Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis: שיטה לניתוח אינטראקציות דגימה-ליגנד בהתאם לנדידה דיפרנציאלית של קומפלקסים חלבוניים-ליגנדים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:23 דק׳ • July 8th, 2025
ליגנדים, כגון יוני מתכת, נקשרים באופן לא קוולנטי לחלבון ספציפי, ויוצרים קומפלקס יונים של חלבון-מתכת. קשירה זו משנה את המטען הכולל של החלבון, מה שמאפשר לאפיין את הקומפלקסים הללו באמצעות אלקטרופורזה נימית של זיקה.
כדי להתחיל, קח נימי זכוכית דקים וממוזגים מראש עם קבוצות סילנול טעונות על המשטח הפנימי. שוטפים את הנימים בתמיסת EDTA. EDTA הוא חומר כלאט המסיר כל זיהומי יוני מתכת. כעת, הזריק הידרודינמית את תמיסת הדגימה המכילה את החלבון הרצוי לנימים מהקצה החיובי או האנודה שלו.
הפעל מתח גבוה כדי ליצור זרימה אלקטרו-אוסמוטית, מה שמאלץ את החלבונים בקונפורמציה המקורית שלהם עם מטענים טבועים לנוע בתוך הנימים לכיוון הקתודה. רשום את דפוס הנדידה של חלבונים לא קשורים מהנימים.
לאחר מכן, הכניסו תמיסת ליגנד ספציפית לנימים יחד עם דגימות החלבון, והפעילו את אותו מתח. בתוך הנימים, מולקולות הליגנד נקשרות באופן לא קוולנטי לחלבון המטרה, ויוצרות קומפלקסים.
זה גורם לשינוי קונפורמציה בחלבונים, מה שמוביל לשינוי במטענים הטבועים בהם ומשפיע על יחס המטען לגודל. שינויים אלה מווסתים את האינטראקציות שלהם עם המשטח הטעון של הנימים, וגורמים להם לזרום בצורה שונה בהשוואה לחלבון הלא קשור.
רשום את השינויים הללו בניידות האלקטרופורטית, התואמים את חוזק האינטראקציה בין החלבון לליגנד.
לאחר הכנת השיטה למדידות ללא ליגנדים, הכינו את השיט
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים