בדרך זו ניתן לזהות את הנוירון מטרה, את הנוירונים שמעליו (upstream) ואת הנוירונים שמתחתיו (downstream). התוצאות מדגימות כי ניתן להשתמש בפרוטוקול ניסיוני זה כדי לנתח את היווצרותם של מעגלים עצביים במוח של עוברי עכברים נקבות ברזולוציה של תא בודד.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון מתי נוצרים מעגלים עצביים ספציפיים וכיצד הם מאורגנים במהלך ההתפתחות העוברית. ניתן להשתמש בשיטה זו גם למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים בוגרים. באופן ספציפי, ניתן להשתמש בה לניתוח פעילות סינפטית בין נוירונים שזוהו גנטית, ולניתוח האופן שבו תנאים ניסיוניים שונים עשויים לווסת מעגל עצבי לאורך זמן.התחל עם עכברה בהריון ש acab-הורדמה זה עתה. נקה את הצד הוונטרלי של בטנה באמצעות 70% ethanol, ולאחר מכן בצע חתך אנכי כדי לחשוף את העוברים. הוצא את שרשרת העוברים והעבר אותם לצלחית עם PBS קר מאוד.הוציאו את העוברים הבודדים באמצעות פינצטה קהה. הפרידו בין העוברים הבודדים בתוך התמיסה בעזרת מספריים עדינים ופינצטה, והסירו רקמות עודפות בתהליך עד להניקיון מלא של העוברים. בצעו ביופסיה קטנה מהזנב של כל עובר והעבירו אותה למבחנה עם תמיסת ליזיס (lysis buffer) לצורך איסוף DNA לזיהוי מין וגנוטיפיקה.לאחר מכן, העבירו את העובר ל-4% PFA קר, שהוכן טרי, על קרח. לאחר עיבוד כל עובר, השאירו אותם לדגירה ב-PFA תוך써 ערבוב למשך 1.5 שעות לפחות, בהתאם לגודלם. עם סיום הדגירה.שטפו את הרקמות המקובעות שלוש פעמים ב-PBS קר בקרח למשך חמש דקות לפחות לכל שטיפה. לאחר מכן, העבירו את העוברים לתמיסת סוכרוז 30%, שנשמרה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הרקמות שוקעות לחלוטין בתמיסה, המשיכו לביצוע חיתוכים קפואים (cryosectioning).ראשית, התחילו בסימון של תבנית קירור (cryo mold) באמצעות טוש קבוע עמיד באלכוהול. לאחר מכן, הכינו עיסה של קרח יבש גרוס ב-100% Ethanol בדלי קרח; בעזרת העיסה קררו ביכור זכוכית המכיל isopentane למשך כ-10 דקות. בזמן ההמתנה, הוציאו את הרקמות מתמיסת הסוכרוז ונגבו את שאריות הסוכרוז בעזרת נייר ניגוב סטנדרטי למעבדה.לאחר מכן, העבירו את הרקמה לתבנית קריו (cryo mold) שסומנה מראש. הוסיפו מספיק OCT כדי לכסות את הרקמה. היזהרו לא ליצור בועות אוויר ב-OCT, ובמיוחד סביב הרקמה.בשלב הבא, כוון את הרקמה באמצעות פינצטת אנטומיה בעלת משקל קל כדי לגרום לנזק מינימלי. הקפא את תבניות הקריו באמבט iso pentane מקורר ללא התזות, במידת הצורך. ניתן לעטוף את התבניות הקפואות ולאחסן אותן בטמפרטורה של 80- degrees celsius לצורך ביצוע חיתוכים.חתכו אותם לחתכים סדרתיים בעובי 14 micron, בסדרות של חמישה. אספו כל סדרה של חמישה חתכים על שקף זכוכית מסוג super frost plus. בעת הכנת התמיסה לפרוטוקול זה, הקפידו להוסיף את ה-tween 20 לאט לתוך ה-TNT buffer, שיש להכינו טרי.לאחר מכן, העבירו את התמיסה למעלה ולמטה באיטיות כדי לערבב. בעת הכנת באפר ה-TNB, הוסיפו את רכיב החסימה באיטיות ובמנות קטנות תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, חממו את התמיסה ל-55 °C באמצעות מקבץ מים.התמיסה תהפוך לחלבית. כעת, כדי להתחיל בעבודה על הרקמות, השתמשו תחילה בסכין מנתחים (scalpel) להסרת עודפי OCT שסביב חיתוכי הרקמה. לאחר מכן, סמנו את גבולות כל חיתוך בעזרת עט סימון (pap pen).המתינו עד שהשקופיות יגיעו לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו אותן בבופר 1XPBS בטמפרטורת החדר, שלוש פעמים, כאשר כל שטיפה תימשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו נטרול של פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית על ידי דגירה של השקופיות למשך חצי שעה במימן פéroקסיד 0.3% במתנול, בקירור על קרח.בצע לאחר מכן שלושה שטיפות ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, הדגר את השקופיות למשך 10 דקות ב-PBST כדי להגביר את חדירות הרקמות (permeation). הפעם, שטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TNT.כעת, בתוך תא לחות, בצעו חסימה של הרקמה בכמות מספקת של TNB שתכסה כל שקופית. הניחו לחסימה להימשך חצי שעה בטמפרטורת החדר. אין לאפשר לשקופיות להתייבש.לאחר ניקוז של תמיסת החסימה, כסו את השקופית לחלוטין בנוגדן ראשוני ב-TNB כדי לקשור את הסמן. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C. כדי להסיר את הנוגדן הראשוני, שטפו את השקופית עם TNT שלוש פעמים בטמפרטורת החדר, למשך חמש דקות לכל שטיפה.במהלך שטיפות אלו, השתמשו בערבוב עדין. לאחר מכן, דגרו את החתכים בתמיסת הנוגדן המשני למשך שעה אחת. לאחר מכן, בטמפרטורת החדר, בצעו שלושה שטיפות TNT כדי להסיר את הנוגדן המשני שאינו קשור.לאחר מכן, בתוך תא לחות, הדגרי את הרקמות ב-1:100 של havein מופשט המצומד ל-horse radish peroxidase ב-TNB למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך שטיפת השקופיות ב-TNT. לאחר ההדגרה, הכיני דילול טרי של תמיסת TSA. כעת, יישמי את דילול ה-TSA שהוכן זה עתה על הרקמות למשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר.התזמון המדויק של דגירת ה-TSA הוא קריטי. לכן, אין לנסות לעבד יותר מדי שקופיות בבת אחת. ניתן לטפל בעד 10 שקופיות בשלב אחד.ניתן להמתין עם שקופיות נוספות בבופר שטיפה TNT עד שיהגעו לתורם לעיבוד לאחר סבב שטיפות נוסף. דגרו את הרקמות עם נוגדן ראשוני Alexa Fluor 546 מצומד ב-TNB למשך 30 דקות.בטמפרטורת החדר, הסיר את הצמיג ה-habitant שנסחף באמצעות שלושה מקצוות TNT נוספים. לאחר מכן, לצביעה גרעינית, מרח תמיסת 5%BIS benza ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, והסר את צבע ה-BIS benzo באמצעות שלושה שטיפות TNT. לאחר מכן, קבע את השקופיות עם fluoro Mount G והמשך בניתוח שלהן.באמצעות הפרוטוקול המתואר, נותחה הבשלת המעגלים העצביים המווסתים את הציר הרבייתי בעכברים הנושאי את האללים R 26 BIZ ו-R 26 GTT. ביטוי הגנים התחולליים הופעל על ידי רקומבינציה תלויית creed בנוירוני קיספטין עובריים בגרעין הקשתי (arcuate nucleus), תוך שימוש בקו דרייבר של creed ספציפי לקיספטין. אימונופלורסצנציה כפולה עבור קיספטין בירוק ו-BL באדום מדגם kiss. IC R 26 BIZ.עכבר מראה הפעלה של BL ב-KISS IC R 26 GTT. אימונופלואורסצנציה כפולה בעכבר מראה KISSPEPTIN בירוק ו-GTT שהופעל על ידי מנוע ה-Cree באדום. אלו ומדדים אחרים הוכיחו כי הגנים התעתקו היו פונקציונליים בעוברים ניסיוניים בשלב E 18.5. נמצא כי נוירוני His pepin בגרעין הארקואט כבר נמצאים בתקשורת עם GNRH.נוירונים חסרי Z היו מוגבלים לנוירוני קיספטין המבטאים CRE, בעוד ש-BL הועבר באופן טרנס-סינפטי לנוירונים שמעלה ושמטה. חלק מנוירוני GNRH, אך לא כולם, הכילו bl.לפיכך, רק תת-קבוצה של נוירוני GNRH עובריים מחוברת סינפטית לנוירוני קיספטין בגרעין הארקואט. נוירוני GNRH לא הכילו את הסמן רטרוגרדי. GTT המדגים כי נוירונים אלה נמצאים במורד זרימת האותים של נוירוני קיספטין.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה ביום אחד בהתאם לדרך פעולה זו. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון אימונופלואורסצנציה כפולה, כדי לזהות את הטבע הביוכימי של נוירונים מקושרים. טכניקה זו אמורה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחומי מדעי העצבים והביולוגיה ההתפתחותית לחקור קישוריות עצבית ברזולוציה של תא בודד, הן במהלך ההתפתחות והן בבעלי חיים בוגרים.לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להציג ויזואלית את ההיווצרות וההבשלה של מעגלים עצביים בעכברים.

conditional-genetic-transsynaptic-tracing-in-the-embryonic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למדו לעקוב אחרי מעגלים עצביים במוח העכבר העוברי באמצעות סמנים גנטיים חוצי-סינפטיים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציית תא בודד של התפתחות מעגלים עצביים.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

גלה סרטונים נוספים