כלי עריכת בסיס בתיווך קריספר: טכניקת עריכת גנום לזירוז החלפת בסיס ממוקדת

לעריכת גנום בתיווך CRISPR, התחל עם תרבית HAP1-BE3, קו תאים הפלואיד עם גן BE משולב המקודד אנזים עורך בסיס. לתרבית זו, הוסף וקטורים לנטי-ויראליים המכילים פלסמיד CRISPR-Cas9 המיועד למטרה ספציפית כגון גן סרטן השד האנושי, BRCA1.

חלקיק ה-lentivirus מתמזג עם קרום התא המארח, ומשחרר את הפלסמיד, שבסופו של דבר משתלב בגנום התא המארח ליצירת מקטעי הגן CRISPR-Cas9-BE. גנים אלה מייצרים gRNA מכוון BRCA1, אנדונוקלאז Cas9 ו-BE-cytidine deaminase.

ה-gRNA המכוון ל-BRCA1 הוא RNA המתמזג עם Cas9 ומכוון את הקומפלקס למיקום הגן BRCA1. ליד גן זה, לוקוס הוא מוטיב סמוך לפרוטוספייסר, או PAM, שבו BE יכול לעגון ביציבות ולנוע במעלה הזרם כדי להגיע לאזור הקטליטי הפעיל שלו. כאן, ה-BE מזהה בסיס ציטידין וממיר אותו לאורידין.

מוטציה זו של החלפת בסיס מפעילה את נוקלאז Cas9 לחתוך את גדיל ה-DNA הלא שונה. שבירת גדיל DNA מפעילה אנזימי תיקון הממלאים את הבסיס החסר וממירים אורציל, בסיס שאינו DNA, לתימין. בסך הכל, תהליכים אלה יוצרים וריאנט גנים.

כעת, דגרו על התאים בתנאים פיזיולוגיים ותת-תרבות כדי להכפיל את וריאנט הגן. חלץ DNA גנומי ורצף אותו כדי לנתח את יעילות עריכת הבסיס בתיווך CRISPR.

זרע 5 x 10⁵ תאי HAP1-BE3 לבאר בצלחות של 24 בארות יום אחד לפני הטרנספקציה, ותרבית אותם כדי להגיע למפגש של 70% עד 80% לטרנספקציה. Transfect BRCA1-targeting RNA מנחה באמצעות ריאגנטים לרכישה, על פי פרוטוקול היצרן. השתמש במיקרוגרם אחד של RNA מדריך מיקוד BRCA1 כדי לגרום להמרת CG ל-TA באתרי יעד BRCA1. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ותת-תרבית כל 3 עד 4 ימים. קצור את כדורי התא 3, 10 ו-24 ימים לאחר הטרנספקציה כדי לנתח את יעילות עריכת הבסיס. חלץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור ה-DNA הגנומי.