אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב
16 באוקטובר 2017
פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין פוליסכרידים בדופן תא הצמח. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של דופן תא הצמח כולל מבנה וכמות גלוקומנן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת הכשרה מיוחדת או ציוד יקר.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם פירוש הג'לים, ולכן הכללה והבנה של כל הבקרות המתוארות היא קריטית. האלכוהול והשאריות המסיסות, או AIR, מוכנים בעבר מחומר צמחי שנקטף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שקלו שישה מיליגרם של AIR לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר והוסיפו מים לריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.
מערבולת להשגת מתלה אחיד. Aliquot 500 מיקרוגרם לתוך צינורות מיקרופוגה. יבש את הכמות באמצעות צנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
יש לטפל מראש ב-AIR כולל תוספת לבקרת AIR ללא אנזים עם נתרן הידרוקסיד מולארי אחד למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הוסף 200 מיקרוליטר מים ו -20 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת לכל צינור כדי לנטרל את הנתרן הידרוקסיד. בדוק שה-pH הוא בערך שש עד שבע על ידי הסרת מיקרוליטר אחד ואיתורו על רצועות מחוון ה-pH של הנייר.
הוסף 50 מיקרוליטר של חוצץ אמוניום אצטט מולארי אחד pH 6.0, והוסף מים לנפח כולל של 500 מיקרוליטר לכל צינור. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף כמות קבועה מראש של מננות ל-AIR ולמאגר. כלול בקרות שליליות מתאימות כמו גם בקרה חיובית.
מערבולת ואז סובב קצרות כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית הצינור. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למשך הלילה. למחרת, עצרו את התגובה על ידי דגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות. שמור את הסופרנטנט והשהה כל כדור ב-250 מיקרוליטר מים. שוב צנטריפוגה ולשמור על הסופרנטנט.
שלבו את שני הסופרנטנטים וייבשו בצנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשלוש שעות. לפני הליך הנגזרת, הכן את הריאגנטים הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מחממים את תמיסת המלאי של 0.2 ANTS טוחנת ל-60 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את המוצק.
לכל דגימה, הוסף חמישה מיקרוליטר של ANTS, חמישה מיקרוליטרים של שני פיקולין-בוראן ו-10 מיקרוליטר של מאגר נגזרות. סובב קצרות כדי לאסוף בתחתית הצינור, מערבול היטב ואז סובב שוב לזמן קצר. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור.
למחרת יש לייבש את הדגימות בצנטריפוגת ואקום בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים. השעו מחדש כל דגימה בתקן אוליגוסכריד ו-100 מיקרוליטר של אוריאה שלוש טוחנת. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס מוגן מאור עד הצורך.
הרכבת ציוד יציקת הג'ל תהיה תלויה במותג. עבור הציוד המשמש בהדגמה זו, ג'ל אחד שווה ל -50 מיליליטר. בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר מערבבים 20.2 מיליליטר מים, חמישה מיליליטר של מאגר PACE פי 10, 24.6 מיליליטר של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 200 מיקרוליטר APS ו-20 מיקרוליטר TEMED.
הפוך בעדינות כדי לערבב תוך זהירות לא להכניס בועות אוויר. השתמש בפיפטה סרולוגית או אחרת בנפח גדול כדי לשפוך את הג'ל הממיס כארבעה סנטימטרים מתחת לחלק העליון של לוחות הזכוכית. מכסים בזהירות את הג'ל באלכוהול איזופרופיל.
הניחו לג'ל להתפלמר במשך 20 עד 30 דקות. יוצקים את השכבה העליונה. יבש את כל הנוזלים העודפים בעזרת נייר סופג.
לאחר מכן, הכינו את ג'ל הערימה. בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מערבבים 6.8 מיליליטר מים, מיליליטר אחד של מאגר PACE פי 10, 2.8 מיליליטר אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 80 מיקרוליטר APS ושמונה מיקרוליטר TEMED. הפוך לערבוב, ושכב על גבי ג'ל הרמוס הפולימרי.
הכנס בעדינות את המסרק והימנע מלכידת בועות אוויר מתחת לשיני המסרק. לאחר שהג'ל התפלמר, עוטפים אותו ברקמה לחה ולאחר מכן בניילון נצמד, ושומרים בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי לסייע במעקב אחר סדר הטעינה ובזיהוי היכן נמצאות הבארות לאחר הסרת המסרק, השתמש בטוש קבוע כדי לסמן את מיקומי הבאר על הזכוכית.
הסר את המסרק. מלאו את הבארות במאגר אחד X PACE. השתמש במיקרו-מזרק של 10 מיקרוליטר כדי להעמיס שני מיקרוליטר של תקנים ודגימות לבארות.
הימנע משימוש בנתיבים החיצוניים ביותר הנוטים להריץ דגימות בצורה גרועה ולהשאיר נתיב ריק בין הדגימות. הרכיבו את החדר העליון של מנגנון הפעלת הג'ל והניחו את הג'ל במיכל ריצה מקורר המכיל מאגר 1-X PACE. מלאו את החדר העליון במאגר קצב אחד X.
הפעל את הכוח והפעל את הג'ל ב -200 וולט למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הגדל את המתח ל -1, 000 וולט למשך שעה ו -40 דקות. הגן על הג'ל מפני אור.
התחל בניגוב מערכת הדמיית הג'ל עם רקמה לחה נטולת מוך כדי להבטיח שהיא נקייה מאבק. הסר את הג'ל ממיכל ה-PACE וצפה בקצרה בזמן שהג'ל עדיין בלוחות הזכוכית כדי לקבוע אם חזית הצבע עדיין על הג'ל. השתמש בכלי טריז כדי לפתוח את הג'ל ובזמן שהג'ל עדיין על צלחת זכוכית אחת, השתמש בחותך פיצה כדי להסיר גם את ג'ל הערימה וגם את תחתית הג'ל אם חזית הצבע עדיין על הג'ל.
הוצא כחמישה מיליליטר מים על פני השטח של הטרנס-מאייר ולאחר מכן העביר את הג'ל ישירות אל הטרנס-מאיר. באמצעות התוכנה, הגדר את המסנן ל-UV 605 והפעל את משדר ה-UV לגל ארוך. צלם מספר תמונות בזמני חשיפה שונים והקפד לכבות את אור ה-UV בין התמונות כדי למנוע פגיעה בקרינה.
ודא שלפחות שתיים מהתמונות אינן כוללות פסים רוויים. שמור את הקבצים כתמונות TIFF ברזולוציה גבוהה. מוצג ג'ל מייצג של בדיקת PACE סטנדרטית של תכולת המנאן של דופן התא.
נתיבים 1, 2 ו-3 מציגים סולם של אוליגוסכרידים שנרכשו מסחרית בריכוז של 5, 10 ו-50 פיקומולה בהתאמה. נתיב 4 מציג עיכול מננאז של גלוקומנאן קונג'אק המשמש כבקרה חיובית הן לעיכול האנזימטי והן לתגובת הנגזרת בנוכחות האנזים ומלחי החיץ. נתיב מספר 5 מציג את טביעת האצבע PACE של גזע Arabidopsis מסוג פראי.
נתיב 6 מציג את טביעת האצבע PACE של הגבעול מצמח Arabidopsis חסר את סינתאז המנאן העיקרי של הגבעול. בהשוואה לסוג הפראי, קיימת רק כמות קטנה של מנאן כפי שמעידה עוצמת הפס המופחתת עבור כל האוליגוסכרידים שמקורם במננאז. נתיב 10 מציג את טביעת האצבע PACE של עץ אורן המכיל גלקטוגלוקומנאן ויש לו דפוס של אוליגוסכרידים משוחררים שונה בבירור מזה של Arabidopsis.
נתיב 7, 8, 9 ו-11 הם בקרות שליליות שונות החושפות רצועות לא ספציפיות המסומנות בכוכביות שיש להוציא מהניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין ממש טוב כיצד לנתח את מבנה המנאן באמצעות PACE. לאחר השליטה, ניתן ליישם טכניקה זו על פוליסכרידים אחרים מעניינים באמצעות גליקוזיל הידרולזים שונים.
הייתה לנו הצלחה ביישום טכניקה זו על מיני צמחים רבים אחרים בנוסף לארבידופסיס כמו גם על מינים אחרים שאינם צמחיים כגון מנאן שמרים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניתוח מבני של פוליסכרידים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל (PACE), תוך התמקדות במנאן. השיטה שואפת להעמיק את ההבנה של פוליסכרידים של דופן התא הצמחי ומאפייניהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- ניתוח פוליסכרידים
- טכניקות שלאלקטרופורזה של ג'ל
רקע
- דפנות התאים של צמחים מורכבות מפוליסכרידים שונים.
- הבנת מבנה הפוליסכרידים היא קריטית עבור הביולוגיה של צמחים.
- גלוקומנן הוא מרכיב משמעותי בדפנות התאים של צמחים.
- שיטות מסורתיות עשויות לדרוש הכשרה וציוד ייעודיים.
מטרת המחקר
- לאפיין את המבנה והכמות של פוליסכרידים בדופן התא הצמחי.
- לספק שיטה פשוטה לחוקרים לניתוח פוליסכרידים.
- להקל על חקר הגלוקומנאן בביולוגיה של צמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת משק שאינו ממיס באלכוהול (AIR) מחומר צמחי.
- נגזרתיזציה של דגימות באמצעות ANTS עבור אלקטרופורזה של ג'ל.
- הכנת ג'ל והרצה באמצעות מתודולוגיית PACE.
- לכידת תמונה וניתוח של תוצאות הג'ל.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של תכולת המנאן בדגימות צמחים.
- הדגמה של יעילות שיטת ה-PACE.
- מתן פרוטוקול ברור לחוקרים שאינם מנוסים בניתוח פוליסכרידים.
- ייצוג ויזואלי של התוצאות באמצעות דימיון ג'ל.
מסקנות
- שיטת ה-PACE היא נגישה ואפקטיבית לניתוח פוליסכרידים.
- הבנת מבנה הפוליסכרידים יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של הצמחים.
- הכללת ביקורות היא קריטית לפרשנות מדויקת של התוצאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
אפיון מבני של פוליסכרידים של דופן תאי צמחים, כגון מנאן, תומך בתיקוף מטרות בפיתוח חומרים ביו-בסיסיים ובכימיקלים חקלאיים על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטיים באינטראקציות בין אנזים לסובסטרט. שיטת PACE מספקת גישה שמישה וניתנת לשחזור ליצירת טביעות אצבע כמותיות של אוליגוסכרידים, מה שמקל על פיתוח בדיקות וזיהוי מובילים בתהליכי הנדסת אנזימים. ההסתמכות שלה על גליקוזיל הידרולזות מוגדרות וגילוי פלואורסצנטי מאפשרת שימוש רב-תחומי וניתן להרחבה בזרימות עבודה של גילוי מוקדם, שבהן נדרש ביטחון חזוי בשינוי הפוליסכרידים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ספציפיות ופעילות של גליקוזיל הידרולאז על סובסטראטים מוגדרים של פוליסכרידים, ובכך תומך בתיקוף מטרה באמצעות קריאות מבניות ישירות.
- ערך תפעולי: מפחית את התלות בציוד ייעודי ובהכשרה מומחית, ובכך מוריד את החסמים הטכניים לסריקה של ספריות אנזימים בתושבה גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פרופילי אוליגוסכריד הניתנים להפרדה המבחינים בין דפוסי קישור ופיצול, ובכך מאפשר השוואה כמותית של וריאנטים של אנזימים.
- ערך תפעולי: משתמש באלקטרופורזה של ג'ל ובסימון פלואורסצנטי סטנדרטיים, דבר המאפשר שילוב במערכות אנליטיות קיימות במינימום תיקוף מחדש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך ברצף מהגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת שיטות ניתנות להעברה לניתוח מודיפיקציות של פוליסכרידים במערכות הרלוונטיות למחלה, כגון אינטראקציות בין צמחים לפתוגנים או מודלים של ביופילם.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור בין מעבדות באמצעות בקרות סטנדרטיות וטביעות אצבע שחזירות, ובכך תומך בהעברת טכנולוגיה ובפרויקטים שיתופיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת ה-PACE משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה של מוביל (lead optimization), ובמיוחד בזרימות עבודה הדורשות תיקוף פונקציונלי של אנזימים הפועלים על פחמימות או ויסות של ביוסינתזה של פוליסכרידים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על תפקוד אנזימים על ידי הפרדה של פרופילי מוצרים מהידרוליזה של פוליסכרידים, ובכך מבהירה את מנגנון הפעולה.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וסטנדרטיים באמצעות הפרדת אוליגוסכרידים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר התקדמות משלב ה-hit-to-lead במערכי הנדסה של אנזימים.
- אנליטיקה: מספקת משתנים תלויים מדידים (נדיות ועוצמה של אוליגוסכרידים) המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים וחזרות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אפיון אנזימים לתוצאות פנוטיפיות במערכות שבהן למבנה הפוליסכריד יש השפעה על ארגוניות, חסינות או תכונות חומרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה אנליטית ניתנת לשימוש חוזר, הישמה על כל פוליסכריד עם הידרולזים מאופיינים, ובכך ממקסמת את ההשקעה בריאגנטים ובפרוטוקולים לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בסגוליות האנזים ומפחית תוצאות חיוביות שגויות באמצעות אימות מבני ישיר של תוצרי ההידרוליזה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות בקרות פנימיות (ללא אנזים, חיובית, שלילית) וכמותיות מבוססות ג'ל הניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) של אנזימים על ידי קישור הפעילות הביוכימית לתוצאות מבניות מוגדרות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים לאנזימים מותאם סיכונים, בהתבסס על פרופילים כמותיים של מודיפיקציות פוליסכריד.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביוכימיה של פחמימות ובהידרוליזה אנזימטית כדי לבחור גליקוזיל הידרולזות מתאימות ולפרש תבניות של אוליגוסכרידים.
- תלוי בגישה לציוד אלקטרופורזה של ג'ל המסוגל להפריד אוליגוסכרידים קטנים ובמערכת דימוי פלואורסצנטית התואמת לסימון ANTS.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת AIR, יחידות אנזימים ותנאי דגירה בין משתמשים שונים כדי להבטיח השוואתיות בין מעבדות.
- התאמה לפוליסכרידים חדשים מחייבת תיקוף של ספציפיות ההידרולזה ואופטימיזציה של שלבי ההידרוליזה והנגזרת.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה יותר בהשוואה לשיטות המבוססות על HPLC או MS, והסתמכות על ניתוח תמונות ג'ל לצורך כימות.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Aliquoting and Pre-treatment of Alcohol Insoluble Residue (AIR)
2:11
Hydrolysis of AIR with Glycosyl Hydrolases
3:20
Derivitization of Oligosaccharides
4:29
Preparation of PACE Gels
6:33
Running a PACE Gel
7:51
Visualizing a PACE Gel
9:07
Results: Characterization of Plant Cell Wall Glucomannam Structure
10:30
Conclusion
