השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

המטרה הכוללת של הדגמה זו היא להשוות בין שלוש בדיקות שונות של התפשטות תאים ולהציג את היתרונות והחסרונות של כל שיטה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון שימוש בשיטת התפשטות התאים המתאימה ביותר. הכנת שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הדמיית התא.

הם דורשים ממך להתמקד בתאים לפני החלת מסכת ספירת התאים המתאימה. כדי להתחיל בהליך זה, גדל שני קווי תאים MCF-7 למשך שלושה ימים למפגש של 75 עד 80% בצלוחיות תרבית רקמה T75 סנטימטר רבוע באמצעות DMEM נטול פנול אדום. לאחר שלושה ימים, הסר את התאים מהצלוחיות על ידי שפיכת המדיום למיכל פסולת.

לאחר מכן, שטפו מיד את שכבת התא עם שני מיליליטר טריפסין שחומם מראש פעמיים. שאפו את הטריפסין, והוסיפו עוד שני מיליליטר של טריפסין שחומם מראש לשכבת התא לפני הכנסתו לאינקובטור. לאחר שהתאים התנתקו, שטפו אותם עם 10 מיליליטר של תוסף DMEM טרי מחומם.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של תוסף DMEM טרי.

כדי לבצע ספירת תאים, יש לדלל 100 מיקרוליטר של תרחיף התא ב-900 מיקרוליטר של פעם אחת DPBS. לאחר מכן, הנח חיישן חדש של 60 מיקרומטר על מונה התאים האוטומטי. החזק את הבוכנה לחוץ וטבל את החיישן במתלה התא המדולל.

שחרר לאט את הבוכנה על דלפק התאים. לאחר מכן, הסר את החיישן ממונה התאים בסיום. זרע את התאים בנפח סופי של 100 מיקרוליטר בצלחת של 96 בארות בכ-20% מפגש כדי לאפשר מקום לצמיחת תאים ולמדידת התפשטות במשך שלושה עד חמישה ימים.

כדי לקבוע את ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, יש לחמם מראש את המדיום ואת הטריפסין ל-37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים, בתנור או באמבט מים. לאחר מכן, שאפו את המדיום מהתאים למיכל פסולת. לאחר מכן, שטפו אותם פעם אחת עם 30 מיקרוליטר של פעמיים טריפסין ושאבו את המדיום שוב למיכל הפסולת.

לאחר מכן, שטפו את התאים שוב עם 30 מיקרוליטר של פעמיים טריפסין, ודגרו אותם במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הקש בעדינות על קצה הצלחת כדי לעקור את התאים. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של DMEM בתוספת וערבב את התאים על ידי פיפטינג עד שנוצר תרחיף תא בודד.

הנח את החלקת מכסה הזכוכית מעל תאי הספירה והצמד אותה עד שטבעות השבירה של ניוטון נראות בין קצוות החלקת הכיסוי להלוציטומטר. לאחר מכן, פיפטה בעדינות 20 מיקרוליטר של תא השינה מתחת להחלקת הכיסוי ואפשר למלא את תא הספירה בתנועה נימית. לאחר מכן, דמיין את תאי הספירה בפריסת הרשת בהגדלה של פי 10.

בהליך זה, יש להפשיר את מגיב הזוהר באמבט מים של 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הפוך בעדינות את הבקבוק לקבלת תערובת הומוגנית. לאחר מכן, יש לאזן צלחת אחת של תאים זרעים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זוהר לכל באר. מערבבים את התכולה על שייקר אורביטלי למשך שתי דקות. לאחר מכן, הניחו לצלחת לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להגדיר ניסוי זוהר באמצעות תוכנת קורא הלוחות הרב-מצבית, הפעל את קורא הלוחות הרב-מצבי ופתח את התוכנה. במנהל המשימות, בחר ניסויים וצור חדש. לאחר מכן, בחר קובץ מסרגל הכלים הצדדי, ותחת הכרטיסייה פרוטוקול, בחר פרוצדורה.

לאחר מכן, בחר תחתית שטוחה של Greiner 96 כסוג הצלחת, וסמן את התיבה השתמש במכסה. בחר את הפעולה קריאה תחת התיבה שיטת קריאה. לאחר מכן, בחר זוהר כשיטת הזיהוי ולחץ OK.In התיבה שלב קריאה, בחר את הבארות לסריקה תחת הכרטיסייה צלחת מלאה ובחר בארות שישמשו כבארות ריקות.

הגדר את ערכת המסנן למסנן ריק. הגדר את ההגבר ל-135, עם זמן אינטגרציה של 5 שניות לבאר וגובה קריאה של 6.5 מילימטרים. לחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות לקריאת הזוהר.

כדי לבצע קריאת זוהר, הוצא את מחזיק הלוחית על-ידי בחירה בכרטיסייה בקרת מכשיר ולחץ על לוחית החוצה. הנח את צלחת 96 הבארות על מחזיק הצלחת, וודא שהמכסה דולק. סגור את מחזיק הצלחת על ידי לחיצה על לוחית פנימה מתחת לכרטיסייה בקרת מכשיר.

לאחר מכן, לחץ על קרא עכשיו בסרגל הכלים כדי לבצע קריאה זוהרת. לאחר מכן, ייצא את מדידות ה-RLU עבור כל באר לגיליון אלקטרוני להמשך ניתוח. כדי להגדיר ניסוי הדמיית תאים, הפעל את הדמיית התאים הרב-מצבית ופתח את התוכנה.

במנהל המשימות, בחר את הכרטיסיה ניסויים וצור חדש. בסרגל הכלים קובץ, לחץ על הכרטיסיה פרוטוקול ולאחר מכן על הכרטיסיה פרוצדורה. בחר את הפעולה הגדר טמפרטורה.

הגדר את החממה למצב מופעל, והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. סמן את Preheat ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות. לאחר מכן, בחר את הפעולה קריאה.

לחץ על תמונה כשיטת הזיהוי. לאחר מכן, בחר את סוג הקריאה Endpoint/Kinetic ואת סוג האופטיקה Filters ולחץ על OK. לאחר מכן, לחץ על צלחת מלאה הכרטיסייה ובחר את הבארות בצלחת שיש לצלם. לחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות.

כעת, בחר את המטרה פי 2.5 מהאפשרות הנפתחת יעדים. תחת הכרטיסייה ערוצים, בחר GFP 469.525 ושדה בהיר. בדוק את החשיפה האוטומטית עבור שני הערוצים ובחר את מאגר החשיפה האוטומטית.

לקביעת הגדרות המיקוד האוטומטי, לחצו על 'אפשרויות'. עבור אפשרויות המיקוד האוטומטי, בחר את השיטה סריקה ולאחר מכן פוקוס אוטומטי. לחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות.

לאחר מכן, הגדר את הקיזוז האופקי והאנכי ממרכז הבאר לאפס. בחר לסרוק תמונות מרובות לכל באר במונטאז' של שלוש על שתיים. לאחר מכן, לחץ על אישור כדי לשמור את הגדרות ההליך.

כדי לקרוא את הניסוי על הצלחת שנבחרה, לחץ על הכרטיסייה בקרת מכשיר ובחר בפונקציית Plate Out. הנח צלחת של 96 בארות על מחזיק הצלחת, וודא שהמכסה דולק. תחת הכרטיסייה בקרת מכשירים, בחר בפונקציית צלחת פנימה.

לאחר מכן, בחר קרא עכשיו מלשונית הצלחת, וחזור על הקריאה כל 24 שעות, עד 96 שעות לאחר הזריעה. כדי לנתח תמונה, לחץ על הכרטיסייה נתונים בלוח התמונה ובחר תמונה GFP 469, 525 פלוס שדה בהיר. לאחר מכן, לחץ פעמיים על באר התמונה.

כעת, לחץ על תמונה שנטענה. בחר נתח ולאחר מכן בחר את התמונה היחידה של המונטאז' לניתוח. לאחר מכן, לחץ על אישור. לאחר מכן, בדוק את ערוץ ה-GFP בלבד, והגדר את הפרמטרים כמתואר בטבלה 3.

לאחר מכן, לחץ על התחל כדי להחיל את הפרמטרים על התאים המצולמים. שים לב למסיכת ספירת התאים המונחת על התאים המצולמים, המשמשת לקביעת ספירת התאים לתמונה. לחץ על Apply Changes, ושמור על הגדרות אלה עבור כל לוח שצולם במהלך הניסוי.

באיור זה בוצע ניתוח רגרסיה ליניארית להשוואת קשרי המתאם בין השיטות השונות שנבדקו למדידת התפשטות התאים בתאי MCF-7-LeGO ובתאי MCF-7-delta 40p53. מקדם המתאם של פירסון חושב, והמובהקות נקבעה בין השיטות השונות למדידת התפשטות התאים. המתאם החזק ביותר נצפה בין ההשוואה בין הבדיקה המבוססת על זוהר לבין הדמיית התא.

מוצגות כאן התמונות המייצגות של תאי סרטן שד חיוביים ל-GFP MCF-7-LeGO ו-MCF-7-delta 40p53 שנלכדו באמצעות הדמיית התאים כל 24 שעות עד שהתאים מגיעים לקרוב ל-100% מפגש. שיטה זו מספקת מידע סלולרי שימושי, כולל היכולת לנטר חזותית את צמיחת התאים לאורך מספר ימים, ולהשוות את גודל התא ומורפולוגיה של התאים בין קווי תאים שונים. כאן מוצג סיכום היתרונות והחסרונות של כל שיטה שנבדקה, המדגים את הרבגוניות של כל אחת מהשיטות ויסייע לקוראים בבחירת השיטה המתאימה ביותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה של שלוש בדיקות שונות של התפשטות תאים, ואמור להיות מסוגל לקבוע איזו מהן מתאימה ביותר לתכנון הניסוי שלך.