Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis: שיטה לניתוח אינטראקציות דגימה-ליגנד בהתאם לנדידה דיפרנציאלית של קומפלקסים חלבוניים-ליגנדים

ליגנדים, כגון יוני מתכת, נקשרים באופן לא קוולנטי לחלבון ספציפי, ויוצרים קומפלקס יונים של חלבון-מתכת. קשירה זו משנה את המטען הכולל של החלבון, מה שמאפשר לאפיין את הקומפלקסים הללו באמצעות אלקטרופורזה נימית של זיקה.

כדי להתחיל, קח נימי זכוכית דקים וממוזגים מראש עם קבוצות סילנול טעונות על המשטח הפנימי. שוטפים את הנימים בתמיסת EDTA. EDTA הוא חומר כלאט המסיר כל זיהומי יוני מתכת. כעת, הזריק הידרודינמית את תמיסת הדגימה המכילה את החלבון הרצוי לנימים מהקצה החיובי או האנודה שלו.

הפעל מתח גבוה כדי ליצור זרימה אלקטרו-אוסמוטית, מה שמאלץ את החלבונים בקונפורמציה המקורית שלהם עם מטענים טבועים לנוע בתוך הנימים לכיוון הקתודה. רשום את דפוס הנדידה של חלבונים לא קשורים מהנימים.

לאחר מכן, הכניסו תמיסת ליגנד ספציפית לנימים יחד עם דגימות החלבון, והפעילו את אותו מתח. בתוך הנימים, מולקולות הליגנד נקשרות באופן לא קוולנטי לחלבון המטרה, ויוצרות קומפלקסים.

זה גורם לשינוי קונפורמציה בחלבונים, מה שמוביל לשינוי במטענים הטבועים בהם ומשפיע על יחס המטען לגודל. שינויים אלה מווסתים את האינטראקציות שלהם עם המשטח הטעון של הנימים, וגורמים להם לזרום בצורה שונה בהשוואה לחלבון הלא קשור.

רשום את השינויים הללו בניידות האלקטרופורטית, התואמים את חוזק האינטראקציה בין החלבון לליגנד.

לאחר הכנת השיטה למדידות ללא ליגנדים, הכינו את השיטה למדידות עם ליגנדים, על ידי שימוש תחילה בתמיסת EDTA מולרית של 0.1 לשטיפת הנימים ב-2.5 בר למשך דקה. לאחר מכן, השתמש במים נטולי יונים כדי לשטוף את הנימים. לאחר מכן, אזנו את הנימים באמצעות תמיסת ליגנד כדי לשטוף אותו ב-2.5 בר למשך 1.5 דקות.

לאחר מכן, הזרקו את תמיסת האצטניליד ב-0.05 בר למשך 6 שניות, והחליפו את בקבוקוני הכניסה והיציאה לבקבוקוני החיץ המכילים ליגנד. יש למרוח 0.05 בר למשך 2.4 שניות, על מנת לדחוף את תמיסת האצטניליד פנימה מקצה הנימים. הפעל 10.0 קילו-וולט למשך 6 דקות, וגלה את שיא האצטניליד באורך גל של 200 ננומטר.

לאחר שטיפת הנימים עם EDTA, מים נטולי יונים ותמיסת הליגנד כמו קודם, הזרקו את דגימת החלבון, והחליפו את בקבוקוני הכניסה והיציאה לבקבוקוני חיץ טריים המכילים ליגנד. בסופו של דבר, חזור על ביצוע מדידות עם ובלי ליגנדים.