פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו
29 בנובמבר 2016
אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.
המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות אינטראקציות חלבון-DNA באמצעות בדיקות לא רדיואקטיביות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה, כגון קביעת רצף יעד ה-DNA של חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בחלופה קלה, בטוחה וחוסכת זמן לשימוש בבדיקות רדיואקטיביות.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי של חמישה אחוזים המכיל 0.5x tris borate EDTA או TBE, ו-2.5% גליצרול באמצעות מערכת מיני ג'ל חלבון. להכנת 30 מיליליטר תמיסת ג'ל לארבעה ג'לים, מערבבים מים מזוקקים, TBE, אמוניום פרסולפט, TEMED, אקרילאמיד ביס וגליצרול. העבירו מיד את תמיסת הג'ל.
לאחר הפילמור, עטפו את הג'לים בניילון שקוף שהורטב מראש ב-0.5x TBE ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכנן אוליגונוקלאוטיד ארוך לכ-51 מרס. תכנן אוליגונוקלאוטידים קצרים משלימים לכ-14 mers עם שינוי צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום בחמשת הקצוות הראשוניים.
לאחר הכנת האוליגונוקלאוטידים, השעו אותם מחדש במאגר 1x Tris-EDTA לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. לצורך חישול, מערבבים 0.6 מיקרוליטר של חמישה אוליגונוקלאוטיד קצר בצבע פריים, 1.2 מיקרוליטר אוליגונוקלאוטיד ארוך ו-28.2 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי Tris-EDTA בצינור של 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור במים רותחים למשך חמש דקות, ואז מכבים את מקור החום ומאפשרים למים עם האוליגונוקלאוטידים המחוסמים להתקרר למשך הלילה בחושך.
כדי ליצור בדיקות DNA דו-גדיליות, מערבבים 30 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטידים מחוסמים עם DNTPs, מאגר Klenow, תג צבע Klenow חמישה ראשוניים ומים מזוקקים כפול בצינור PCR של 0.2 מיליליטר. דגרו את התערובת למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס במכונת PCR. לאחר מכן, הוסיפו 3.4 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי כדי לעצור את התגובה, ולהשבית את החום ב-75 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במכונת ה-PCR.
לאחר מכן, יש לדלל את הבדיקות הממולאות במאגר נתרן כלורי Tris-EDTA לריכוז סופי של 0.1 מיקרומולר. אחסן את האוליגונוקלאוטידים במינוס 20 מעלות צלזיוס בחושך עד שהם מוכנים לשימוש. להכנת בדיקות ללא תווית, מערבבים 20 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטיד ארוך, 20 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטיד Long R ו-60 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי Tris-EDTA בצינור של 1.5 מיליליטר.
מניחים את הצינור במים רותחים למשך חמש דקות, ואז מכבים את מקור החום ומניחים למים עם האוליגו המחוסמים להתקרר למשך הלילה. הכן מיליליטר אחד של מאגר מחייב פי 5 על ידי ערבוב Tris HCl, נתרן כלורי, אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד, EDTA, DTT, BSA ומים מזוקקים כפולים. לפני הגדרת תגובות הקשירה, הפעל מראש את ג'ל הפוליאקרילאמיד המקורי של 5% ב-0.5x TBE ו-2.5% גליצרול כדי להסיר את כל עקבות האמוניום פרסולפט ב-80 וולט למשך 30 דקות עד שעה, או עד שהזרם כבר לא משתנה עם הזמן.
לאחר מכן, מערבבים ארבעה מיקרוליטרים של מאגר מחייב פי 5, 80 עד 200 ננוגרם של חלבון מטוהר A, מיקרוליטר אחד של בדיקה מצומדת צבע מיקרו-מולרית ומים מזוקקים כפולים. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, טען את כל תגובת הקישור על הג'ל והפעל את הג'ל ב-10 וולט לסנטימטר למרחק הרצוי.
מכסים את מנגנון הג'ל באלומיניום כדי לשמור על הג'ל בחושך ככל האפשר. נקה את מיטת הסורק של מערכת הדמיה אינפרא אדום במים מזוקקים. נגב יבש את צלחות הזכוכית המכילות את הג'ל והנח אותן על משטח הסורק.
פתח את תוכנת הדמיית האינפרא אדום ולחץ על הכרטיסייה Acquire. עבור לוחות עבים יותר, השתמש בהגדרות של 700 לערוץ, אוטומטי לעוצמה, 84 מיקרומטר לרזולוציה, בינוני לאיכות ו-3.5 מילימטרים להיסט מיקוד. בחר את האזור שהג'ל תופס על הסורק.
לבסוף, לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה. ניתן לדמיין את התקדמות האלקטרופורזה עם צבע טעינת G כתום, בעוד שכחול ברומופנול מזוהה במהלך הסריקה ולכן מפריע לניתוח התמונה. תוספת של dI-dC לתגובת הקישור ביטלה את הקישור של 6xHis-SOX-2 מטוהר עם חמשת בדיקות ה-DNA של הצבע הראשוני.
המוטציה LIM-4 והגשושית הקרה SOX-2 שעברה מוטציה באתר הקישור LIM-4 יעילה כמו הגשושית הקרה מסוג הבר בתחרות עם הגשושית האינפרא אדום המסומנת בצבע פלואורסצנטי לקשירה ל-6xHis-SOX-2. עם זאת, יעילות התחרות של הגשושית הקרה המוטנטית LIM-4 ו-SOX-2 שעברה מוטציה באתר הקישור SOX-2 נמוכה בהרבה מהגשושית הקרה מסוג הבר לקשירה ל-6xHis-SOX-2. מבחני Supershift של קומפלקס ה-DNA SOX-2 באמצעות 6xHis ואפיטופים של דגל הביאו לפס DNA SOX-2 Supershifted.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את בדיקות האינפרא אדום בחושך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עריכת גנום CRISPR cas9 על מנת לענות על שאלות נוספות כמו החשיבות של רצף קשירת DNA מסוים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוכימיה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA באורגניזמים מודלים שונים. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לקבוע אינטראקציות חלבון-דנ"א באמצעות תוויות דנ"א לא רדיואקטיביות. אל תשכח שעבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לאסימות ניידות אלקטרופורטיות פלואורסצנטיות (fEMSA) המנצלות חלבוני SOX-2 מטוהרים ובדיקות DNA מסומנות בצבע פלואורסצנטי אינפרא-אדום. השיטה נועדה לזהות אינטראקציות חלבון-DNA ללא שימוש בחומרים רדיואקטיביים, ומספקת אלטרנטיבה בטוחה ויעילה יותר.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- ביוכימיה
- אינטראקציות חלבון-DNA
רקע
- אסימות ניידות אלקטרופורטיות (EMSA) חיוניות לחקר אינטראקציות חלבון-DNA.
- שיטות EMSA מסורתיות מסתמכות לעתים קרובות על בדיקות רדיואקטיביות, אשר מציבות סיכוני בטיחות.
- בדיקות פלואורסצנטיות מציעות אלטרנטיבה שאינה רדיואקטיבית לזיהוי האינטראקציות הללו.
- SOX-2 הוא חלבון מרכזי בביולוגיה של תאים גזע, מה שהופך את האינטראקציה שלו עם DNA למשמעותית.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול בטוח ויעיל יותר לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA.
- להשתמש בבדיקות פלואורסצנטיות לצורך ויזואליזציה וניתוח משופרים.
- לספק מתודולוגיה מפורטת לחוקרים בביולוגיה מולקולרית ובביוכימיה.
שיטות ששימשו
- הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד טבעי של חמישה אחוזים.
- שימוש במאגר tris borate EDTA (TBE) 0.5x.
- שילוב גליצרול בג'ל ליציבות.
- ערבוב ריאגנטים ספציפיים ליצירת תמיסת הג'ל.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול של fEMSA מזהה בהצלחה אינטראקציות חלבון-DNA.
- בדיקות פלואורסצנטיות מספקות ויזואליזציה ברורה ללא חששות בטיחותיים.
- השיטה יעילה וחוסכת זמן בהשוואה לטכניקות מסורתיות.
- התוצאות מדגימות את יישומיות הפרוטוקול בהקשרים ביולוגיים שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול המותאם של fEMSA הוא כלי חשוב לחוקרים.
- שיטות שאינן רדיואקטיביות משפרות את הבטיחות והיעילות במחקרים מולקולריים.
- גישה זו ניתנת ליישום על חלבונים ותווי DNA שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, cost-effective detection of protein-DNA interactions using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides, eliminating radioactivity-related hazards and reducing assay turnaround time. It supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible binding data for transcription factors like SOX-2. The method enhances predictive confidence in lead identification workflows by delivering clear, analyzable electrophoretic shifts without radioisotope handling constraints.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcription factor-DNA binding specificity to validate therapeutic targets such as SOX-2 in neuronal differentiation pathways.
- Operational Value: Uses infrared fluorescent probes that allow direct visualization and quantification without autoradiography or phosphorimaging.
- Scientific Value: Detects altered binding affinity due to missense mutations (e.g., SOX-2G73E), supporting mechanistic insight into pathogenic variants.
- Operational Value: Eliminates radioactive waste disposal requirements, improving lab safety and reducing regulatory overhead.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-dependent binding curves to assess protein-DNA interaction kinetics and affinity under controlled conditions.
- Operational Value: Utilizes stable, infrared dye-labeled probes storable at −20°C, enabling batch preparation and reuse across multiple experiments.
- Scientific Value: Permits competition assays with unlabeled probes to determine binding specificity and identify effective disruptors.
- Operational Value: Compatible with standard native PAGE systems and infrared imagers, requiring no specialized electrophoresis equipment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes, such as olfactory neuron identity transformation, supporting translational relevance.
- Operational Value: Requires only purified protein and oligonucleotide inputs, making it adaptable to various disease-relevant systems.
- Scientific Value: Supershift assays using epitope-tagged proteins (e.g., 6xHis, flag) confirm complex identity, increasing data interpretability.
- Operational Value: Total assay time of 2–4 hours allows integration into medium-throughput screening cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The fEMSA method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and informing lead selection through mechanistic de-risking of protein-DNA interactions.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulator binding to cis-regulatory elements to clarify pathway activity and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding readouts that enable comparison of wild-type and mutant protein variants.
- Analytics: Generates electrophoretic shift patterns and competition data suitable for densitometric analysis and KD estimation.
- Translational Research: Connects binding defects to cellular phenotypes, aiding in biomarker-aligned target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing transcription factor-DNA interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by providing direct, visual evidence of sequence-specific binding.
- Operational Value: Reduces per-assay cost and time by avoiding radioactive probe synthesis, decay correction, and exposure delays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by minimizing false positives from nonspecific binding through rigorous controls.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with well-characterized mechanism of action at the DNA-binding level.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide annealing, fill-in reactions, and native gel electrophoresis.
- Depends on access to an infrared imaging system capable of 700 nm channel detection.
- Necessitates standardized binding buffer composition and protein purification quality for reproducible results.
- Requires dark handling of IR-labeled probes to prevent photodegradation and signal loss.
- Limited to nucleic acid-binding proteins; not suitable for RNA or protein-protein interaction studies without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Preparation of Gel, Infrared Fluorescent Dye-labeled Probes and Unlabeled Probes
4:49
Binding Reaction and Electrophoresis
6:37
Imaging
7:35
Results: Electrophoretic Mobility Shift Assays Using Purified Proteins and Dye-labeled DNA Probes
8:57
Conclusion
