הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעה של נוקדאון ACF אחד או SNF שני H על מוות תאים מושרה E ארבע או ארבעה. זה מושג על ידי יצירת קווי תאים שבהם ביטוי ACF אחד או SNF שני H srna מופעל על תנאי על ידי הוספת דוקסיציקלין וכתוצאה מכך רמות מופחתות של חלבון ACF אחד או SNF שני H כשלב שני. תאים של קווי התאים שהתקבלו מטופלים בדוקסיציקלין כדי להפחית את ביטוי ACF אחד או SNF שני H או נותרים ללא טיפול.

לאחר מכן, E ארבע או ארבע מתבטא בתאים עם או בלי ACF עמיד ל-S-H-R-N-A אחד או SNF שניים H.In סדר כדי לחקור את ההשפעה של ACF אחד או SNF, שני H על E, מתקבלות ארבע או ארבע תוצאות מוות תאי מושרה המראות את ההשפעה של רמות ACF 1 או SNF, 2 H על רעילות E, ארבע או ארבע בהתבסס על ספירת נוקלאו עם מורפולוגיה אפופטוטית באמצעות מבחן HY. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כגון טרנספקציה חולפת של RNAs, הוא שכל התאים מבטאים את ה- S-H-R-N-A ואחוז התאים המבטאים יחד עם פלסמיד מסורתי גבוה יותר. שיטה זו מספקת תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס אם 4 0 4 גרם למוות תאי, אך ניתן ליישם אותה גם לחקר חלבונים פרוטיים אחרים.

בנוסף לאנה לאף, חוקרת מהמעבדה שלי תדגים חלקים מהליך זה כדי להתחיל בהליך ליצירת קווי תאים הניתנים להשראה, צלחת T-Rex 2 9 3 תאים בצפיפות של כחמישה פעמים 10 לששת התאים לצלחת של 10 סנטימטר בשמונה מיליליטר DMEM המכילים סרום ללא טטרציקלין ועם חמישה מיקרוגרם מיליליטר של פיצוץ בצד בדגירה על הלוחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ביום שלמחרת. החלף את המדיום בשמונה מיליליטר של מדיום טרי לפני הטרנספקציה. הפלסמיד לטרנספקציה הוא הפלסמיד P superior neo plus GFP בקידוד ACF אחד או SNF שני H-S-H-R-N-A, מונע על ידי מקדם H אחד המושרה בטטרציקלין, כמו גם גן העמידות לניאומיצין התיך את ה-GFP ומונע על ידי מקדם PGK מכונן.

הוסף 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ל-500 מיקרוליטר של נתרן כלורי 150 מילי-מולרי ומערבולת. לאחר מכן הוסף את מגיב הסילון PY בשני מיקרוליטר למיקרוגרם DNA לצינור אחר עם 500 מיקרוליטר של נתרן כלורי 150 מילימולר ומערבולת. מוסיפים את תמיסת הסילון פאי ל-DNA ומערבבים היטב על ידי מערבולת.

דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, פיפטה בעדינות את קומפלקסי ה-DNA על צלחות של 10 סנטימטר המכילות מפגש של 70 עד 80%. טי-רקס 2 9 3 תאים תערובת למחרת.

החלף את המדיום במדיום סלקטיבי בדוגמה זו DMEM כמו קודם, המכיל 500 מיקרוגרם למיליליטר של G ארבע 18. במשך השבועיים הקרובים, עקוב אחר התאים. החלף את המדיום הסלקטיבי במדיום טרי דומה כל שלושה עד ארבעה ימים עד להופעת מושבות.

זהו מושבות לפי העין וסמנו את מיקומן בתחתית הצלחת באמצעות טוש צבעוני. ודא במיקרוסקופ שהמושבות מופרדות היטב. ניתן לבודד מושבות ברגע שהן גדולות מספיק כדי שניתן יהיה לדמיין אותן ללא מיקרוסקופ.

להצלחת הליך זה, חשוב לבחור מושבות מופרדות היטב במהלך בידוד המושבה. במכסה מנוע סטרילי, שאפו את המדיום מהצלחת. שוטפים בעדינות עם PBS ושואבים היטב את כל הנוזלים שנותרו.

הוסף שלושה מיקרוליטרים של 0.25% נסיעות ב-EDTA למושבה אחת בצלחת על ידי ליטוף הנסיעות שוב ושוב עד שהתאים מתנתקים מהצלחת. העבירו את התאים למדיום סלקטיבי בבאר בצלחת 24 בארות. חזור על כך עבור מספר מושבות אחרות בצלחת.

מגדלים את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני עד שהם ממלאים את הבאר. לאחר מכן מחלקים את התאים מכל מושבה מקורית לשלוש בארות כל אחת בצלחת נפרדת של 12 בארות ודוגרים למשך הלילה למחרת. החלף את המדיום בצלחת אחת במדיום המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר דוקסיציקלין מתמיסת מלאי שהוכנה במים מזוקקים כפולים.

החלף את המדיום בלוחית בקרה במדיום ללא דוקסיציקלין. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 72 שעות. תאים מבאר אחת שטופלה ואחת לא מטופלת נקצרים לאחר מכן לניתוח כתמים מערביים כדי לקבוע את היעילות של ACF אחד או SNF שני H שהופלו תוצאה מייצגת מוצגת כאן.

כתם זה היה מוכתם בנוגדנים ל-SNF 2 H ואלפא טובולין. האחרון משמש כבקרת העמסה שניים מהשיבוטים. מספר ארבע ומספר חמש הראו ירידה חזקה ב-SNF two H עם אינדוקציה של דוקסיציקלין ולכן נבחרו לשימוש בניסוי הנוקדאון, שיודגם בקטע הבא.

התאים הלא מטופלים בצלחת השלישית ישמשו להרחבת קו התאים שנבחר ולאחר מכן יוקפאו כמויות של תאים אלה. לשימוש נוסף כדי לגרום להפלה של תאי צלחת ACF אחד או SNF שני H בתווך סלקטיבי בלוחות של 10 סנטימטרים, הוסף דוקסיציקלין במיקרוגרם אחד למיליליטר למחצית הצלחות ודגר 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות. כל קבוצת צלחות חייבת לספק את התאים ל-12 לוחות של שישה סנטימטרים, כולל שני כפילויות לבדיקת DPI עבור כל נקודה, כמו גם צלחת אחת לניתוח כתם מערבי של כל דגימה.

48 עד 72 שעות לאחר האינדוקציה טריפסין אף את התאים מכל קבוצת תאים ולאחר ספירתם צלחת 1.5 פעמים 10 לששת התאים ללוח שישה סנטימטר באותו מדיום עם או בלי דוקסיציקלין. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה למחרת, העבירו את התאים. כפי שצוין.

גם התאים הלא מטופלים וגם התאים שטופלו בדוקסיציקלין עוברים טרנספטציה משולשת בארבע דרכים. אחד עם פלסמיד ריק ופלסמיד המבטא GFP שניים עם הפלסמיד הריק כמו גם וקטור המבטא ACF עמיד SHRA אחד GFP או SNF שני HGFP שלושה עם פלסמיד המקודד E ארבע או ארבע ופלסמיד המבטא GFP ועם הפלסמיד המקודד E ארבע, כל הארבעה. והוקטור המבטא ACF עמיד ל-SHRA GFP אחד או SNF שני HGFP לאחר טרנספקציה דוגר על כל הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בן לילה.

ביום שלאחר טרנספקציה של תאים מחלצים חלבונים מצלחת אחת לכל דגימה לניתוח כתמים מערביים כדי לקבוע ש-ACF אחד או SNF שני H הופל ביעילות וכי E ארבע או ארבע התבטא באופן שווה בדגימות השונות. 16 הלוחות הנותרים ישמשו לבדיקת DPI. שאפו את המדיום מהצלחות המיועדות לבדיקת DPI ושטפו את התאים בעדינות עם PBS במכסה מנוע כימי.

הוסף מיליליטר אחד של 4%para פורמלדהיד שהוכן ב-PBS כדי לכסות את התאים בדגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד. שאפו את הפרה-פורמלדהיד ושטפו עם PBS תוך ניעור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. חזור על הכביסה פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות לאחר שטיפת ה-PBS השלישית ב-80% אתנול נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס ודגירה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

שאפו את האתנול ושטפו את התאים פעמיים עם PBS, ניעור בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, בכל פעם לאחר מכן שטיפה פעם אחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם PBS המכיל 0.5% BSA ו-0.05% בין 20 או P-B-S-B-T. כמו כן עם ניעור למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים. יש לחסום את התאים במיליליטר אחד של מאגר P-B-S-B-T המכיל 10% סרום עיזים למשך 20 דקות תוך כדי ניעור בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים ב-P-B-S-B-T חמש דקות כל שטיפה. דגרו על התאים עם הנוגדן הראשוני, נוגדן ספציפי E 4 או 4 במקרה זה במיליליטר אחד של P-B-S-B-T למשך שעה תוך כדי ניעור טמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו פעמיים ב-P-B-S-B-T ופעם אחת ב-PBS המכיל 0.1% BSA חמש דקות כל כביסה.

לאחר מכן, הוסף לתאים מיליליטר אחד של PBS 0.1% BSA המכיל את הנוגדן המשני המתאים המסומן פלואורסצנטי ו-0.5 מיקרוגרם למיליליטר. ריכוז סופי של DPI דגירה למשך 40 דקות תוך כדי טלטול בטמפרטורת החדר בחושך. לבסוף, שטפו עם PBS למשך חמש דקות.

יבש את הבאר על ידי שאיפה ושמור את הצלחות הפוכות למשך שעה נוספת עד לילה כדי להשיג ייבוש מלא ולכסות בהחלקות כיסוי נייר אלומיניום על התאים באמצעות תמיסת פלורה Mount G. שמור את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד שהן מוכנות לספירה. תאי הגרעינים האפופטוטיים שעברו את הטיפולים השונים המתוארים בפרוטוקול קובעו ונצבעו ב-E ארבעה או ארבעה נוגדנים ספציפיים ו-DPI כדי לדמיין את גרעיני התאים שעברו טרנספטקט.

איור זה מציג דוגמה לתאים המבטאים E ארבע או ארבע ופאנל GFP A מציג ביטוי חלבון GFP בקרה בלבד, ופאנל B מראה E ארבעה או ארבעה ביטוי גרעיני כתמי DAPI מוצגים בפאנל C והתמונות הממוזגות מוצגות בפאנל D. סימן החצים הלבנים, GFP ו- E.ארבעה או ארבעה תאים שעברו טרנספטציה המכילים גרעינים עם מורפולוגיה אפופטוטית. חיצים אדומים מסמנים גרעינים בעלי צורות לא סדירות שאינן נספרות כגרעינים אפופטוטיים, מסמנים כוכבית, גרעינים מיטוטיים או גרעינים שרק חילקו את מספר הגרעינים המעובים או המקוטעים המוצגים על ידי DAPI. צביעה נספרה כדי לחשב את אחוז הגרעינים עם מורפולוגיה אפופטוטית בתוך אוכלוסיית התאים המועברים כדי לשמור על אובייקטיביות אופטימלית של הבדיקה.

ספירת הגרעין האפופטוטי בדגימות השונות בוצעה בצורה עיוורת כאשר האדם הסופר לא היה מודע לזהות הדגימה תוצאה מייצגת מוצגת בגרף זה. אחוזים גבוהים יותר של חריגות גרעיניות נצפו ב-E, ארבעה או ארבעה תאים מבטאים המאשרים את ה-T, ארבע או ארבע גורם למוות של תאים. האחוז הגבוה ביותר של חריגות גרעיניות נצפה ב-E, ארבעה או ארבעה תאים מבטאים שבהם רמות ACF 1 הופחתו על ידי SHR ונוק-דאון מתווך המצביע על כך ש-ACF אחד משפר את E ארבעה או ארבעה תאי אינגה מוות מוגבר של E ארבע או ארבע רעילות בתאים.

ביטוי רמות נמוכות של ACF 1 לא נבע מעלייה ברמות E ארבע או ארבע כפי שניתן לראות בכתם המערבי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקל על ספירה מייעצת של סטנט הגרעין האפופטוטי עם DPI ולהחיל קריטריונים מחמירים לזיהוי גרעין זה. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מבחני שיבוט כדי לאמת את תוצאות ה-DA pse בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות קו-אימונו-משקעים על מנת לענות על שאלות נוספות. למשל, האם יש אינטראקציה פיזית בין החלבונים שנחקרו.