פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות אינטראקציות חלבון-DNA באמצעות בדיקות לא רדיואקטיביות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה, כגון קביעת רצף יעד ה-DNA של חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בחלופה קלה, בטוחה וחוסכת זמן לשימוש בבדיקות רדיואקטיביות.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי של חמישה אחוזים המכיל 0.5x tris borate EDTA או TBE, ו-2.5% גליצרול באמצעות מערכת מיני ג'ל חלבון. להכנת 30 מיליליטר תמיסת ג'ל לארבעה ג'לים, מערבבים מים מזוקקים, TBE, אמוניום פרסולפט, TEMED, אקרילאמיד ביס וגליצרול. העבירו מיד את תמיסת הג'ל.

לאחר הפילמור, עטפו את הג'לים בניילון שקוף שהורטב מראש ב-0.5x TBE ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכנן אוליגונוקלאוטיד ארוך לכ-51 מרס. תכנן אוליגונוקלאוטידים קצרים משלימים לכ-14 mers עם שינוי צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום בחמשת הקצוות הראשוניים.

לאחר הכנת האוליגונוקלאוטידים, השעו אותם מחדש במאגר 1x Tris-EDTA לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. לצורך חישול, מערבבים 0.6 מיקרוליטר של חמישה אוליגונוקלאוטיד קצר בצבע פריים, 1.2 מיקרוליטר אוליגונוקלאוטיד ארוך ו-28.2 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי Tris-EDTA בצינור של 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור במים רותחים למשך חמש דקות, ואז מכבים את מקור החום ומאפשרים למים עם האוליגונוקלאוטידים המחוסמים להתקרר למשך הלילה בחושך.

כדי ליצור בדיקות DNA דו-גדיליות, מערבבים 30 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטידים מחוסמים עם DNTPs, מאגר Klenow, תג צבע Klenow חמישה ראשוניים ומים מזוקקים כפול בצינור PCR של 0.2 מיליליטר. דגרו את התערובת למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס במכונת PCR. לאחר מכן, הוסיפו 3.4 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי כדי לעצור את התגובה, ולהשבית את החום ב-75 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במכונת ה-PCR.

לאחר מכן, יש לדלל את הבדיקות הממולאות במאגר נתרן כלורי Tris-EDTA לריכוז סופי של 0.1 מיקרומולר. אחסן את האוליגונוקלאוטידים במינוס 20 מעלות צלזיוס בחושך עד שהם מוכנים לשימוש. להכנת בדיקות ללא תווית, מערבבים 20 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטיד ארוך, 20 מיקרוליטר של אוליגונוקלאוטיד Long R ו-60 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי Tris-EDTA בצינור של 1.5 מיליליטר.

מניחים את הצינור במים רותחים למשך חמש דקות, ואז מכבים את מקור החום ומניחים למים עם האוליגו המחוסמים להתקרר למשך הלילה. הכן מיליליטר אחד של מאגר מחייב פי 5 על ידי ערבוב Tris HCl, נתרן כלורי, אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד, EDTA, DTT, BSA ומים מזוקקים כפולים. לפני הגדרת תגובות הקשירה, הפעל מראש את ג'ל הפוליאקרילאמיד המקורי של 5% ב-0.5x TBE ו-2.5% גליצרול כדי להסיר את כל עקבות האמוניום פרסולפט ב-80 וולט למשך 30 דקות עד שעה, או עד שהזרם כבר לא משתנה עם הזמן.

לאחר מכן, מערבבים ארבעה מיקרוליטרים של מאגר מחייב פי 5, 80 עד 200 ננוגרם של חלבון מטוהר A, מיקרוליטר אחד של בדיקה מצומדת צבע מיקרו-מולרית ומים מזוקקים כפולים. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, טען את כל תגובת הקישור על הג'ל והפעל את הג'ל ב-10 וולט לסנטימטר למרחק הרצוי.

מכסים את מנגנון הג'ל באלומיניום כדי לשמור על הג'ל בחושך ככל האפשר. נקה את מיטת הסורק של מערכת הדמיה אינפרא אדום במים מזוקקים. נגב יבש את צלחות הזכוכית המכילות את הג'ל והנח אותן על משטח הסורק.

פתח את תוכנת הדמיית האינפרא אדום ולחץ על הכרטיסייה Acquire. עבור לוחות עבים יותר, השתמש בהגדרות של 700 לערוץ, אוטומטי לעוצמה, 84 מיקרומטר לרזולוציה, בינוני לאיכות ו-3.5 מילימטרים להיסט מיקוד. בחר את האזור שהג'ל תופס על הסורק.

לבסוף, לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה. ניתן לדמיין את התקדמות האלקטרופורזה עם צבע טעינת G כתום, בעוד שכחול ברומופנול מזוהה במהלך הסריקה ולכן מפריע לניתוח התמונה. תוספת של dI-dC לתגובת הקישור ביטלה את הקישור של 6xHis-SOX-2 מטוהר עם חמשת בדיקות ה-DNA של הצבע הראשוני.

המוטציה LIM-4 והגשושית הקרה SOX-2 שעברה מוטציה באתר הקישור LIM-4 יעילה כמו הגשושית הקרה מסוג הבר בתחרות עם הגשושית האינפרא אדום המסומנת בצבע פלואורסצנטי לקשירה ל-6xHis-SOX-2. עם זאת, יעילות התחרות של הגשושית הקרה המוטנטית LIM-4 ו-SOX-2 שעברה מוטציה באתר הקישור SOX-2 נמוכה בהרבה מהגשושית הקרה מסוג הבר לקשירה ל-6xHis-SOX-2. מבחני Supershift של קומפלקס ה-DNA SOX-2 באמצעות 6xHis ואפיטופים של דגל הביאו לפס DNA SOX-2 Supershifted.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את בדיקות האינפרא אדום בחושך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עריכת גנום CRISPR cas9 על מנת לענות על שאלות נוספות כמו החשיבות של רצף קשירת DNA מסוים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוכימיה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA באורגניזמים מודלים שונים. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לקבוע אינטראקציות חלבון-דנ"א באמצעות תוויות דנ"א לא רדיואקטיביות. אל תשכח שעבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.