השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

המטרה הכוללת של הדגמה זו היא להשוות בין שלוש בדיקות שונות של שגשוג תאים ולהציג את היתרונות והחסרונות של כל שיטה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון בחירת שיטת מדידת שגשוג התאים המתאימה ביותר. ההכנה לשיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ההדמיה התאית הם קשים ללמידה.

הם דורשים ממך להתמקד בתאים לפני החלת מסכת ספירת התאים המתאימה. כדי להתחיל בהליך זה, גדל שני קווי תאי MCF-7 למשך שלושה ימים עד להגעה ל-75 עד 80% confluence בבקבוקי תרבית רקמה T75 square centimeter תוך שימוש ב-DMEM ללא phenol red. לאחר שלושה ימים, הסר את התאים מהבקבוקים על ידי שפיכת המצע למכל פסולת.

לאחר מכן, שטפו מיד את שכבת התאים בשני מיליליטר של trypsin בריכוז פי 2 שחומם מראש. שאבו את ה-trypsin, והוסיפו שני מיליליטר נוספים של trypsin שחומם מראש לשכבת התאים לפני הנחתה באינקובטור. לאחר שהתאים ניתקו, שטפו אותם ב-10 מיליליטר של DMEM טרי מועשר שחומם.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים למבחנה סטרילית של 15 milliliter וסובבו אותו בצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) והשליכו אותה. לאחר מכן, השעיו מחדש את משקע התאים בחמישה milliliters של DMEM טרי עם תוספות.

לביצוע ספירת תאים, לדלל 100 µL של תגלי התאים ב-900 µL של DPBS בריכוז פי אחת. לאחר מכן, הנח חיישן חד של 60 µm על סופר התאים האוטומטי. לחץ על הבוכנה והטבל את החיישן לתגלי התאים המדולל.

שחרר באיטיות את הבוכנה של סופר התאים. לאחר מכן, הסר את החיישן מסופר התאים עם סיום הפעולה. זרע את התאים בנפח סופי של 100 microliters בלוחית 96-בארים בשיעור של כ-20% confluency כדי לאפשר מקום לצמיחת תאים ולמדידת התרבות לאורך שלושה עד חמישה ימים.

כדי לקבוע את מספר התאים באמצעות המוציטומטר, חממו מראש הן את המצע והן את ה-trypsin ל-37 °C באינקובטור לתרביות תאים, בתנור או במקלחית. לאחר מכן, שאבו את המצע מהתאים אל מכל פסולת. לאחר מכן, שטפו אותם פעם אחת עם 30 µL של trypsin בריכוז פי 2 ושאבו את המצע שוב אל מכל הפסולת.

בשלב הבא, שטפו שוב את התאים עם 30 µL של trypsin בריכוז פי 2, ודגרו אותם למשך חמש דקות ב-37 °C. הקישו בעדינות על דופן הפלטה כדי לשחרר את התאים. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של DMEM מועשר וערבבו את התאים באמצעות פיפטה עד להיווצרות סספנזיה של תאים בודדים.

הנח את כיסוי הזכוכית מעל תאי הספירה והצמד אותו עד להופעת טבעות השבירה של ניוטון בין קצוות כיסוי הזכוכית להליוציטומטר. לאחר מכן, טפטף בעדינות 20 µL מתליות התאים תחת כיסוי הזכוכית ואפשר לתאי הספירה להתמלא באמצעות פעולת נימיות. לאחר מכן, הדמיין את תאי הספירה בפריסת הרשת תחת הגדלה של 10x.

בפרוצדורה זו, הפשיקו את ריאגנט הלומינסנציה באמבט מים של 22 degrees Celsius למשך 30 דקות. הפכו את הבקבוק בעדינות כדי לקבל תערובת הומוגנית. לאחר מכן, השאיגו שיווי משקל עבור פלטה אחת של תאים שנזרעו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של ריאגנט לומניסנציה לכל באר. ערבבו את התוכן במנער אורביטלי למשך שתי דקות. לאחר מכן, הדרימו את הפלטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להגדיר ניסוי לומינצנציה באמצעות התוכנה של קורא הלוחיות רב-השימושים, הדליקו את קורא הלוחיות רב-השימושים ופתחו את התוכנה. במנהל המשימות (Task Manager), בחרו ב-Experiments ולאחר מכן ב-Create New. לאחר מכן, בחרו ב-File מסרגל הכלים הצדדי, ותחת לשונית Protocol, בחרו ב-Procedure.

בשלב הבא, בחרו Greiner 96 flat bottom כסוג הפלטה, וסמנו את תיבת Use Lid. בחרו בפעולת Read תחת תיבת Read method. לאחר מכן, בחרו Luminescence כשיטת הגילוי ולחצו על OK. בתיבת Read Step, בחרו את הבארות לסריקה תחת לשונית Full Plate, ובחרו את הבארות שישמשו כבארות בלנק (blank wells).

הגדירו את סט המסננים (Filter Set) ל-"Empty Filter". הגדירו את ההגבר (Gain) ל-135, עם זמן אינטגרציה של 5 שניות לבאר וגובה קריאה של 6.5 millimeters. לחצו על OK כדי לשמור את ההגדרות עבור קריאת הלומנצנציה.

כדי לבצע קריאת לומניסנציה, הוצא את תפסית הפלטות על ידי בחירה בלשונית Instrument Control ולחיצה על Plate Out. הנח את פלטת ה-96 בארות על תפסית הפלטות, וודא שהמכסה סגור. סגור את תפסית הפלטות על ידי לחיצה על Plate In תחת לשונית Instrument Control.

לאחר מכן, לחצו על Read Now בסרגל הכלים כדי לבצע קריאה לומניסצנטית. לאחר מכן, ייצאו את מדידות ה-RLU עבור כל באער לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. כדי להגדיר ניסוי של דימוי תאים, הפעילו את מדמיי התאים הרב-מצבי (multi-mode cell imager) ופתחו את התוכנה.

במנהל המשימות (Task Manager), בחרו בלשונית Experiments ובאפשרות Create New. בסרגל הכלים של הקובץ (File toolbar), לחצו על לשונית Protocol ולאחר מכן על לשונית Procedure. בחרו בפעולת Set Temperature.

הפעל את האינקובטור והגדר את הטמפרטורה ל-37 degrees Celsius. סמן את Preheat, ולאחר מכן לחץ על OK כדי לשמור את ההגדרות. כעת, בחר בפעולת Read.

לחצו על Image כשיטת הגילוי. לאחר מכן, בחרו את סוג הקריאה Endpoint/Kinetic ואת סוג האופטיקה Filters, ולחצו על OK. לאחר מכן, לחצו על לשונית Full Plate ובחרו את הבארים בלוח שיוצגו בתמונה. לחצו על OK כדי לשמור את ההגדרות.

כעת, בחרו בעדשה פי 2.5 מתוך תפריט הבחירה הנפתח של העדשות (Objectives). תחת לשונית הערוצים (Channels), בחרו ב-GFP 469.525 ובשדה בהיר (Bright Field). סמנו "חשיפה אוטומטית" (Auto Exposure) עבור שני הערוצים, ובחרו את הבאר לחשיפה אוטומטית.

כדי לקבוע את הגדרות המיקוד האוטומטי, לחצו על Options. באפשרויות המיקוד האוטומטי, בחרו בשיטה Scan ולאחר מכן auto focus. לחצו על OK כדי לשמור את ההגדרות.

לאחר מכן, הגדירו את ההיסט (offset) האופקי והאנכי ממרכז הבאר לאפס. בחרו בסריקה של מספר תמונות לכל באר במונטאז' של שלושה על שניים. לאחר מכן, לחצו על OK כדי לשמור את הגדרות הפרוצדורה.

כדי לקרוא את הניסוי בלוחית הנבחרת, לחצו על לשונית Instrument Control ובחרו בפונקציית Plate Out. הניחו לוחית 96-בארים על תומך הלוחיות, וודאו שהמכסה סגור. תחת לשונית Instrument Control, בחרו בפונקציית Plate In.

בשלב הבא, בחרו ב-Read Now בלשונית ה-plate, וחזרו על הקריאה מדי 24 שעות, עד ל-96 שעות לאחר הזריעה. כדי לנתח תמונה, לחצו על לשונית ה-Data בלוחית שצולמה ובחרו ב-Picture GFP 469, 525 plus Bright Field. לאחר מכן, לחצו פעמיים על הבאר שצולמה.

כעת, לחצו על תמונה טעונה. בחרו ב-Analyze, ולאחר מכן בחרו בתמונה בודדת מתוך המונטאז' שברצונכם לנתח. לאחר מכן, לחצו על OK. לאחר מכן, סמנו את ערוץ ה-GFP בלבד, והגדירו את הפרמטרים כפי שפורטו בטבלה 3.

לאחר מכן, לחצו על Start כדי להחיל את הפרמטרים על התאים שצולמו. עקבו אחר מסכת ספירת התאים המונחת על התאים שצולמו, המשמשת לקביעת מספר התאים לכל תמונה. לחצו על Apply Changes, ושמרו על הגדרות אלו עבור כל פלטה שצולמה במהלך הניסוי.

באיור זה, בוצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי להשוות את קשרי המתאם בין השיטות השונות שנבדקו למדידת השגחה תאית בתאי MCF-7-LeGO ובתאי MCF-7-delta 40p53. חושב מקדם מתאם של פירסון, והמובהקות נקבעה בין השיטות השונות למדידת השגחה תאית. המתאם החזק ביותר נצפה בהשוואה בין הבדיקה המבוססת על לומנסינציה לבין מדממת התאים.

מוצגות כאן תמונות מייצגות של תאי סרטן שד MCF-7-LeGO ו-MCF-7-delta 40p53 חיוביים ל-GFP, שצולמו באמצעות מדמיי תאים (cell imager) מדי 24 שעות עד שהתאים הגיעו לכמעט 100% confluence. שיטה זו מספקת מידע תאי שימושי, כולל יכולת לניטור ויזואלי של צמיחת התאים לאורך מספר ימים, והשוואה של גודל התאים ומורפולוגיית התאים בין קווי תאים שונים. סיכום של היתרונות והחסרונות של כל אחת מהשיטות שנבדקו מוצג כאן, אשר מדגים את הרב-גוניות של כל אחת מהשיטות ויסייע לקוראים בבחירת השיטה המתאימה ביותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של שלושה סוגים שונים של בדיקות שגשוג תאים, ותוכלו לקבוע איזו מהן מתאימה ביותר לתכנון הניסויי שלכם.