מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי
22 בדצמבר 2014
תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.
מטרת הניסוי הבא היא לדמיין את התפתחות המעגלים העצביים במוח העכבר העוברי באמצעות שלוש מערכות תיוג תאים נפרדות על ידי שימוש בעוקב טרנס-סינפטי שנע דו-כיווני, עוקב שני שנע רק בנסיגה ותווית שלישית שאינה עוברת מתא המטרה. אפשר לזהות את תאי העצב במעלה הזרם ואת תאי העצב במורד הזרם. התוצאות מדגימות כי ניתן להשתמש בפרוטוקול ניסיוני זה כדי לנתח את היווצרותם של מעגלים עצביים במוח העכבר הנקבה העוברי ברזולוציה של תא בודד.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים, כגון מתי נוצרים מעגלים עצביים ספציפיים וכיצד הם מאורגנים במהלך ההתפתחות העוברית. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לעקוב אחר מעגלים עצביים בעכברים בוגרים. באופן ספציפי, ניתן להשתמש בו כדי לנתח פעילות סינפטית בין נוירונים שזוהו גנטית, וניתן להשתמש בו כדי לנתח כיצד תנאי ניסוי שונים עשויים לווסת מעגל עצבי לאורך זמן.
התחילו עם עכבר בהריון שזה עתה הורדם בהמתת חסד. נקה את הצד הגחוני של הבטן שלה עם אתנול 70%, ולאחר מכן בצע חתך אנכי כדי לחשוף את העוברים. הסר את שרשרת העוברים והעביר אותם לצלחת PBS קרה כקרח בצלחת.
הסר את העוברים הבודדים באמצעות מלקחיים קהים. הפרד את העוברים הבודדים בתמיסה באמצעות מספריים ומלקחיים עדינים, תוך הסרת רקמה נוספת בתהליך כאשר העוברים מנוקים במלואם. קח ביופסיית זנב קטנה מכל עובר והכניס לצינור של מאגר ליזה כדי לאסוף DNA לזיהוי מין וגנוטיפ.
לאחר מכן העבירו את העובר לקר קרח טרי, 4% PFA על קרח. לאחר עיבוד כל עובר, הניחו להם לדגור ב-PFA בתסיסה למשך 1.5 שעות לפחות, תלוי בגודלם. בסיום הדגירה.
שטפו את הטישו הקבוע שלוש פעמים עם PBS קר כקרח למשך חמש דקות לפחות בכל כביסה. לאחר מכן העבירו את העוברים לתמיסת סוכרוז של 30%, שנשמרה בארבע מעלות צלזיוס. כאשר הרקמות שקועות לחלוטין בתמיסה, המשך בהקפאה.
ראשית, התחל בתיוג תבנית קריו באמצעות טוש עמיד לאלכוהול קבוע. לאחר מכן, הכינו תרחיץ של קרח יבש כתוש ב-100% אתנול בדלי קרח בעזרת התרחיץ מצננים זכוכית של איזופ פנטן למשך כ-10 דקות. בזמן ההמתנה, הסר את הרקמות מתמיסת הסוכרוז ונגב את עודפי הסוכרוז במגבון מעבדה רגיל.
לאחר מכן העבירו את הרקמה לתבנית קריו מסומנת מראש. עם מספיק OCT כדי לכסות את הרקמה. אין ליצור בועות אוויר ב-OCT, במיוחד סביב הרקמה.
לאחר מכן, כוונו את הרקמה באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים במשקל נוצה כדי לגרום לנזק מינימלי. הקפיאו את תבניות הקריו באמבט איזו פנטן מקורר מבלי לגרום להתזות במידת הצורך. ניתן לעטוף את התבניות הקפואות ולאחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לחתוך את התבניות.
חותכים אותם לחלקים סדרתיים בעובי 14 מיקרון בסדרה של חמישה. אוספים כל סדרת חמש פרוסות על שקופית זכוכית סופר כפור פלוס. בעת הכנת תמיסה לפרוטוקול זה, הקפד להוסיף את ה-tween 20 לאט למאגר TNT, אותו יש להכין טרי.
לאחר מכן שטפו את התמיסה למעלה ולמטה לאט כדי לערבב. בהכנת מאגר ה-TNB, הוסף את המגיב החוסם לאט במרווחים קטנים תוך כדי ערבוב. ואז מחממים את התמיסה ל 55 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.
התמיסה תהפוך לחלבית. כעת, כדי להתחיל לעבוד על הרקמות השתמש תחילה באזמל כדי להסיר את עודפי ה-OCT המקיפים את חלקי הרקמה. לאחר מכן סמן את הגבולות של כל חלק באמצעות עט פאפ.
תן לשקופיות להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו אותם בטמפרטורת החדר מאגר XPBS אחד, שלוש פעמים כל שטיפה צריכה להיות באורך של חמש דקות. לאחר מכן, הרוו את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית על ידי דגירה של המגלשות למשך חצי שעה בקור קרח, 0.3% מי חמצן במתנול.
המשיכו עם שלוש שטיפות ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל כביסה. לאחר מכן דגרו את השקופיות למשך 10 דקות ב-PBST כדי לחלחל את הרקמות. הפעם, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם TNT.
עכשיו בתא לח, חסום את הרקמה במספיק TNB כדי לכסות כל שקופית. הניחו לבלוק לעבור חצי שעה בטמפרטורת החדר. אל תתנו למגלשות להתייבש.
לאחר ניקוז המאגר החוסם יש לכסות לחלוטין את השקופית עם הנוגדן העיקרי ב-TNB כדי לקשור את העוקב. דגירה במשך שעתיים ב-RT או לילה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר את הנוגדן הראשוני, שטפו את השקופית עם TNT שלוש פעמים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לכל כביסה.
במהלך שטיפות אלה, השתמש בתסיסה עדינה. לאחר מכן, דגרו את החלקים בתמיסת הנוגדנים המשנית למשך שעה. בטמפרטורת החדר מאוחר יותר, השתמש בשלוש שטיפות TNT כדי להסיר את הנוגדן המשני הלא קשור.
לאחר מכן בתא לח, דגרו את הרקמות באחד עד 100 פרוקסידאז צנון סוסים מצומד ב-TNB למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך שטיפת המגלשות ב-TNT. לאחר הדגירה, בצע דילול טרי של תמיסת TSA. כעת מרחו את דילול ה- TSA הטרי על הרקמות למשך 10 דקות בדיוק בטמפרטורת החדר.
העיתוי המדויק של הדגירה של TSA הוא קריטי. לכן, אל תנסו לעבד יותר מדי שקופיות בכל פעם ביד שלנו. ניתן לטפל בעד 10 שקופיות בשלב אחד.
שקופיות נוספות יכולות להמתין במאגר הכביסה של TNT עד לעיבודן לאחר סבב נוסף של כביסות. דגרו את הרקמות עם אחד עד 500 אלקסה קומה 5 46 מופשטים. יש אותו במצומד ב-TNB למשך 30 דקות.
בטמפרטורת החדר, הסר את מצומד התושב המופשט עם שלוש אמבטיות TNT נוספות. לאחר מכן לצביעה גרעינית, יש למרוח תמיסת בנזה של 5% BIS ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, להסיר את כתם הבנזו של BIS בשלוש שטיפות TNT. לאחר מכן הרכיב את השקופיות עם פלואורו הר G והמשך בניתוח שלהם.
באמצעות הפרוטוקול המתואר, נותחה הבשלת המעגלים העצביים המווסתים את ציר הרבייה בעכברים הנושאים את האללים R 26 BIZ ו-R 26 GTT. ביטוי הטרנסגנים הופעל על ידי רקומבינציה תלויה באמונה בנוירונים עובריים של קיספפטין בגרעין הקשת באמצעות קו נהג אמונה ספציפי לקיספפטין, אימונופלואורסצנציה כפולה עבור קיספפטין בירוק ו-BL באדום מנשיקה. IC R 26 ביז.
עכבר מראה הפעלה של BL ב-KISS IC R 26 GTT Mouse אימונופלואורסצנציה כפולה מראה KISSPEPTIN בירוק ו-GTT מופעל על ידי נהג Cree באדום. אבחונים אלה ואחרים הראו כי הטרנסגנים היו פונקציונליים בעוברי ניסוי E 18.5. נוירוני הפפין שלו בגרעין הקשת נמצאו כבר מתקשרים עם GNRH.
תאי עצב חסרים Z הוגבלו לנוירונים המבטאים את ה-CRE ואילו BL הועבר באופן סינפטי לתאי עצב במעלה הזרם ובמורד הזרם. חלקם, אבל לא כולם. נוירונים של GNRH הכילו bl.
לפיכך, רק תת-קבוצה של נוירונים עובריים של GNRH מחוברת באופן סינפטי לנוירונים של גרעין קיספפטין. נוירונים של GNRH לא הכילו את העוקב לאחור. GTT מדגים כי נוירונים אלה נמצאים במורד הזרם של נוירוני קיספפטין.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד לאחר הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו אימונופלואורסצנציה כפולה כדי לזהות את האופי הביוכימי של נוירונים מחוברים. טכניקה זו אמורה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח והביולוגיה ההתפתחותית לחקור קישוריות עצבית ברזולוציה של תא בודד הן במהלך ההתפתחות והן בבעלי חיים בוגרים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים בעכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למעקב אחר מעגלים עצביים במוח של עוף עכבר עוברי באמצעות סמני מעקב טרנס-סינפטיים מקודדים גנטית. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של התפתחות מעגלים עצביים ברזולוציה של תא בודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מעגלים עצביים
רקע
- הבנת התהליכים של היווצרות מעגלים עצביים היא קריטית למדעי המוח ההתפתחותיים.
- סומנים טראנס-סינפטיים מאפשרים לחקור את הקישוריות של נוירונים.
- המוח של עוברי עכברים משמש כמודל למחקר של התפתחות עצבית.
- ייצור סומנים ספציפיים לתאים מאפשר ביצוע ניתוח ממוקד.
מטרת המחקר
- להדמיית התפתחותם של מעגלים עצביים במוח של עכבר עוברי.
- לניתוח הארגון של מעגלים עצביים ספציפיים במהלך ההתפתחות.
- לספק פרוטוקול שניתן ליישום הן בעכברים עובריים והן בעכברים בוגרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בשלוש מערכות שונות לסיתמון תאים.
- יישום של סמן טרנס-סינפטי דו-כיווני.
- שימוש בסמן רטרוגרדי ובסמן שאינו נדדה.
- ניתוח של מעגלים עצביים ברזולוציה של תא בודד.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מזהה בהצלחה נוירונים שמימם (upstream) ונוירונים שזרם (downstream).
- התוצאות מדגימות את היווצרותם של מעגלים עצביים במוח של עוברי עכבר נקבה.
- השיטה מאפשרת לנתח פעילות סינפטית בנוירונים שזוהו גנטית.
- היא מאפשרת לבחון כיצד תנאים ניסויים משפיעים על מעגלים עצביים לאורך זמן.
מסקנות
- פרוטוקול ניסיוני זה יעיל לחקר התפתחות מעגלים עצביים.
- הוא מספק תובנות לגבי התזמון והארגון של מעגלים עצביים.
- השיטה ורסטילית עבור ניתוח מעגלים עצביים הן בעוברי ভ্রקים והן במבוגרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
הבנה של תהליך היווצרות המעגלים העצביים במהלך ההתפתחות העוברית מספקת תובנות מכניסטיות לגבי הפרעות נוירו-התפתחותיות ותומכת בתיקוף יעדים (target validation) בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו למעקב טרנס-סינפטי המקודד גנטית מאפשרת מיפוי תלוי-פעילות של קשרים סינפטיים ברזולוציה של תא בודד, ומספקת מערכת הניתנת לשחזור להפחתת סיכונים בהיפותזות טיפוליות הקשורות לקישוריות עצבית. על ידי ביטול הצורך בהזרקה סטריאוטקסיס, השיטה משפרת את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) לאורך נקודות זמן התפתחותיות ורקעים גנטיים שונים, ובכך תומכת בהכנה עקבית של בדיקות למחקרי מעורבות יעדים (target engagement).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של קישוריות סינפטית בין אוכלוסיות נוירונליות המוגדרות גנטית במהלך חלונות התפתחותיים קריטיים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מקודדת גנטית, ללא צורך בהזרקה, המבטיחה ביטוי עקבי של הסמן (tracer) ומפחיתה שונות בניסויי מיפוי מעגלים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של אותות טרנס-סינפטיים תלויי-פעילות, המשקפות תקשורת סינפטית תפקודית בין נוירונים במעלה ובמורד המסלול.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ביטוי תלוי-Cre וספציפי לאתר מהלוקוס ROSA26, מה שמאפשר הכנה הדירה של רקמה עצבית לצורך ניתוחים המשכיים.
מחקרe תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כך שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר האופן שבו הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות משפיעות על התפתחות מעגלים עצביים לאורך זמן במודלים עובריים הרלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מציע זרימת עבודה תואמת-פלטפורמה שניתן לשלב עם אימונופלואורסצנציה, גנוטיפיקציה וקווי תהליך של דימות לצורך תיקוף רב-פרמטרי של מעורבות המטרה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה תומכת בתהליכי עבודה לגילוי מוקדם על ידי כך שהיא מאפשרת מיפוי מעגלים מונחה-השערה לפני זיהוי מובילים (leads), כאשר התוצאים מספקים מידע על רמת הביטחון במטרה ועל המוכנות לסריקה פנוטיפית בתוכניות למחקר התפתחות נוירולוגית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי ויזואליזציה של ההיווצרות והבשלות של מעגלים עצביים ספציפיים, כגון אלו המווסתים את הציר הרבייתי, ברזולוציה של תא בודד.
- סריקה: מאפשרת הכנה של מערכות עצביות סטנדרטיות וניתנות למעקב גנטי, המתאימות להערכת השפעות של תרכובות על קישוריות סינפטית במוחות עובריים או בוגרים.
- אנליזה: מייצרת קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה (למשל, BL, העברת אות GTT) המאפשרות השוואה של פעילות סינפטית בין תנאים, גנוטיפים או שלבי התפתחות שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין היווצרות מעגלים עובריים לתפקוד לאחר הלידה, על ידי מתן אפשרות לניתוח אורך (longitudinal analysis) של האופן שבו הפרעות התפתחותיות מוקדמות משפיעות על קישוריות עצבית בבגרות.
- שימוש חוזר ארגוני: זני ה-knock-in הכפולים של ROSA26 מהווים פלטפורמה גנטית הניתנת לשימוש חוזר, ישימה על פני מספר מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומודלים של מחלות, ללא צורך בהתערבות כירורגית חוזרת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי אספקת ראיות ישירות ותלויות-פעילות לקישוריות סינפטית בין אוכלוסיות נוירונים המוגדרות גנטית.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות ומפחית שונות טכנית באמצעות ביטוי תלוי-Cre המבוקר במיקום (locus-controlled), ובכך מבטל חוסר עקביות הנובע מהזרקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בבחירת מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי מתממשת ויזואלית מוקדמת של השפעות ברמת המעגלים של מודולציה גנטית או פרמקולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכון על ידי יצירת נתונים מכניסטיים על היווצרות מעגלים עצביים, המנחים את תיעדוף המטרות באינדיקציות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באמבריולוגיה של עכברים, גנוטיפיקציה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצורך טיפול נכון בעובריו, חיתוך דגימות וגילוי אותות.
- תלוי בזמינות של קווי Cre-driver ומערכות דווח פלואורסצנטיות לסימון תאים ספציפיים ותיקוף רב-מודאלי.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, חיתוך קריוגני ואימונוהיסטוכימיה כדי לשמר את אות הסמן ולהבטיח איכות חיתוך הניתנת לשחזור.
- התאמה למערכות מודל שונות תלויה בשימור התפקוד של הסמן הטרנס-סינפטי ובספציפיות של הפרומוטור במינים שאינם עכברים.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בפעילות סינפטית לצורך מעבר הסמן, דבר העשוי להשפיע על הרגישות במעגלים בעלי פעילות נמוכה או במעגלים לא בשלים.
