שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות עקה שכפול בתאים סרטניים

נתחיל עם תאים סרטניים הנושאים IdU, תחליף סינתטי של נוקלאוטיד תימידין, שכבר משולב ב-DNA שלהם. כאשר תאים אלה נתקלים במתח שכפול, סינתזת ה-DNA שלהם נעצרת, וחושפת IdU בתוך אזורי DNA חד-גדיליים חשופים.

תקן את התאים והוסף מולקולות דטרגנט כדי להפוך את קרום התא לחדיר.

הוסף BSA כדי לחסום אתרי קשירת נוגדנים שאינם מטרה.

הציגו נוגדנים נגד IdU המקיימים אינטראקציה עם DNA חד-גדילי המסומן ב-IdU.

הוסף נוגדנים משניים ירוקים המסומנים בפלואורופור המכוונים לנוגדנים נגד IdU. הסר את הנוגדנים הלא קשורים.

הנח את הכיסוי על שקופית המכילה אמצעי הרכבה עם צבע פלואורסצנטי - שמכתים את הגרעינים.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בגרעינים הכחולים.

מוקדי הקרינה הירוקים מייצגים נוגדנים הנקשרים ל-DNA החד-גדילי.

ספור את מספר המוקדים כדי לכמת את רמת מתח השכפול.

הוסף 1 מיליליטר של תרחיף תאים על כיסויי פולי-L-ליזין המונחים בבארות של צלחת של 24 בארות, וגדל את התאים במדיום התרבות בתנאים סטנדרטיים. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, שאפו את המדיה הקיימת מהצלחת ודופקו את התאים עם 10 IdU מיקרו-מולרי עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות.

כדי לקצור את התאים, החלף את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח על קרח למשך 5 דקות. לקיבוע תאים יש לשאוב PBSTx ולדגור על התאים למשך 15 דקות עם 3% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר. לאחר 3 עד 4 כביסות עם PBS, שמור על תאים קבועים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך 5 דקות, תוך הקפדה על כיסוי כל הכיסוי. לאחר שטיפת התאים 3 עד 4 פעמים עם 1 מיליליטר של 0.2% PBST בטמפרטורת החדר, שאפו את ה-PBST וחסמו את הדגימות, באמצעות 5% BSA המיוצר ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לצורך צביעה חיסונית, הכינו תא לח על ידי הנחת מגבת נייר רטובה על טאפרוור עם תחתית שטוחה. מכסים את מכסה הצלחת עם 24 בארות בפרפילם. הנח אותו בתא הלח והניח את הכיסויים על מכסה הצלחת. הוסף 60 מיקרוליטר של נוגדן עכבר ראשוני מדולל נגד BrdU, בחלק העליון של הכיסוי.

לחלופין, כדי להפחית את התייבשות הנוגדן ולהשתמש בפחות נפח, הנח טיפה של נוגדן מדולל על הפרפילם והפוך עליו את הכיסוי. לאחר מכן, דגרו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשאוב את הנוגדן הראשוני.

החזר את הכיסויים בחזרה לצלחת של 24 בארות ושטוף אותם עם 0.2% PBST 4 פעמים. הוסיפו נוגדן משני מדולל על הכיסוי, כפי שהודגם קודם לכן, ודגרו במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר. סמן שקופית מיקרוסקופ, והרכיב את הכיסוי על השקופיות עם מדיום הרכבה DAPI. אחסן מגלשות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות אם יש צורך לרפא או להקשיח את אמצעי ההרכבה.