איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה באתרו הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

המטרה הכוללת של שיטה ציטוגנית מולקולרית זו היא לצפות בסטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים שנחשפו לקרינה כוללת של הגוף. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת המפתח בתחום הביולוגיה של הקרינה כגון הסיכון לגרימת סטיות כרומוזומליות יציבות בתאי מח העצם של עכברים שנחשפו לקרינה כוללת בגוף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה מודרכת של נזקים גנטיים יציבים הנגרמים על ידי קרינה בתאי מח העצם של עכברים הניתנים להתפשטות לאורך דורות רבים של תאים.

לאחר בידוד מח העצם מעצמות עצם הירך והשוקה של העכבר וביצוע תרחיף תא בודד על פי פרוטוקול הטקסט, שכב בזהירות את תרחיף התאים על נפח שווה של מדיום הפרדת תאים חד-גרעיניים של מח עצם. צנטריפוגה את השיפוע ב -400 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, אספו בזהירות את מעיל הבאפי מבלי להפריע לשכבות הנותרות והעבירו את התמיסה לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר.

להכנת ממרחי תאים מטפאזיים, הוסף 10 מיליליטר PBS לצינור המכיל את מעיל האפי. ואז צנטריפוגה את הצינור ב -400 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו בזהירות את ה-supernatant והקישו בעדינות על הצינור כדי לפרק את כדורית התא.

לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר PBS וצנטריפוגה שוב את המתלה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורית התא. שברו את הגלולה והוסיפו טיפה אחר טיפה ארבעה מיליליטר של תמיסת אשלגן כלורי היפוטונית, 0.075 מולרית מחוממת מראש, עם ניעור עדין ומתמיד.

דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמבט מים. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של קיבוע לצינור וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור. צנטריפוגה את הצינור, והסר את הסופרנטנט.

לאחר מכן, מפרקים את כדור התא ומוסיפים קיבוע טרי. חזור על הסיבוב והוספת הקיבוע חמש פעמים נוספות. לאחר השעיית התאים ב-400 עד 600 מיקרוליטר של קיבוע, זרוק 30 מיקרוליטר של תאים קבועים על מגלשות נקיות ורטובות המוטות בזווית של 45 מעלות ואפשר לשקופיות להתייבש לחלוטין באוויר למשך הלילה.

כדי לבצע צביעת כרומוזום עכבר על ידי mFISH הנח את השקופית המכילה את תאי המטאפאזה מתפשטים ב-2X SSC למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יבש את השקופית על ידי שטיפת אתנול סדרתית ב-70%80% ו-100% אתנול למשך שתי דקות בכל כביסה. מחממים מראש 40 מיליליטר תמיסת דנטורציה בצנצנת קופלין זכוכית ל 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן העבירו את השקופית לתמיסה שחוממה מראש ודגרו את הדגימה למשך דקה עד דקה וחצי כדי לפרק את הכרומוזומים. השתמש מיד באתנול 70% קר כקרח כדי להרוות את השקופית למשך שתי דקות כדי לעצור את תהליך הדנטורציה ולמנוע חישול מחדש של כרומוזומים דנטורציה. לאחר מכן יבש את המגלשה באמצעות סדרת אתנול המתחילה ב-80% אתנול למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הנח את השקופית ב-100% אתנול למשך שתי דקות. ואז יבש לחלוטין את השקופית בטמפרטורת החדר. כדי לנטרל את הגשושית, צנטריפוגה קצרה את תערובת הבדיקה המסופקת על ידי היצרן, ולאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר ודגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות.

כעת הנח את הצינור המכיל את הגשושית המפורקת לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן מרחו את תערובת הבדיקה על שקופית עם כרומוזומים מפוקפקים. כסה בזהירות את האזור עם כיסוי זכוכית בגודל 18 מילימטר על 18 מילימטר והסר כל בועות אוויר גלויות על ידי לחיצה עדינה מאוד על הכיסוי למגלשה.

השתמש במלט גומי כדי לאטום את כל ארבעת הצדדים של הכיסוי. ודגרו את המגלשה בחושך בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר ההכלאה, הסר בזהירות את מלט הגומי ואת הכיסוי והנח את המגלשה ב-0.4X SSC מחומם מראש ב-74 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן העבירו את השקופית לתמיסת כביסה שלוש למשך שתי דקות. הוסף 20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה עם כתם נגד DAPI על השקופית וכסה אותו בכיסוי זכוכית. השתמש בנייר טישו מעבדה כדי ללחוץ בעדינות על הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר ותמיסת הרכבה עודפת.

לאחר מכן השתמש בלק כדי לאטום את שולי הכיסוי. צפו בשקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט המצויד במסננים המתאימים. עבור קריוטיפ ספקטרלי של כרומוזומי עכבר, לאחר הכלאת הבדיקות על הכרומוזומים המפורקים והדגימות נשטפות על פי פרוטוקול הטקסט, יש למרוח 80 מיקרוליטר של מגיב צביעה SY5 על השקופית.

הניחו כיסוי פלסטיק בגודל 24 על 60 מילימטר על גבי הדגימה, ודגרו אותה בחושך בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. טובלים את השקופית בצנצנת קופלין מזכוכית המכילה תמיסת כביסה מחוממת מראש שלוש ודוגרים אותה באמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שתי דקות. חזור על הכביסה שלוש פעמים.

מרחו 80 מיקרוליטר של מגיב מכתים SY5.5 על הדגימה, כסו אותה בכיסוי פלסטיק בגודל 24 על 60 מילימטר, ודגרו אותה בחושך בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. השתמש בתמיסת כביסה מחוממת מראש שלוש כדי לשטוף את השקופית שלוש פעמים ולאחר מכן החזק את השקופית במצב מוטה כנגד מגבת נייר כדי לנקז את עודפי הנוזלים. הוסף לדגימה 20 מיקרוליטר של מגיב DAPI נגד דהייה והנח בזהירות כיסוי זכוכית מעל מבלי להכניס בועות אוויר.

השתמש בלק כדי לאטום את הקצוות וצפה בדגימה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד לצילום תמונות שמיים. איור זה מציג התפשטות מייצגת של תאי מטאפאזה עם זוגות כרומוזומי עכבר רגילים וחריגים אחד, שניים ושלושה. הנה סטייה יציבה המערבת כרומוזום אחד שבו חלק מכרומוזום אחד שולב בכרומוזום DAPI לא צבוע בעוד שחלק אחר יצר שבר א-צנטרי.

בדוגמה זו, חלק מכרומוזום 2 שולב בכרומוזום שאינו צבוע. סטייה יציבה זו מערבת כרומוזום שלוש. סטיות יציבות הכוללות את כל שלושת הכרומוזומים הצבועים נראות בהתפשטות מטפאזה זו.

מוצגת כאן דוגמה לקריוטיפ ספקטרו של עכבר נקבה רגיל. פאנל זה מייצג סטייה יציבה המערבת את כרומוזומי 4 ו-12. לבסוף, הסטייה הכרומוזומלית היציבה בפאנל זה כוללת כרומוזום 7 ו-10.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 עד 72 שעות אם היא נעשית כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיש להשתמש רק בתאים מתרבים. ניתן להשתמש בהליך זה ובשיטות אחרות כמו בפס כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם קיימות סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאים המוקרנים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הציטוגנטיקה המולקולרית לחקור את הקשר בין סטיות גנטיות למחלות השונות. לאחר צפייה בסרטון זה אמור להיות לך מושג ברור יותר כיצד לקבוע סטיות יציבות בין-כרומוזומליות. אל תשכח שעבודה עם קולכיצין יכולה להיות מסוכנת ביותר מכיוון שהיא מסרטנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות בעת ביצוע ניסוי זה.