פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

המטרה הכללית של בדיקה זו היא לזהות אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA באמצעות גששים שאינם רדיואקטיביים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה, כגון קביעת רצף ה-DNA המהווה מטרה עבור חלבונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה חלופה פשוטה, בטוחה וחסכונית בזמן לשימוש בגששים רדיואקטיביים.

כדי להתחיל בהליך זה, הכין ג'ל פוליאקרילמידה טבעי בריכוז חמישה אחוזים המכיל 0.5x tris borate EDTA או TBE, ו-2.5% glycerol באמצעות מערכת ג'ל חלבונים מיני.

לאחר הפולימריזציה, עטפו את הג'לים בניילון נצמד שרטוב מראש ב-0.5x TBE ואחסנו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכננו אוליגנוקלאיד ארוך של כ-51 מרים. תכננו אוליגנוקלאידים קצרים משלימים של כ-14 מרים עם מודיפיקציה של צבע פלואורסצנטי באינפרא-אדום בקצה ה-5'.

לאחר הכנת האוליגונוקלאוטידים, השעה אותם בבופר 1x Tris-EDTA לריכוז סופי של 100 micromolar. לצורך ההלחמה (annealing), ערבב במבחנה של 1.5 milliliter כמות של 0.6 microliters מאוליגונוקלאוטיד קצר עם צבע prime, 1.2 microliters מאוליגונוקלאוטיד ארוך, ו-28.2 microliters מבופר sodium chloride Tris-EDTA. הנח את המבחנה במים רותחיםים למשך חמש דקות, לאחר מכן כבה את מקור החום והשאר את המים עם האוליגונוקלאוטידים המולחמים להתקרר במהלך הלילה בחושך.

להכנת גששים (probes) של DNA דו-גדילי, ערבב 30 µL של האוליגנוקלאוטידים המאונחים (annealed) עם DNTPs, Klenow buffer, Klenow five prime dye tag ומים מזוקקים פעמיים בתוך מבחורת PCR בנפח 0.2 mL. דגור את התערובת למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C במכשיר PCR. לאחר מכן, הוסף 3.4 µL של EDTA בריכוז 0.5 M כדי לעצור את התגובה, ובצע אינאקטיבציה תרמית בטמפרטורה של 75 °C למשך 20 דקות במכשיר ה-PCR.

לאחר מכן, דללו את הגששים הממולאים בבופר sodium chloride Tris-EDTA לריכוז סופי של 0.1 micromolar. אחסנו את האוליגנוקלאוטידים בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius בחושך עד למועד השימוש. להכנת גששים לא מסומנים, ערבבו 20 microliters של אוליגנוקלאוטיד ארוך, 20 microliters של אוליגנוקלאוטיד Long R ו-60 microliters של בופר sodium chloride Tris-EDTA במבחנה של 1.5 milliliter.

הניחו את המבחנה במים רותחים למשך חמש דקות, לאחר מכן כבו את מקור החום והניחו למים עם האוליגוניוקליאוטידים שעברו התאנה להתקרר במהלך הלילה. הכינו מיליליטר אחד של 5x binding buffer על ידי ערבוב של Tris HCl, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Magnesium Chloride, EDTA, DTT, BSA ומים מזוקקים פעמיים. לפני ביצוע תגובות הקשירה, הריצו מראש את ג'ל הפוליאקרילאמיד הנטבעי בריכוז 5% ב-0.5x TBE ו-2.5%glycerol כדי להסיר את כל השאריות של ammonium persulfate במתח של 80 volts למשך 30 דקות עד שעה, או עד שהזרם אינו משתנה יותר עם הזמן.

בשלב הבא, ערבבו ארבעה µL של 5x binding buffer, 80 עד 200 ng של חלבון A מומהם, מיקרוליטר אחד של 0.1 µM dye conjugated probe, ומים מזוקקים פעמיים. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, העמיסו את כל תגובת הקשירה על הג'ל והריצו את הג'ל ב-10 V/cm למרחק הרצוי.

כסו את מכשיר הג'ל בנייר אלומיניום כדי לשמור על הג'ל בחשיכה ככל האפשר. נקו את משטח הסריקה של מערכת דימוי באינפרא-אדום בעזרת מים מזוקקים. נגבו למשקל את לוחות הזכוכית המכילים את הג'ל והניחו אותם על משטח הסריקה.

פתח את תוכנת הדמיית האינפרה-אדום ולחץ על לשונית Acquire. עבור פלטות עבות יותר, השתמש בהגדרות הבאות: 700 לערוץ (channel), auto לעוצמה (intensity), 84 micrometers לרזולוציה, medium לאיכות, ו-3.5 millimeters להיסט פוקוס (focus offset). בחר את האזור שבו הג'ל נמצא על הסורק.

לבסוף, לחצו על Start כדי להתחיל את הסריקה. ניתן להמחיש את התקדמות האלקטרופורזה באמצעות צבע טעינה Orange G, בעוד ש-Bromophenol blue מזוהה במהלך הסריקה ולכן מפריע לניתוח התמונה. הוספה של dI-dC לתגובת הקישור ביטלה את הקישור של 6xHis-SOX-2 מופרש עם גששי ה-DNA הצבועים בקצה ' 5.

המוטנט LIM-4 והגשוש הקר (cold probe) של SOX-2 עם מוטציה באתר קישור ה-LIM-4 יעילים באותה מידה כמו הגשוש הקר מסוג הפרא בתחרות עם הגשוש המסומן בצבע פלואורסצנטי באינפרא-אדום על הקישור ל-6xHis-SOX-2. עם זאת, יעילות התחרות של המוטנט LIM-4 והגשוש הקר של SOX-2 עם מוטציה באתר קישור ה-SOX-2 נמוכה בהרבה מזו של הגשוש הקר מסוג הפרא עבור קישור ל-6xHis-SOX-2. בדיקות Supershift של קומפלקס ה-DNA של SOX-2 באמצעות אפיתופים של 6xHis ו-flag הניבו פס SOX-2 DNA עם תזוזה כלפי מעלה (supershifted).

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להסמיך את הגששים האינפרא-אדומים בחשכה. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון עריכה גנומית באמצעות CRISPR cas9 כדי לענות על שאלות נוספות, כגון חשיבותה של רצף קישור ספציפי ל-DNA.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביוכימיה לחקור אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA באורגניזמי מודל שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לקבוע אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA באמצעות סימוני DNA שאינם רדיואקטיביים. זכרו כי עבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון ציוד מיגון אישי, בעת ביצוע הליך זה.