הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

המטרה הכוללת של אסטרטגיה ניסויית זו היא לחקור את הפונקציונליות של וריאנטים לא מקודדים הקשורים למחלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בגנומיקה, כגון כיצד וריאנטים גנטיים שאינם משנים למעשה את רצף חומצות האמינו, עדיין תורמים לפנוטיפ המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תהליך יעיל להערכת שונות גנטית לפעילות התפקוד ונותנת תובנה לגבי חלבונים רגולטוריים ומסלולים מושפעים.

טכניקה זו יכולה להועיל לחקר כל מחלה עם וריאנט סיבתי מועמד. מכיוון שההליך לניתוח וריאנטים אלה הוא אוניברסלי ללא קשר לפנוטיפ הנחקר. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלות אנושיות, ניתן ליישם אותה גם על מוטציות בכל אורגניזם.

ליזטים גרעיניים יוכנו מתאי B-לימפובלסטואידים בניסוי זה, אולם ניתן ליישם הליך זה על רוב קווי התאים. לאחר ספירת תאים באמצעות המוציטומטר, סובב את מספר התאים הרצוי לליסינג. שאפו את המדיה, הוסיפו 10 מיליליטר PBS קר כקרח וסובבו שוב את התאים.

שטפו את התאים בפעם השנייה עם PBS, והסירו את ה- PBS לאחר הסיבוב. השעו מחדש את חיך התא ב-PBS קר כקרח באמצעות מיליליטר אחד של PBS לכל 10 עד התאים השביעי. יש ליטר אחד של תרחיף התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, כך שכל צינור מכיל 10 עד התאים השביעיים ב-PBS.

צנטריפוגה למשך שתי דקות ולשאוף מה-PBS. הוסף למלאי עבודה של מאגר CE, דיתיותרייטול מילי-מולרי אחד, או DTT, מעכב פוספטאז 1X ו-0.5 מילי-מולרי פניל-מתאן-סולפוניל פלואוריד, או PMSF. השעו מחדש כל פלטת תאים עם 400 מיקרוליטר של מאגר זה, ודגרו על קרח למשך 15 דקות.

הוסף 25 מיקרוליטר של 10% Nonidet P-40 לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, וערבב על ידי פיפטינג. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ומהירות מרבית למשך שלוש דקות. שפכו והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסף למלאי עבודה של מאגר NE, DTT מילימולרי אחד, מעכב פוספואז 1X ו-PMSF מילימולרי אחד. השעו מחדש כל חיך תא עם 30 מיקרוליטר של מאגר זה, וערבבו על ידי מערבולת. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, במסובב צינור, למשך 10 דקות.

צנטריפוגה למשך שתי דקות. אסוף את הסופרנטנט הצלול, שהוא הליזאט הגרעיני. יש לצרף את הליזאט הגרעיני לפני האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים בהקפאה שעלולים לפגוע בחלבון.

התחל הליך זה על ידי הכנת מלאי עבודה של 50 ננו-מולארי של האוליגונוקלאוטיד, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מניחים את האוליגו בגוש חום בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, כבו את גוש החום והניחו לאוליגו להתקרר לאט לטמפרטורת החדר לפחות שעה לפני השימוש.

לאחר מכן הכן את מבחן הניידות האלקטרופורטית או ג'ל EMSA. הסר את המגלשה מג'ל יצוק מראש, שישה אחוז tris-borate-EDTA, או TBE, ושטוף תחת מים נטולי יונים מספר פעמים כדי להסיר כל חיץ מהבארות. הרכיבו את מנגנון האלקטרופורזה של הג'ל, ובדקו אם יש נזילות על ידי מילוי החדר הפנימי במאגר TBE 0.5X.

אם לא דולף מאגר לתא החיצוני, מלא את החדר החיצוני, בערך, שני שליש מהדרך. הפעל מראש את הג'ל ב -100 וולט למשך 60 דקות. לאחר השלמת ההפעלה המוקדמת, שטוף כל באר עם 200 מיקרוליטר של מאגר TBE 0.5X.

הכן תערובת מאסטר מאגר מחייבת. בצינור מיקרו-צנטריפוגה, מערבבים את הריאגנטים הללו המשותפים לכל התגובות. מאגר קושר פי 10, פוליסורבט DTT, פולי (dI-dC) ו-DNA של זרע סלמון.

כדי להגדיר את תגובות ה-EMSA, הוסף מים נטולי נוקלאז לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה, כך שהנפח הסופי, לאחר הוספת כל הריאגנטים, יהיה 20 מיקרוליטר. הוסף את הכמות המתאימה של תערובת מאסטר לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף שמונה מיקרוגרם של ליזאט גרעיני לצינורות המיקרו-צנטריפוגה המתאימים.

כלול צינורות המכילים את האוליגו, ללא תמצית גרעינית, כבקרות שליליות. הוסף 50 פמטומולות של אוליגו לצינורות המיקרו-צנטריפוגות המתאימים, והחליק לערבב. סובב בקצרה את התוכן לתחתית הצינור.

דוגרים את כל הצינורות, למשך 20 דקות, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של צבע טעינה כתום פי 10 לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה למעלה ולמטה למיקס.

טען את הדגימות לג'ל TBE לפני ההפעלה, שישה אחוזים, על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לערבוב, ולאחר מכן הוצאת כל דגימה לבאר נפרדת. הפעל את הג'ל ב-80 וולט למשך כ-60 עד 75 דקות, עד שהצבע הכתום נדד שני שליש עד שלושה רבעים מהדרך במורד הג'ל. בסיום הריצה, השתמש בסכין ג'ל כדי לפתוח את קלטת הפלסטיק.

הוציאו את הג'ל מהקסטה והניחו אותו בכלי עם מאגר TBE של 0.5 אחוז כדי למנוע ממנו להתייבש. הנח את הג'ל על פני מערכת הדמיה אינפרא אדום וכימלומינסנציה. הסר בועות או מזהמים שישבשו את התמונה.

סרוק את הג'ל באמצעות תוכנת מערכת הסריקה כמתואר בטקסט הפרוטוקול. כדי להתחיל בהליך זה, הכן מלאי עבודה של חמישה אוליגו מיקרו-מולארי כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מניחים את האוליגו בגוש חום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, כבו את גוש החום והניחו לאוליגו להתקרר לאט לטמפרטורת החדר לפני השימוש. מחממים את המאגרים הבאים לטמפרטורת החדר: מאגר כריכה, מאגר כביסה מחמיר נמוך, מאגר כביסה מחמיר ומאגר פליטה. הכן את תערובות הכריכה לכל גרסה.

מערבבים נפח אחד של ליזאט גרעיני עם שני נפחים של מאגר קשירה. הוסף מעכב פוספטאז 1X, PMSF 0.5 מילי-מולרי ומשפר קשירה 1X. הוסף 10 מיקרוליטר של חמישה DNA לכידת ביוטיניל מיקרומולרי לכל תערובת קשירה.

מערבבים על ידי לחיצה על הצינור מספר פעמים. דגרו את תערובות הכריכה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי סטרפטווידין לכל תערובת קשירה.

דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. עבור כל בדיקת אוליגו הנבדקת, הנח עמודת קישור במפריד המגנטי. ודא שהעמודות מסומנות באוליגו הגרסה ששימשה בתערובת הכריכה.

הנח צינור מיקרו-צנטריפוגה ישירות מתחת לכל עמוד כריכה, והחל 100 מיקרוליטר של מאגר מחייב כדי לשטוף את העמוד. פיפטה את התוכן של כל תערובת כריכה לעמודות נפרדות. אפשר לנוזל לזרום לחלוטין דרך העמוד לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה.

מרחו 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה בדרגה נמוכה על העמודה והמתינו עד שמאגר העמודים יתרוקן. מרחו שוב 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה בדרגה נמוכה על העמודה. מרחו 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה בדרגה גבוהה על העמודה, והמתינו עד שמאגר העמודים יתרוקן.

מרחו שוב 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה בדרגה גבוהה על העמודה. הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר פליטה מקורי לעמודה והניח לעמוד חמש דקות. לבסוף הוסף 50 מיקרוליטר נוספים של מאגר פליטה מקורי כדי לחסל את גורמי השעתוק הקשורים.

על מנת לחקור את יכולת השחזור של תוצאות EMSA, ואת ההשלכות של מחזורי הפשרה בהקפאה, נעשה שימוש באוליגו המכילים את ההתייחסות, או אלל שאינו התייחסות של וריאנט גנטי כדי לחקור את אותה תכשיר של תמצית גרעינית של לימפוציטים B לאחר מספר מחזורים של הקפאה והפשרה. החץ הכחול מציין את הגשושית החופשית. קשירה של גורמי השעתוק לאוליגו נראית כרצועה בחצי העליון של הג'ל, המסומנת על ידי החץ האדום.

תוצאות אלה מצביעות על כך שהקפאה והפשרה של התמצית הגרעינית הספציפית הזו עד פי חמישה אינה משפיעה, לכאורה, על שלמות החלבונים. חשוב גם למטב את יחס האות לרעש עבור ה-EMSA. ריכוזים שונים של אוליגוס שימשו לבדיקת תכשיר יחיד של ליזט גרעיני.

נצפתה עלייה בעוצמת הלהקה, עד 100 פמטומולות של אוליגו. תוצאות מייצגות ממחקר של אלל סיכון הקשור לזאבת מוצגות כאן. גורם השעתוק, STAT 1, זוהה לראשונה על ידי DAPA ואחריו ניתוח פרוטאומי.

כתם מערבי של DAPA אישר אז את זהותו של STAT 1, ואת הקישור הגבוה יותר של הצורה הזרחנית של STAT 1 לאוליגו הסיכון לזאבת. בעקבות הליך זה ניתן לבצע טכניקות אחרות, כגון ספקטרומטריית מסה וכתם מערבי. זה יעזור לנו לזהות את החלבון הרגולטורי המראה קשירה תלויה באלל.

מבחני דיווח כמו לוציפראז יכולים לשמש גם כדי לחקור שינויים בביטוי גנים כפונקציה של אלל.