איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה

המטרה הכללית של שיטה ציטוגנטית מולקולרית זו היא לתצפת על אבקוטיות (aberrations) יציבות בין-כרומזומליות בתאי מחית השגג של עכברים שנחשפו להקרנה של כל הגוף. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקרינה, כגון הסיכון להשראת אבקוטיות כרומזומליות יציבות בתאי מחית השגג של עכברים שנחשפו לקרינה של כל הגוף. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה מודרכת של נזקים גנטיים יציבים המושרים על ידי קרינה בתאי מחית השגג של עכברים, אשר יכולים לעבור דרך דורות תאים רבים.

לאחר בידוד מחית גרם מעצמות הפמר והטיביה של עכבר והכנת תרחיף תאים בודדים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו בזהירות את תרחיף התאים מעל נפח שווה של מדיום להפרדת תאי מונונוקליים ממחית גרם. סובבו את המדרג בסנטריפוגה ב-400 times G בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, אספו בזהירות את שכבת ה-buffy coat מבלי להפר את השכבות הנותרות, והעבירו את התמיסה לשפופרת סנטריפוגה חדשה בנפח של 15 מיליליטר.

להכנת פריסות תאים בשלב המטאפאזה, הוסיפו 10 milliliters של PBS לשפופרה המכילה את שכבת ה-buffy coat. לאחר מכן, סובבו את השפופרה בצנטריפוגה ב-400 times G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו בזהירות את העילוי והקישו בעדינות על השפופרה כדי לפרק את משק תאי השקיעה.

לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של PBS וסובבו שוב את התוךיה בצנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע התאים. פתתו את המשקע והוסיפו טיפה אחר טיפה 4 milliliters של תמיסת potassium chloride היפוטונית בריכוז 0.075 molar שחוממה מראש, תוך써 ניעור עדין ומתמיד.

דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות במקלחים. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה נפח שווה של מקבע וערבבו בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. סנטריפיגו את המבחנה והסירו את העילאי.

לאחר מכן, פריסו את משקע התאים והוסיפו מקבע טרי. חזרו על תהליך הצנטריפוגה והוספת המקבע חמש פעמים נוספות. לאחר השהיית התאים ב-400 עד 600 µL של מקבע, טפטפו 30 µL של תאים מקובעים על גשריות רטובות ונקיות המוטות בזווית של 45 מעלות, והניחו לגשריות להתייבש לחלוטין באוויר במהלך הלילה.

כדי לבצע צביעת כרומוזומים של עכבר בשיטת mFISH, יש להניח את השקופית המכילה את פריסות תאי המטפאזה ב-2X SSC למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לייבש את השקופית באמצעות שטיפות אתנול רצופות ב-70% 80% ו-100% אתנול למשך שתי דקות בכל שטיפה. יש לחמם מראש 40 milliliters של תמיסת דנטורציה בבקתית קופלין מזכוכית ל-70 degrees Celsius למשך 30 דקות.

לאחר מכן, העבירו את השקופית לתוך התמיסה שחוממה מראש והדגירו את הדגימה למשך דקה אחת עד דקה וחצי כדי לדנטורציה של הכרומוזומים. השתמשו מיד ב-70% ethanol קר מאוד כדי למסך (quench) את השקופית למשך שתי דקות, במטרה לעצור את תהליך הדנטורציה ולמנוע מהכרומוזומים שעברו דנטורציה להתחבר מחדש (reannealing). לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לשקופית באמצעות סדרת אתנול, החל מ-80% ethanol למשך שתי דקות.

בשלב הבא, הניחו את השקף ב-100% ethanol למשך שתי דקות. לאחר מכן, ייבשו את השקף לחלוטין בטמפרטורת החדר. כדי לדנטור את הגשוש (probe), סבבו קצרות במערבל צנטריפוגתי את תערובת הגשוש שסופקה על ידי היצרן, העבירו 10 µL לשפופרת צנטריפוגה עם מכסה סנאפ (snap cap) בנפח 500 µL והדגירו את השפופרת במקלח מים בטמפרטורה של 80 °C למשך שבע דקות.

כעת העבירו את המבחנה המכילה את הגשש (probe) שעבר דנטורציה למבחנה במכחול מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר מכן, מרחו את תערובת הגשש על שקופית עם כרומוזומים שעברו דנטורציה. כסו בזהירות את האזור בעזרת כיסוי זכוכית בגודל 18 millimeter על 18 millimeter והסירו כל בועות אוויר נראות על ידי לחיצה עדינה מאוד של כיסוי הזכוכית אל השקופית.

השתמשו בדבק גומי כדי לאטום את כל ארבעת צדי הזכוכית המכסה. דגרו את השקופית בחושך בתא לחות בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 16 שעות. לאחר ההיברידיזציה, הסירו בזהירות את דבק הגומי ואת הזכוכית המכסה והניחו את השקופית ב-0.4X SSC שחומם מראש ל-74 °C למשך חמש דקות.

לאחר מכן, העבירו את השקופית לתמיסת שטיפה שלוש למשך שתי דקות. הוסיפו לשקופית 20 µL של תמיסת קיבוע antifade עם צביעת נגד DAPI וכסו אותה עם כיסוי זכוכית. השתמשו בנייר סופג למעבדה כדי ללחוץ בעדינות על כיסוי הזכוכית להוצאת בועות אוויר ועודפי תמיסת הקיבוע.

לאחר מכן, השתמשו בלק גוף כדי לאטום את קצוות הזזית. בחנו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במסננים המתאימים. עבור קריוטייפינג ספקטרלי של כרומוזומי עכבר, לאחר שהגששים עברו היברידיזציה על הכרומוזומים שדנטורו והדגימות נשטפו בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מרחו 80 µL של ריאגנט צביעה SY5 על השקופית.

הנח כיסוי זכוכית פלסטיק בגודל 24 על 60 מילימטר מעל הדגימה, והדגר אותה בחושך בתא לח בחום של 37 degrees Celsius למשך 40 דקות. טבול את הפלטה בתוך צנצנת קופלין מזכוכית המכילה תמיסת שטיפה 3 שחוממה מראש, והדגר אותה במקלחת במעלה של 45 degrees Celsius עם ניעור למשך שתי דקות. חזור על השטיפה שלוש פעמים.

יש להוסיף 80 µL של ריאגנט הצביעה SY5.5 לדגימה, לכסותה בכיסוי פלסטיק בגודל 24 על 60 mm, ולהדגיר בחשכה בתוך תא לח בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 דקות. יש להשתמש בתמיסת שטיפה 3 שחוממה מראש כדי לשטוף את הפסלול שלוש פעמים, ולאחר מכן להחזיק את הפסלול במצב נטוי כנגד נייר סופג כדי לנקז את עודפי הנוזל. יש להוסיף 20 µL של ריאגנט antifade DAPI לדגימה ולהניח בזהירות כיסוי זכוכית מעל, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות אוויר.

השתמשו בלק לציפורניים כדי לאטום את הקצוות והבחינו בדגימה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלורסצנציה המצויד לצילום תמונות של השמיים. איור זה מציג פריסות תאים מייצגות בשלב המטאפאזה עם זוגות כרומוזומים של עכבר נורמליים וסרוגים אחד, שתיים ושלוש. כאן מוצגת Aberration יציבה המערבת את כרומוזום אחד, שבה חלק מכרומוזום אחד שולב בתוך כרומוזום DAPI שאינו צבוע, בעוד שחלק אחר יצר פרגמנט א-צנטרי.

בדוגמה זו, חלק מכרומוזומ 2 הוטמע בתוך כרומוזום שאינו צבוע. אבטרה יציבה זו כוללת את כרומוזומ 3. אבטרות יציבות המערבות את כל שלושת הכרומוזומים הצבועים נראות בפיזור מטאפאזה זה.

כאן מוצגת דוגמה לספקטרו-קריוטיפינג (spectro karyotyping) של עכברה נקבה רגילה. פאנל זה מייצג סטייה יציבה המערבת את כרומוזומים 4 ו-12. לבסוף, הסטייה הכרומוזומלית היציבה בפאנל זה מערבת את כרומוזומים 7 ו-10.

במידה ושולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך 48 עד 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שיש להשתמש רק בתאים במצב של התחלקות (proliferating cells). ביצוע הליך זה ושימוש בשיטות אחרות, כגון in band, יכולים לסייע במתן מענה לשאלות נוספות, כמו למשל האם קיימות סטייה כרומוזומלית יציבה בין-כרומוזומלית (inter-chromosomal stable aberrations) בתאים שהוקרנו.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הציטוגנטיקה המולקולרית לבחון את הקשר בין סטיות גנטיות למחלות השונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה יותר כיצד לקבוע סטיות יציבות בין-כרומוזומליות. זכרו כי עבודה עם colchicine עלולה להיות מסוכנת ביותר מכיוון שהוא קרצינוגן, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת ביצוע ניסוי זה.