בדיקת מוות תאי באמצעות צביעת DAPI: שיטה לסינון מהיר של מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי IR בקווי תאים סרטניים

חשיפה לקרינה מייננת כמו קרני רנטגן עלולה לגרום לנזק ל-DNA, ובסופו של דבר להוביל למוות של תאים. כדי לסנן את ההשפעה של קרינה מייננת על פרופילי מוות תאי, התחל בלקיחת צלחת תרבית המכילה תאים סרטניים דבקים המונחים על פני הכיסוי.

הקרינו את צלחת התרבות בצילומי רנטגן למשך הזמן הרצוי. טיפול זה גורם לנזק לדנ"א בתוך התאים. לאחר מכן, שאפו את המדיה המושקעת מצלחת התרבות והוסיפו קיבוע מתאים. תמיסה זו מחלחלת לתאים ונועלת את הרכיבים התאיים במקומם במהלך שלבי הצביעה הבאים.

השלך את הפתרון המקבע. הסר את הכיסוי המכיל תאים שטופלו בקרני רנטגן מכלי התרבית. הפוך את הכיסוי והנח אותו על פני שקופית זכוכית הנושאת מעליו טיפת כתם DAPI כך שהתאים נמצאים במגע ישיר עם DAPI.

מולקולות ה-DAPI נכנסות לגרעינים ונקשרות לאתרי ה-DNA העשירים ב-A-T. כעת, דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגרעינים נראים כחולים ומציגים מורפולוגיות מובהקות.

התאים המציגים גרעינים מרוכזים ומקוטעים מעידים על אפופטוזיס, מוות תאי מתוכנת. אחרים המציגים גרעינים מרובי אונות מייצגים כי תאים חווים קטסטרופה מיטוטית. אלה עם גרעינים שטוחים המראים נקודות בהירות מרובות מרמזים על תאים שעוברים הזדקנות.

קח את התאים מהחממה ושאף את מדיום התרבות מצלחת התרבות. חותכים את קצה קצה המיקרופיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר כ -5 מילימטרים מהקצה בעזרת מספריים, והשתמשו בו כדי להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת קיבוע לצלחת התרבות.

מרחו את תמיסת הקיבוע לאורך קירות צלחת התרבות כדי למזער את הנזק לתאים. לאחר מכן, העבירו את צלחת התרבות הזו לכלי תרבות מרובעת ונערו אותה בעדינות כדי לפזר באופן שווה את תמיסת הקיבוע על הכיסוי. לאחר מכן, דגרו את המנה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

שאפו את תמיסת הקיבוע מהצלחת. כעת, הוסיפו 2 מיליליטר PBS לאורך קירות המנה ואז שאפו את ה- PBS. כדי להתכונן לצביעה DAPI, הוסף 5 מיקרוליטר של מגיב מכתים DAPI על שקופית זכוכית. לאחר מכן, הסר את הכיסוי מהכלי באמצעות אזמל ונקז עודפי PBS על הכיסוי על ידי נגיעה בקצה הכיסוי במגבת נייר.

כעת, הרכיב את הכיסוי הפוך על טיפת מגיב הצביעה DAPI על שקופית הזכוכית כך שהתאים ייחשפו למגיב הצביעה DAPI. לבסוף, בדוק את התאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן DAPI.