Name: אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: למדו אפיון מבני של פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות שיטת PACE. הפרוטוקול מאפשר ניתוח כמות ומבנה של גלוקומנן ללא ציוד יקר או הכשרה מיוחדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

שיטת הקצב היה פיתח, אופטימיזציה על ידי חברי הקבוצה דופרי (מנדרינית, בריטניה) שונים לאורך השנים, אנו מעריכים כל התרומות שלהם. עבודה זו מומן כחלק של DOE המכון BioEnergy משותף (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי מחלקת האנרגיה של ארה ב, משרד המדע, משרד הביולוגיים המחקר הסביבתי, באמצעות חוזה דה-AC02-05CH11231 בין לורנס המעבדה הלאומית ברקלי, מחלקת האנרגיה של ארצות הברית. אנו מודים גם תיאה פיק ו- Vy Ngo לקבלת עזרה בהכנת הדגימות csla9 .

1. קציר של חומר צמחי <ol><li>הקציר חומר צמחי טריים (~ 20 מ ג), מיד לתוכה אתנול 96% (v/v), דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה מבטל כל דופן התא משפילים אנזימים הנוכחי. עבור חומר יבש, מתחילים בשלב 2- 
	התראה: אתנול הוא דליק. 
	הערה: עלה אחד גזע או רוזט יספק מספיק חומר לניתוח. עם זאת, פחות שגיאות לצוץ אם בכמות גדולה יותר של רקמה זו איחדו וניתח מכיוון שזה קל יותר שוקל ולטפל.</li>
	<li>רקמה סוג רשומה בקפידה, שלב התפתחותי, כמבנה רב-סוכר משתנה עם שניהם. לדוגמה, עם תודרנית לבנה (בשימוש כאן), שלב הרקמה לפי השיטות של בויס. et al. 15 הערה: ב פרוטוקול זה, השתמשנו החצי התחתון של הגזע ינפלוראסכאנך, איפה silique הראשון הינו מאורך מלא אבל לא הצהבה.</li></ol>
 2. הכנה של אלכוהול לא מסיסים שאריות (אוויר) <ol><li>הכן אוויר, בעקבות השיטה של מורטימר. et al. 9 או שיטה דומה אחרת, על מנת לייצר אבקה חסר סוכרים מסיסים, כגון סוכרוז, עמילן.</li>
</ol> 3. Aliquoting וטרום טיפול של אוויר הערה: הכמות המדויקת של אויר הדרוש עבור כל דגימה יהיה תלוי (א) של השפע את רב-סוכר עניין בחומר ו- (ב) בגודל ממוצעת של oligosaccharides שפורסמו על ידי GH. השיטה מוסיף מולקולה בודדת פלורסנט עד הסוף תוך צמצום של. פחמימה # מיון, כל הפחמימות-כך מספר oligosaccharides קובע את הרגישות של הניסוי. כקו מנחה, glucomannan בגזע תודרנית מתעכל עם GH5/GH26 (כמתואר), 500 µg מומלץ 11, ואילו xylan בגזע תודרנית מתעכל עם GH11, מומלץ 100 µg כמו מורטימר &#39; s המחקר 3. <ol><li>שוקל אוויר (10-15 מ ג) לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, ולהוסיף H 2 O ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. מערבולת כדי להשיג על ההשעיה אפילו. אם זה בעייתי, השתמש מהמגן זכוכית כדי לסייע תהליך זה-</li>
	<li>µG aliquot 500 לתוך microfuge צינורות. יבש aliquots באמצעות צנטריפוגה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) לילה ב- 30 ° C.</li>
	<li>האוויר לטיפול מראש עם 1 M NaOH (20 µL) לשעה בטמפרטורת החדר; זה מבטל את acetylates של סוכרים, מתנפח microfibrils תאית, לשבש את מבנה ביומסה ומאפשר גישה GH. 
	הערה: שלב זה ניתן לדלג על סוכרים מטוהרים. זהירות &#8211; חומצה/בסיס חזק.
	<ol><li>כוללים את aliquot עבור פקד אוויר לא-אנזים (אותו יחס כמו כל הדגימות, למעט שלב 4.1. אינו נכלל).</li>
	</ol></li> <li>µL להוסיף 200 של H 2 O ו 20 µL 1 מ' ב- HCl כדי לנטרל. מבחן ה-pH היא ~ 6-7 על ידי הסרת 1 µL ו לראות אותו על גבי נייר אינדיקטור חומציות.</li>
	מאגר אצטט <li>להוסיף 50 µL 1 מ' אמוניום, pH 6.0 (או איזה pH מתאים GHs השתמשו במחקר) ו- H 2 O לתת הנפח הכולל של 500 µL. 
	הערה: אמוניום אצטט משמש מאז זה sublimes על ייבוש, ולכן זה לא להוסיף מלח נוספים המדגם. עודף מלח יכול להוביל הלהקה המסכן-צורה והרזולוציה על הג'ל פייס.</li>
</ol> 4. הידרוליזה של האוויר עם Glycosyl Hydrolases (GHs) הערה: כאמור בדיון, טוהר GHs היא קריטית. רק להשתמש heterologously הביע, זיקה טהור אנזימים. לאחר קבלת כל חלקה של היצרן, hydrolyze aliquots מוגדרים של מצע (למשל, 500 µg אוויר) עם הגדלת כמויות של GH בן לילה (למשל, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 יחידות/µL). כאשר יש עודף של GH, טביעת האצבע בקצב ייראה זהה. עודף של אנזים נדרש לספק תוצאה לשחזור כי זה חייב להיות בטוח כי התגובה הידרוליזה מתקרב נקודת הקצה.
<ol><li>הוסף סכום שנקבע מראש (ראה לעיל) של mannanases (GH5, GH26 11) כדי aliquots האוויר במאגר מהשלב 3.5, כמו גם חיובי (30 µg של konjac glucomannan), ובקרה פקד שלילי. לא-אייר (אנזים מיקס ב שפופרת ריק). מערבולת, ומסתובב אז בקצרה כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית השפופרת.</li>
	<li>דגירה בין לילה-37 מעלות צלזיוס (או את הטמפרטורה המתאימה עבור GH הבחירה) עם עצבנות עדין (~ 100 סל ד).</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות 
	הערה: כובע סגרים יכול לשמש כדי לסגור את flip-העליון microfuge צינורות.
	<ol><li>צנטריפוגה באמצעות microfuge העליון של ספסל במהירות המרבית עבור 10 דקות ונשארים תגובת שיקוע.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend צנפה 250 µL H 2 O, צנטריפוגה כאמור לעיל, ולשמר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשלב שני supernatants, ויבש ומפרידה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) ב 30 ° C (~ 3 h או לילה ללא חימום).</li>
</ol> 5. הכנת תקנים פחמימה # מיון הפחמימות <ol><li>מניות 1 מ"מ הכן פתרונות H 2 O מנוז (אדם), mannobiose (האיש 2), mannotriose (האיש 3), mannotetraose (4 איש), mannopentaose (האיש 5), mannohexaose (איש 6), כל β, 1-4 מקושרים. Aliquot וחנות ב-20 ° C עד נדרש.</li>
	<li>להכין תערובת 1-6 3 ריכוזים שונים של אדם על ידי שילוב של µL 1 (תקן S1), µL 2 (S2) או 5 µL (S3) של כל ששת.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization של Oligosaccharides <ol><li>להכין פתרון מניות של נמלים 0.2 מ' (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic חומצה) H 2 O: חומצה אצטית 17:3. מניות חם עד 60 ° צלזיוס לחלוטין להתמוסס המוצק. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני אור, 2-3 חודשים.</li>
	<li>להכין פתרון 0.2 מ' מניות של 2-picoline borane (2-PB) ב דימתיל סולפוקסיד. זה מאוד היגרוסקופי, אז מיד resuspend כל אבקה עם קבלת ב דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, חנות ב-20 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שנים. הפשרת aliquots ככל הנדרש (החנות ב 4 ° C עבור 2 שבועות ולאחר מכן להשליך).</li>
	<li>להכין מאגר derivatization של H 2 O: אצטית חומצה: דימתיל סולפוקסיד בגיל 17:3:20-</li>
	<li>אחד לטעום, להוסיף 5 µL של נמלים, 5 µL של µL 2-PB ו- 10 מאגר derivatization. ספין בקצרה כדי לאסוף בתחתית של הרכבת התחתית, מערבולת ביסודיות, ואז ספין בקצרה שוב. ראה איור 1 לתיאור התגובה.</li>
	<li>Incubate דגימות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 2 h).</li>
	תקן של אוריאה 100 של 3 מ' µL ודוגמאות <li>resuspend. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני האור עד נדרש.</li>
</ol> 7. הכנה של קצב ג ' לים הערה: הרכבה של הציוד הליהוק ג'ל יהיה תלוי המותג. כאן, אנחנו use מערכת אלקטרופורזה אנכי (ראה טבלה של חומרים), מצוידים עם צלחות זכוכית 18 ס"מ 24 ס"מ ו- 1.5 מ מ מפרידי.
<ol><li>להרכיב ג'ל מכשור יציקה לכל היצרן &#39; הוראות s.</li>
	<li>לעשות 10 x קצב מאגר (1 מ' טריס-בוראט, pH 8.2) כלהלן: להוסיף 121.14 גר' טריס-בסיס ~ 400 מ של H 2 O ומיקס להתמוסס. להתאים את ה-pH ל 8.2 על-ידי תוספת של חומצה בורית מוצק (כ- 60 גרם), ולאחר מכן לבצע אחסון עד 1 ל'</li>
	<li>יעשו אמוניום 10% (w/v) persulfate (APS) מניות H 2 O. Aliquot ו לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. ההפשרה aliquots פעם אחת, לאחסן ב 4 ° C ולמחוק לאחר 2 שבועות.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל פתרון. עבור הציוד הנ ל, ג'ל 1 להקביל בין 50 מ. בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, מערבבים H 2 O (20.2 מ"ל), מאגר בקצב של 10 x 5 מ ל, 24.6 מ ל 40% אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (29:1 acrylamide:Bis). (זהירות: רעיל).
	<ol><li>להוסיף 200 µL של APS ו 20 µL של N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). היפוך בעדינות לערבב (כדי למנוע היכרות עם בועות אוויר). יוצקים את הג'ל באמצעות סרולוגית או פיפטה באמצעי אחסון גדולים אחרים, ~ 4 ס מ מתחת לקצה העליון של הזכוכיות. שימו לב לאפשרות של בועות אוויר מלהילכד הג'ל. אם הם עושים להפסיק לשפוך, הטיה/ברז הג'ל לשחרר אותם.</li>
	</ol></li> <li>כיסוי את הג'ל עם אלכוהול איזופרופיל (זהירות : דליק) או, בזהירות, עם H 2 O. אפשר ג'ל פולימריזציה (20-30 דקות), ולאחר מכן יוצקים את השכבה העליונה. אם אלכוהול איזופרופיל שימש, ואז לשטוף 2 x עם H 2 יבש או כל נוזל עודף באמצעות נייר סופג.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל הערימה. לערבב 6.8 מ ל H 2 O, מאגר בקצב של 10 x 1 מ"ל, 2.8 מ"ל אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (זהירות: רעילים), 80 µL APS, µL 8 של TEMED ב שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. ' היפוך ' כדי לערבב, כיסוי על גבי polymerized ג'ל פתרון. הכנס בעדינות מסרקים, הימנעות בועות אוויר השמנה תחת השיניים המסרק.</li>
	<li>אפשר ג'ל כדי פולימריזציה (20-30 דקות), עטוף ברקמה לחה ולאחר מכן גם בניילון נצמד, ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרש. חנות עם המסרקים במקום. 
	הערה: קצב ג'לים ניתן לאחסן לתקופה מקסימלית של 2 שבועות (למרות פחות משבוע הוא אידיאלי), אם הם שמרו לחה.</li>
</ol> 8. ריצה קצב ג'ל <ol><li>להשתמש בסמן קבוע כדי לתייג את העמדות היטב על הזכוכית, אשר יסייע שמירה על מסלול של סדר טעינה, והם בזיהוי איפה הבארות המסרק הוא הוסר ברגע.</li>
	<li>להסיר את המסרק. למלא את הבארות מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להשתמש microsyringe µL 10 כדי לטעון µL 2 של סטנדרטים ודוגמאות לתוך בארות. הימנע משימוש המסלולים החיצוני ביותר, אשר נוטים לרוץ דגימות גרוע.</li>
	<li>להרכיב התא העליון של המנגנון ג'ל-ריצה, ולמקם את הג'ל במיכל מקורר (~ 10 ° C) פועל (10 ° C) המכיל מאגר בקצב x 1. למלא את התא העליון עם מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להפעיל כוח והפעל הג'ל ב- 200 וולט (קבוע V) במשך 30 דקות ולאחר מכן עלייה במתח עד 1000 V עבור 1 h 40 דקות. להגן על ג'לים מפני אור (למשל, על ידי ליפוף טנקים בשקיות אשפה שחור). 
	הערה: לבדוק ג'לים ~ 5 דקות לאחר הפעלת המתח ולאחר מכן עוד 5 דקות לאחר הגדלת המתח עד 1,000 V. אם ערכת צריכת חשמל אין אפשרות לשמור את המתח יש ככל הנראה דליפת המאגר. להסיר את הג'ל של הטנק. להרכיב מחדש את התא העליון, בודקים בזהירות השמה אטמים כל. שבב גדול בקצה העליון של לוח הזכוכית עלול למנוע את הצלחת יוצרים סגירה עם gasket. יכול בדרך כלל באופן זמני לפתור על-ידי הוספת ירידה של 5% (w/v) agarose מותכת לחלק סדוקים של הזכוכית, לפני הוספת התא העליון.</li>
</ol> 9. להמחיש ג'ל בקצב הערה: להשתמש ג'ל הדמיה למערך עם נורות UV ארוכת גל את transilluminator, ואת מסנן פליטה למצלמה אשר מתאים fluorophore, כאן 530 ננומטר. לחלופין, סורק לייזר עשוי לשמש גם, כפי שמתואר Goubet 2-
<ol><li>להבטיח הג'ל מערכת הדמיה היא בחינם אבק על-ידי. מוחקים את זה עם לחות נטולת מוך.</li>
	<li>להסיר את הג'ל ממיכל בקצב והצג בקצרה בזמן הג'ל עדיין נמצא הזכוכיות (&#60; 80 ms) כדי לקבוע אם החזית צבע היא עדיין על הג'ל.</li>
	<li>פתח את הג'ל בעזרת כלי טריז, בעוד ג'ל הוא עדיין בצלחת כוס אחת, להשתמש בחותך פיצה כדי להסיר את הג'ל בשני הערמה, ואם החזית צבע היא עדיין על הג'ל, החלק התחתון של הג'ל.</li>
	<li>את ~ 5 מ ל H 2 O אל פני השטח של transilluminator, ולאחר מכן להעביר את הג'ל ישירות על גבי transilluminator. להגדיר את המסנן UV 605 והפעל את transilluminator והאזינו UV (ראה טבלה של חומרים) באמצעות התוכנה- 
	הערה: fluorophore נמלים המשמש כאן יש עירור/פליטה של 353/520 nm.</li>
	<li>לקחת כמה תמונות בזמנים חשיפה שונים (למשל, 100 ms 10 s). ודא כי האור האולטרה סגול מבוטלת בין תמונות על-ידי לחיצה על לחצן אור UV (לבטל) כדי להימנע משפילים את קרינה פלואורסצנטית. להבטיח כי לפחות 2 תמונות יש להקות רוויים (הג'ל imaging התוכנה יציין זאת).</li>
	<li>שמור קבצים כתמונות גבוהה-resolution.tif. 
	הערה: תמונות ניתן לנתח באמצעות התוכנה המצורפת עם הג'ל מערכת הדמיה, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות, כגון ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). עיין בסעיף תוצאות הדיון כימות.</li>
</ol>

<ol><li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li>
<li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis%3A+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li>
<li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li>
<li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels%3A+a+natural+marriage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li>
<li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3%2C+IRX9L%2C+IRX10L+and+IRX14%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li>
<li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li>
<li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms%3A+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li>
<li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li>
<li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li>
<li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases%2C+and+influences+the+progression+of+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li>
<li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity%2C+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass%2C+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li>
<li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481(2015).</li>
<li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li>
<li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis%3A+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.cazy.org/">The Carbohydrate Active Enzyme Database</a>. , 
 www.cazy.org (2017).</li>
<li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).</li>
<li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

קצב היא שיטה פשוטה עבור אפיון מבנה רב-סוכר. ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר ידועים GHs עם פעילות מאופיין, לראות דוגמאות רבות הספרות1,6,9,11. Tt הוחלה גם על האפיון של הרומן GHs12,13,18 ו glycosyltransferases9, על ידי עשיית שימוש של סובסטרטים מוגדר רב-סוכר, acceptors.
לשחזור, interpretable תוצאות תלויים שלושה שלבים מרכזיים. קודם כל, GHs בשימוש צריכים להיות חופשיים ובלחות פעילויות. . זה הטוב ביותר מושגת רק באמצעות ביטוי heterologously, זיקה מטוהרים אנזימים. שנית, עבור רוב הניסויים, זה חשוב כי הידרוליזה אנזימטי של סובסטרטים הוא בעת סיום. פעולה זו תבטיח כי ביומסה באותו הידרוליזה עם GH זהה נותן מאפיינים דומים בבכל ניסוי. לבסוף, צריך להיות עודף של fluorophore ב התגובה derivatization. פעולה זו מבטיחה כי הקצוות תוך צמצום זמין לוחיות ההסבר ל 100 אחוז. התוצאה תהיה הפארמצבטית גבוהה של תוצאות, כמו גם נתונים כמותיים.
ג'ל ואיכות ריאגנט הם קריטיים להבטחת לשחזור נתונים. מאגרי באיכות ירודה, במיוחד של שגוי pH, אוויר בועות הג'ל, דגימות עם עודף מלח יכול כל משפיעים על רזולוציה ושמירה פקטור של oligosaccharides. עם זאת, הכללת הפקדים המומלצת המתוארות בסעיף הפרוטוקול ואת התוצאות יאפשר פתרון בעיות.
הקצב הוא מוגבל על ידי היכולת שלו לזהות oligosaccharides. עבור ניסויים, טביעת אצבע פשוטה הוא כל שנדרש. עם זאת, כדי באמת quantitate את כמות glucomannan במדגם של אוויר, לדוגמה, הזהות של כל oligosaccharides פרסמה נדרש, אשר הוא תהליך ממושך. . זה יותר פשוט פחות סוכרים מורכבים כגון xylan3. מאז יש כמה תקנים פחמימה # מיון הפחמימות זמין מסחרית, לא תמיד ייתכן אפשרי או רצוי לזהות את כל הלהקות. במקרה זה, קצב יכול לספק נתונים מחמיא ספקטרומטר מסה (קרי, MALDI-CID9 או ESI-MS7ו- NMR6). על שיטות אלה, לעתים קרובות מועיל לעשות הכנה בקנה מידה גדול, נפרדים על-ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה ולאחר מכן לנתח כל שבר על ידי שני פייס לפני MS או NMR. בעוד בעבר דווח כי להקות יכול להיות טוחנות, המזוהה על-ידי MALDI-CID, בפועל גילינו שאין לזה קצב נמוך של הצלחה (ככל הנראה כתוצאה אינטראקציות של oligosaccharides שכותרתו עם הג'ל אקרילאמיד בעת חשיפה לאור UV).
המגבלה העיקרית אחרים של קצב הוא התפוקה. יש איכות טובה, ג'לים interpretable עם הפקדים המתאימים, ג'ל כל יהיה רק דוגמאות ניסיוני ~ 10, חוקר יכול לצפות לבדוק ~ 4 משטחים הקצב לכל יום. לאחרונה, גרסה של קצב באמצעות נימי אלקטרופורזה (CE) כבר מפותחת19, אשר מאפשר הכנת דוגמאות ב 96-ובכן צלחות. זה שימש בהצלחה כדי לאפיין את פעילות האנזים glycosyltransferase,6,מבנים רב-סוכר19, למרות שזה דורש גישה למחשב לסה נ, יכול להיות יקר כדי לרכוש ולתחזק.

ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE) הוא שיטה של אפיון מפורט של פוליסכרידים-1,-2,-3. צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט.
מבנה רב-סוכר של דופן התא צמח ההבנה הוא הכרחי עבור אלה החוקרים חקר הצמח ביוסינטזה דופן התא או את התפקיד של החומה תא צמח-התפתחות הצמח. לאחרונה, עם זאת, הרכב קיר תא צמח הפך מעניין לקבוצה רחבה יותר של החוקרים בשל ההתמקדות באמצעות צמח ביומסה (למעשה קיר התא) כמו זינה כדי לייצר דלק ביולוגי, ביוכימיקלים4. לדוגמה, יעיל saccharification אנזימטי החומר הזה דורש הבנה מפורטת של המבנים רב-סוכר, קוקטיילים אנזימטי ממוטבת שניתן יהיה הנבחר5.
קצב יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות אשר עושים את זה אידיאלי לניתוח מהיר של מבנים מורכבים glycan. ראשית, היא אינה דורשת טיהור של רב-סוכר המדובר, כפי נדרש פתרון המדינה תהודה מגנטית גרעינית (NMR)6. שנית, קצב ניתן לפתור isomers מבנית, בניגוד ספקטרומטר מסה (MS, למשל, מטריקס בסיוע לייזר desorption/יינון (MALDI) וספקטרומטריית electrospray יינון (ESI)), אשר גם עשויה להיות מאתגרת כדי לבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) 7. שלישית, הקצב הוא מאוד רגיש, עם רזולוציה נמוכה-picomole, שלא כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) או נייר כרומטוגרפיה. בסופו של דבר, זה אינו דורש ידע ציוד או מומחה יקר, כמו במקרה של MS, NMR של LC.
שיטת הקצב מסתמך על ייחודה של אנזימי הידרולז (GH) glycosyl, אשר יעד מסוימים קישורים glycosidic בתערובת של סוכרים. כאשר האנזים GH פועל על השרשרת רב-סוכר, היא מגלה קצה תוך צמצום אשר יכול אז להיות מבחינה כימית derivatized, במקרה זה עם תווית פלורסנט. בחלק unhydrolyzed של המדגם ולכן מעובד לא לגילוי על ידי שיטה זו. Oligosaccharides עם תוויות ואז מפריד של ג'ל אקרילאמיד בפורמט גדול על ידי אלקטרופורזה. זה נותן פתרון מעולה של מולקולות דומות מאוד, לדוגמה, trisaccharides Glc-גבר-גבר, Glc-גבר-Glc יהיה שונה של Rf.
קצב שימש בהרחבה לאפיין מבנים שונים xylan על פני הצמח מינים8, לזהות מוטציות glycosyltransferase תודרנית6,9,10,11 לביצוע מבחני glycosyltransferase9, כדי לאפיין את הרומן GH פעילויות12,13. גם לאחרונה השתמשנו בו כדי לאפיין שמרים mannan דופן התא (Mahboubi, מורטימר, בהכנה). כאן נתאר שיטת אפיון מבנה הצמח דופן התא glucomannan, בהתבסס על דיווחים קודמים11,14.

<table><tbody><tr><td><תקני >אוליגוסאקהריד חזקים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; צמיגות נמוכה)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><<tr><td>חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק><</td><td>חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים מיוחדים אחרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-אמינונפתלין-1,3,6-חומצה טריסולפונית</td> <td>(בדיקות מולקולריות) תרמו</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-פיקולין בוראן</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (29:1 אקרילאמיד: ביס)</td><td>ביו-ראד</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות<</td></tr>/<tr><td>חזק><חזק>ציוד מיוחד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת יציקת ג'ל</td> ערכת <td>Hoefer</td><td>SE660</td><td>לוחות זכוכית 18x24 ס"מ, מרווחים 0.75 מ"מ</td></tr><tr><td>אמבט מים מחזורי קירור&nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>צריך להיות מסוגל לשמור על טמפרטורה ב ~ 10</td></tr><tr><td>C G: Box Chemi XRQ מערכת הדמיה</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>סדר עם מסננים המתאימים לפלואורפור, וטרנס-תאורה צריכה להיות מצוידת בנורות UV בעלות גל ארוך</td></tr><tr><td>חבילת מתח</td><td>גבוהה Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגת ואקום (Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה אנכית ג'ל</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td><חזק>גליקוזיל הידרולאזות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr>ניתן <tr><td>להשיג אותן מחברות כגון Megazyme (https://www.megazyme.com/) או Prozomix (http://www.prozomix.com/), או שניתן לבטא אותן בבית על ידי בקשת הפלסמיד מהמחקר הרלוונטי קבוצה.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד מעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה (צינורות צנטריפוגה פלקון, פוליפרופילן, סטרילי, קורנינג)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל (צינורות צנטריפוגה פלקון, פוליפרופילן, סטרילי, קורנינג)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'ל תוכנת הדמיה (Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט. ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), חומר צמחי דופן התא hydrolyzed עם glycosyl hydrolases ספציפית רב-סוכר בעל עניין (למשל, mannanases עבור מנן). פורמט גדול לזיהוי ג'לים משמשות לאחר מכן להפריד את oligosaccharides המשוחררים, אשר סומנו כאנטי fluorescently. ג'לים, ניתן לאבחן עם ג'ל ששונה מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). טביעת האצבע פחמימה # מיון הפחמימות וכתוצאה מכך ניתן גם להשוות איכותית או, עם שכפול, באופן כמותי. הצמדה ומידע מסעף ניתן להקים באמצעות hydrolases glycosyl נוספים (למשל, mannosidases ו- galactosidases). בעוד פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מבנה glucomannan, ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר מאופיין glycosyl hydrolases קיים. לחלופין, זה ניתן לאפיין את הרומן glycosyl hydrolases שימוש רב-סוכר מוגדר סובסטרטים.

כאן, אנו מראים על ג'ל קצב דוגמה לרוץ לכל הפרוטוקול, יחד עם תיאורי כדי לסייע עם פרשנות הנתונים ופתרון בעיות, זה מלווה מדריך כללי מוצלחת בקצב ג'ל פרשנות13,16. ג'ל נציג של קצב רגיל וזמינותו של דופן התא מנן תוכן מוצגת באיור2, מתואר ליין מאת ליין.
סטנדרטים מסלולים 1, 2 ו- 3 הצג סולם של מסחרית שנרכש oligosaccharides (גבר1- גבר6) ב 5 (S1), 10 (S2) ו- 50 ריכוז pmol (S3). בעת קבלת הרבה פחמימה # מיון הפחמימות מסחרי חדש, חשוב לבדוק את הטוהר על ג'ל. Oligosaccharides רבים, במיוחד tetrasacccharides יותר, יכול לקבל זיהום משמעותי, עם oligosaccharides של דרגות אחרות של פלמור (DPs), כמוצג כאן גבר6 (המסומנים *). בזמן quantitating ג'ל, זה חשוב שתהיה לפחות 3 ריכוזי הסטנדרטים, מאז זה הכרחי לחישוב עקומת סטנדרטי. חישוב של העקומה רגיל יכול להיות גם עוזר להבטיח כי התגובה derivatization הוא בעיקרו של דבר בעת סיום. סטנדרטים של ריכוזים ידועים לאפשר השוואות בין ג'לים, פקד שימושי עבור איכות ההפרדה ואיכות derivatization.
בקרה חיובית ליין 4 מראה של עיכול mannanase konjac glucomannan. Konjac glucomannan זמין מסחרית, בזמן זה לא קיים באותו מבנה כמו זה, לדוגמה, נמצאו תודרנית, זה משמשת לשתי מטרות. ראשית, זה פקד חשוב לעיכול אנזימטיות. החוקר צריך לקבוע איך נראה מצע מסחרי מתעכל עם שלהם GHs להתמקד כאשר מתעכל עד לסיומו (קרי, עודף עצום של GH מתווסף התגובה). אם בעתיד ניסויים התבנית משתנה, זה יכול להצביע או לאובדן של פעילות או זיהום של המניה GH. שנית, הוא משמש פקד עבור התגובה derivatization בנוכחות האנזים ומאגר המלחים. אם הפקד חיובי הוא עני, ולאחר מכן זה עשוי לציין כי רכיב של התגובה הידרוליזה היא המעכבת כדי derivatization הסטנדרטים להיראות טוב.
תודרנית פראי סוג (WT) נובעות אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 5 מציג את קצב טביעות אצבע של גבעול תודרנית WT (השוואה עם הפניות11,14).
csla9 תודרנית גזע אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) 6 ליין מציגה מראה טביעת האצבע בקצב של הגזע של תודרנית הצמח חסר העיקריות נובעות מנן סינתאז11. להשוות בין WT, שליטה שלילי טביעות אצבעות. בעוד רוב מנן נעדר במפעל הזה, נשארת כמות קטנה, כפי שמעידים עוצמות הלהקה מופחת עבור כל הנגזרות mannanase oligosaccharides זה הוא מסונתז על ידי מנן נוספים synthases (CSLA2, 3)11.
בקרה שלילית - אנזים בלבד ליין 8 מראה להקות על הג'ל שאינם ספציפיים שואבים מזהמים ב mannanase קוקטייל, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית - WT אוויר בלבד ליין 9 מציג את להקות הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית- csla9 אוויר בלבד ליין 10 מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
אורן עץ אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 7 מראה טביעות אצבע בקצב של עץ אורן, אשר מכיל את galactoglucomannan. בבירור יש דפוס שונים של oligosaccharides שפורסמו כדי תודרנית, בשל מבנהו שונה.
בקרה שלילית - אורן אוויר בלבד 11 ליין מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
לפרש ג'ל הקצב פשוט למדי, אך דורשת מודעות לנקודות הבאות. עבור נתונים, מומלץ לבצע את הקצב לפחות 3 באופן עצמאי גדל ביולוגי משכפל, מומלץ לבצע משכפל טכנית לפחות 2 על כל שכפול ביולוגי. הפקדים המתוארים הם קריטיים לפרשנויות, להקות לא ספציפית צריכה להילקח. אנו גם ממליצים טעינת דגימות השונה על שכפל ג'לים, כדי לא לכלול תופעות אשר הם תוצאה של תאורה לא אחידה על ידי transilluminator. לפירוש מדויק דורש ניתוח של להקות אשר לא רוויים. מאז יש טביעות אצבעות פחמימה # מיון הפחמימות עשוי להכיל שני סוכרים שפע מאוד גבוהות ונמוכות, אנו ממליצים ניתוח חשיפות מרובות של הג'ל אותו. הסטנדרטים יכול לשמש כדי לנרמל בין תמונות שונות.
עבור סוגים מסוימים של ניסויים, זה עשוי להיות רצוי לכמת את כמות רב-סוכר בהכנת אוויר. בזמן זה אפשרי לכמת מן הקצב ג'ל, זה דורש ידע את זהותו מולקולרית המדויק של כל פחמימה # מיון הפחמימות שפרסם את GHs, היכן הוא ממוקם על הקצב ג'ל. זה כרגע לא לגמרי ידוע מנן, אך נקבע עבור אחרים סוכרים למשל xylan3. הסטנדרטים מספקים דרך של נורמליזציה בין ג'ל, גם כאשר לא מתבצע כימות, ולכן יסייע לכל ניתוח איכותי או כמותי למחצה.
זיהוי המבנה של הפרט oligosaccharides יכולה להיות מושגת באמצעות קוקטיילים של שקריאה GHs. תוספת של עוד GHs עלול לחשוף פרטים אודות קישורים ותחליפי של oligosaccharides המשוחררים (למשל, תוספת של β - 1, 4 - glucosidase שפועל על קצה שאינם בהפחתת תחשוף אילו oligosaccharides בתערובת מכילים תכונה זו). אנזימים זמינים כוללים galactosidases, glucuronidases, glucosidases (ראה את מסד הנתונים CAZy16 לפרטים נוספים); ראה הוג, ד. et al. 17 כדוגמה.
ניתן להשתמש בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את הפעילות של GHs לא ידוע. במקרה זה, ביומסה מוגדר, כגון תודרנית glucomannan גזע או konjac, אמור לשמש למסך GHs13לא ידוע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
איור 1 : זה מראה את הערכה עבור derivatization הניאון של oligosaccharides עם נמלים. שונה מ- Goubet2.<a href="//ecsource.jov%20href="></a>המטרה e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"="_ blank"&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
איור 2 : ג'ל בקצב נציג מציג טביעת האצבע מנן תודרנית, אורן, מוטציה של תודרנית (csla9) אשר יש ליקויי ביוסינטזה מנן. AlR היה הידרוליזה עם קוקטייל mannanase, oligosaccharides שפורסמו היו derivatized עם fluorophore. Oligosaccharides היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה בג'ל על בסיס גודל, צורה של תשלום. סולם של manno-oligosaccharides (Man1-6) מוצג כדי לסייע בזיהוי mobilities היחסית של oligosaccharides פרסמה, הידרוליזה של מנן מטוהרים (נגזר konjac) מוצג פקד חיובי. * = להקות לא ספציפית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין פוליסכרידים בדופן תא הצמח. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של דופן תא הצמח כולל מבנה וכמות גלוקומנן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת הכשרה מיוחדת או ציוד יקר.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם פירוש הג'לים, ולכן הכללה והבנה של כל הבקרות המתוארות היא קריטית. האלכוהול והשאריות המסיסות, או AIR, מוכנים בעבר מחומר צמחי שנקטף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שקלו שישה מיליגרם של AIR לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר והוסיפו מים לריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.מערבולת להשגת מתלה אחיד. Aliquot 500 מיקרוגרם לתוך צינורות מיקרופוגה. יבש את הכמות באמצעות צנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.יש לטפל מראש ב-AIR כולל תוספת לבקרת AIR ללא אנזים עם נתרן הידרוקסיד מולארי אחד למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הוסף 200 מיקרוליטר מים ו -20 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת לכל צינור כדי לנטרל את הנתרן הידרוקסיד. בדוק שה-pH הוא בערך שש עד שבע על ידי הסרת מיקרוליטר אחד ואיתורו על רצועות מחוון ה-pH של הנייר.הוסף 50 מיקרוליטר של חוצץ אמוניום אצטט מולארי אחד pH 6.0, והוסף מים לנפח כולל של 500 מיקרוליטר לכל צינור. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף כמות קבועה מראש של מננות ל-AIR ולמאגר. כלול בקרות שליליות מתאימות כמו גם בקרה חיובית.מערבולת ואז סובב קצרות כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית הצינור. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למשך הלילה. למחרת, עצרו את התגובה על ידי דגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות. שמור את הסופרנטנט והשהה כל כדור ב-250 מיקרוליטר מים. שוב צנטריפוגה ולשמור על הסופרנטנט.שלבו את שני הסופרנטנטים וייבשו בצנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשלוש שעות. לפני הליך הנגזרת, הכן את הריאגנטים הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מחממים את תמיסת המלאי של 0.2 ANTS טוחנת ל-60 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את המוצק.לכל דגימה, הוסף חמישה מיקרוליטר של ANTS, חמישה מיקרוליטרים של שני פיקולין-בוראן ו-10 מיקרוליטר של מאגר נגזרות. סובב קצרות כדי לאסוף בתחתית הצינור, מערבול היטב ואז סובב שוב לזמן קצר. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור.למחרת יש לייבש את הדגימות בצנטריפוגת ואקום בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים. השעו מחדש כל דגימה בתקן אוליגוסכריד ו-100 מיקרוליטר של אוריאה שלוש טוחנת. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס מוגן מאור עד הצורך.הרכבת ציוד יציקת הג'ל תהיה תלויה במותג. עבור הציוד המשמש בהדגמה זו, ג'ל אחד שווה ל -50 מיליליטר. בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר מערבבים 20.2 מיליליטר מים, חמישה מיליליטר של מאגר PACE פי 10, 24.6 מיליליטר של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 200 מיקרוליטר APS ו-20 מיקרוליטר TEMED.הפוך בעדינות כדי לערבב תוך זהירות לא להכניס בועות אוויר. השתמש בפיפטה סרולוגית או אחרת בנפח גדול כדי לשפוך את הג'ל הממיס כארבעה סנטימטרים מתחת לחלק העליון של לוחות הזכוכית. מכסים בזהירות את הג'ל באלכוהול איזופרופיל.הניחו לג'ל להתפלמר במשך 20 עד 30 דקות. יוצקים את השכבה העליונה. יבש את כל הנוזלים העודפים בעזרת נייר סופג.לאחר מכן, הכינו את ג'ל הערימה. בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מערבבים 6.8 מיליליטר מים, מיליליטר אחד של מאגר PACE פי 10, 2.8 מיליליטר אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 80 מיקרוליטר APS ושמונה מיקרוליטר TEMED. הפוך לערבוב, ושכב על גבי ג'ל הרמוס הפולימרי.הכנס בעדינות את המסרק והימנע מלכידת בועות אוויר מתחת לשיני המסרק. לאחר שהג'ל התפלמר, עוטפים אותו ברקמה לחה ולאחר מכן בניילון נצמד, ושומרים בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי לסייע במעקב אחר סדר הטעינה ובזיהוי היכן נמצאות הבארות לאחר הסרת המסרק, השתמש בטוש קבוע כדי לסמן את מיקומי הבאר על הזכוכית.הסר את המסרק. מלאו את הבארות במאגר אחד X PACE. השתמש במיקרו-מזרק של 10 מיקרוליטר כדי להעמיס שני מיקרוליטר של תקנים ודגימות לבארות.הימנע משימוש בנתיבים החיצוניים ביותר הנוטים להריץ דגימות בצורה גרועה ולהשאיר נתיב ריק בין הדגימות. הרכיבו את החדר העליון של מנגנון הפעלת הג'ל והניחו את הג'ל במיכל ריצה מקורר המכיל מאגר 1-X PACE. מלאו את החדר העליון במאגר קצב אחד X.הפעל את הכוח והפעל את הג'ל ב -200 וולט למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הגדל את המתח ל -1, 000 וולט למשך שעה ו -40 דקות. הגן על הג'ל מפני אור.התחל בניגוב מערכת הדמיית הג'ל עם רקמה לחה נטולת מוך כדי להבטיח שהיא נקייה מאבק. הסר את הג'ל ממיכל ה-PACE וצפה בקצרה בזמן שהג'ל עדיין בלוחות הזכוכית כדי לקבוע אם חזית הצבע עדיין על הג'ל. השתמש בכלי טריז כדי לפתוח את הג'ל ובזמן שהג'ל עדיין על צלחת זכוכית אחת, השתמש בחותך פיצה כדי להסיר גם את ג'ל הערימה וגם את תחתית הג'ל אם חזית הצבע עדיין על הג'ל.הוצא כחמישה מיליליטר מים על פני השטח של הטרנס-מאייר ולאחר מכן העביר את הג'ל ישירות אל הטרנס-מאיר. באמצעות התוכנה, הגדר את המסנן ל-UV 605 והפעל את משדר ה-UV לגל ארוך. צלם מספר תמונות בזמני חשיפה שונים והקפד לכבות את אור ה-UV בין התמונות כדי למנוע פגיעה בקרינה.ודא שלפחות שתיים מהתמונות אינן כוללות פסים רוויים. שמור את הקבצים כתמונות TIFF ברזולוציה גבוהה. מוצג ג'ל מייצג של בדיקת PACE סטנדרטית של תכולת המנאן של דופן התא.נתיבים 1, 2 ו-3 מציגים סולם של אוליגוסכרידים שנרכשו מסחרית בריכוז של 5, 10 ו-50 פיקומולה בהתאמה. נתיב 4 מציג עיכול מננאז של גלוקומנאן קונג'אק המשמש כבקרה חיובית הן לעיכול האנזימטי והן לתגובת הנגזרת בנוכחות האנזים ומלחי החיץ. נתיב מספר 5 מציג את טביעת האצבע PACE של גזע Arabidopsis מסוג פראי.נתיב 6 מציג את טביעת האצבע PACE של הגבעול מצמח Arabidopsis חסר את סינתאז המנאן העיקרי של הגבעול. בהשוואה לסוג הפראי, קיימת רק כמות קטנה של מנאן כפי שמעידה עוצמת הפס המופחתת עבור כל האוליגוסכרידים שמקורם במננאז. נתיב 10 מציג את טביעת האצבע PACE של עץ אורן המכיל גלקטוגלוקומנאן ויש לו דפוס של אוליגוסכרידים משוחררים שונה בבירור מזה של Arabidopsis.נתיב 7, 8, 9 ו-11 הם בקרות שליליות שונות החושפות רצועות לא ספציפיות המסומנות בכוכביות שיש להוציא מהניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין ממש טוב כיצד לנתח את מבנה המנאן באמצעות PACE. לאחר השליטה, ניתן ליישם טכניקה זו על פוליסכרידים אחרים מעניינים באמצעות גליקוזיל הידרולזים שונים.הייתה לנו הצלחה ביישום טכניקה זו על מיני צמחים רבים אחרים בנוסף לארבידופסיס כמו גם על מינים אחרים שאינם צמחיים כגון מנאן שמרים.

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן והרכב של פחמימות קיר נגזר.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות המשמשות לאפיון מבני של רצפי גליקוזיל מפחיתים (RE) ואזור פנימי של הטרוקסילנים על ידי תיוג ה-RE עם 2 אמינובנזמיד לפני הידרוליזה אנזימטית (אנדוקסילאנאז) ולאחר מכן ניתוח של האוליגוסכרידים המתקבלים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

פרוטוקול להכנת 13ג,15דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.

אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.

שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

למדו אפיון מבני של פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות שיטת PACE. הפרוטוקול מאפשר ניתוח כמות ומבנה של גלוקומנן ללא ציוד יקר או הכשרה מיוחדת.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

גלה סרטונים נוספים